Toxicología 2022-2

GUION I modificado para la práctica presencial 2022-2

IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TÓXICOS NO VOLÁTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVOS ACADÉMICOS
• Emplear una extracción básica para separar dos tóxicos no volátiles en una muestra problema.
• Utilizar cromatografía en capa fina para la identificación de un tóxico no volátil en una muestra
problema.
• Cuantificar un tóxico no volátil en una muestra problema.

PROBLEMA
• Separar e identificar escopolamina y ácido barbitúrico de una muestra problema; cuantificar el
ácido barbitúrico presente.

REACTIVOS
Hidróxido de amonio (NH4OH) Ácido acético (AcOH) 2 M
Metanol (MeOH) Ácido clorhídrico (HCl) concentrado
Ácido acético glacial (AcOH) Sulfato de sodio (Na2SO4) anhidro
Reactivo de Dragendorff Escopolamina
Diclorometano (CH2Cl2) Ácido barbitúrico
Nitrito de sodio (NaNO2)sat

EQUIPO
Rotaevaporador Espectrofotómetro
Lámpara de luz UV Bomba de aspersión

MATERIAL POR PERSONA

Embudo de separación de 250 mL (1) Anillo metálico (1)
Embudo de cola corta (1) Tubo de ensaye (2)
Matraz Erlenmeyer de 125 mL (2) Anillo de corcho (2)
Matraz de bola de 50 mL (1) Pipeta Pasteur con bulbo (2)
Vaso de precipitados de 100 mL (2) Matraz volumétrico de 10 mL (1)
Vidrio de reloj de 9 cm (1) Micropipeta de 100-1000 μL (1)
Agitador de vidrio (1) Puntas desechables azules para micropipeta
Probeta de 10 mL (1) (100-1000 µL) (2)

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Extracción básica
1. A 10 mL de la muestra problema se agrega gota a gota una solución de NaOH al 10% hasta
llegar a un pH 10. La solución básica se trasvasa a un embudo de separación y se extrae con 2
porciones de 10 mL de CH2Cl2; se separan las fases orgánicas y se reúnen en un matraz. Colectar
la fase orgánica y acuosa en 2 matraces, etiquetar y tratar según lo indicado en los incisos 2 y 3,
respectivamente.
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2. Tratamiento de la fase orgánica

2.1. Adicionar Na2SO4 anhidro para eliminar el exceso de agua, filtrar sobre algodón y concentrar in
vacuo. El remanente obtenido se reconstituye con 2 mL de MeOH. Etiquetar como fracción ESC.
3. Tratamiento de la fase acuosa
3.1. Llevar a pH 2 adicionando HCl concentrado. Etiquetar como fracción AB.
3.2. La fracción AB se conserva para la cuantificación de ácido barbitúrico de acuerdo con el
procedimiento indicado en el apartado “Cuantificación ácido barbitúrico”.

NOTA: el disolvente recuperado en el rotaevaporador se deposita en el contenedor etiquetado como R1 para

CH2Cl2. Los residuos de Na2SO4 anhidro se depositan en el contenedor etiquetado como R2.

Cuantificación de ácido barbitúrico

Preparación de la curva patrón de ácido barbitúrico
1. Preparar la solución patrón de ácido barbitúrico (3 mg/mL) como se indica en el Apéndice II:
preparación de reactivos. [La preparan la(o)s profesora(e)s]
2. Para preparar la curva patrón de ácido barbitúrico colocar, en matraces volumétricos de 10 mL,
los volúmenes de la solución patrón de ácido barbitúrico indicados en la Tabla 1 y llevar al aforo
con agua destilada.

Tabla 1. Curva patrón de ácido barbitúrico.

Solución patrón de ácido Ácido barbitúrico
barbitúrico (mL) [mg/mL)
0.0 BLANCO
1.5 0.45
3.0 0.90
6.0 1.80
8.0 2.40

Tratamiento de la muestra problema, curva patrón y blanco

1. Colocar en tubos de ensaye 1 mL de cada una de las fracciones que contienen ácido barbitúrico
(muestra problema, curva patrón y blanco).
2. Adicionar a cada uno de los tubos de ensaye 0.5 mL de la solución saturada de NaNO 2, 0.1 mL
de la solución de AcOH 2 M y 2.4 mL de agua destilada.
3. Determinar la absorbancia de cada una de las muestras en el espectrofotómetro a 530 nm,
utilizando el BLANCO de la curva patrón (Tabla 1).

NOTA: antes de determinar la absorbancia de su muestra, se deberá ajustar a cero la absorbancia con el
blanco de la curva correspondiente.

4. Después de haber realizado la lectura de cada una de las muestras, colocarlas en un contenedor
etiquetado como R3.
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Identificación
Cromatografía en capa fina
1. Los análisis por CCF se realizan en cromatoplacas de 5 cm x 2.5 cm, que consisten en placas de
aluminio recubiertas con una capa de gel de sílice (sílica Kieselgel 60 F254 Merck).
2. Aplicar en el lado izquierdo de la cromatoplaca la referencia de escopolamina, y colocar la
fracción ESC reconstituida al lado derecho de la referencia.
3. Preparar el sistema de elución para la escopolamina: CH2Cl2-MeOH-NH4OH (9:1:0.1) Mezclar
primero el NH4OH y MeOH, después verter la mezcla resultante en el CH2Cl2.
4. Saturar las cámaras de elución durante 10 minutos antes de eluir las cromatoplacas.
5. Eluir hasta la línea límite de elución.
6. Visualizar la presencia de las sustancias con una lámpara de luz UV a 254 nm y posteriormente,
revelar la cromatoplaca utilizando la solución etiquetada como solución reveladora de reactivo
de Dragendorff [se utilizará la bomba de aspersión].
7. Calcular el factor de retención (Rf) y comparar el valor obtenido con el de la referencia.
8. Desechar el sistema de elución en el contenedor etiquetado como R4 y depositar las
cromatoplacas en una bolsa de plástico etiquetada como R5.

DISPOSICIÓN DE RESIDUOS
• R1: disolventes orgánicos clorados (CH2Cl2).
• R2: Na2SO4
• R3: residuos de la cuantificación del ácido barbitúrico (ácido barbitúrico, NaNO2, AcOH y MeOH).
• R4: fases móviles con disolventes orgánicos clorados (CH2Cl2-MeOH-NH4OH).
• R5: cromatoplacas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• PubChem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
• DrugBank https://go.drugbank.com/
• Aydın, A., Ercan, Ö., Taşcıoğlu, S. (2005). A novel method for the spectrophotometric
determination of nitrite in water. Talanta 66, pp. 1181-1186.
• Benko, A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue.
Journal of Forensic Sciences 30, pp. 708-714.
• Blanke, R.V. y Decker, W.J. (1986) Analysis of Toxic substances. En Burtis, C.A., Edward, R.A. (Eds.)
Textbook of Clinical Chemistry. Saunders, Philadelphia, pp. 1670-1744.
• Bowman, W.C. y Rand, M.J. (1984) Farmacología. Bases Bioquímicas y Patológicas. (2ª Ed). Ed.
Interamericana, México, pp. 42.25-42.32.
• Bruneton, J. (2001) Alcaloides, Generalidades en Farmacognosia. Fitoquímica, Plantas
Medicinales. Ed. Acribia, Zaragoza, España, pp. 775-792.
• Clark, E.E. (1972) Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London.
• Cochin, J. y Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs.
Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Blood
and Tissues. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, pp. 154-159.
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CUESTIONARIO
1. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos para la curva patrón y calcule
la regresión lineal. Interpole los valores de absorbancia en la curva y determine la concentración
de ácido barbitúrico en la muestra. Indique los cálculos realizados.

Tabla 2. Absorbancias de la curva patrón de ácido barbitúrico

Absorbancia
Ácido Barbitúrico [mg/mL]
Curva 1 Curva 2
0.45
0.90
1.80
2.40
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlación lineal (R2)
Concentración de ácido barbitúrico
en la fracción [mg/mL]

2. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en la prueba de identificación. Marque
con una cruz si la reacción de identificación en CCF fue positiva y un guión si fue negativa, y
anote el valor de Rf obtenido.

Tabla 3. Resultados de las pruebas de identificación.

Fracción Identificación en CCF Rf
ESC

3. De acuerdo con los resultados reportados en los incisos 1 y 2, indique si su muestra contenía
ácido barbitúrico. Explique su respuesta.
4. A partir de los resultados reportados en la Tabla 3, indique si su muestra contenía escopolamina.
Explique su respuesta.
5. ¿Cuáles son los puntos que considera críticos para la adecuada identificación de los
componentes en la muestra problema? Explique su respuesta.
6. Discuta brevemente sus resultados y escriba sus conclusiones al respecto.
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APÉNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Concepto de xenobiótico.
2. Efectos tóxicos de la escopolamina y el ácido barbitúrico.
3. Relación del grado de disociación de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra
disuelto en función del valor de su pKa.
4. Valores de pKa de la escopolamina y el ácido barbitúrico.
5. Forma ionizada y no ionizada de la escopolamina y el ácido barbitúrico.
6. Solubilidad de una sustancia iónica en medio acuoso y en un disolvente orgánico.
7. Densidad de los disolventes a emplear.
8. Fundamento de una extracción múltiple y selectiva.
9. Especies químicas que se encuentran en cada una de las fases obtenidas en la extracción.
10. Objetivo de adicionar una solución de HCl 1 concentrado, en el tratamiento de la fase acuosa.
11. Fundamento de la técnica de cromatografía en capa fina.
12. Fundamento del uso del reactivo de Dragendorff como revelador, y esquema de reacción.
13. Esquema de la reacción de cuantificación del ácido barbitúrico.
14. Ley de Lambert y Beer.
15. Sugiera un esquema de separación para la siguiente mezcla de sustancias no volátiles, indicando
los reactivos y disolventes utilizados, los valores de pH y la naturaleza de las sustancias durante
las diferentes etapas del proceso.

Elaboró: Sandra Centeno.

Revisó: Sitlali Olguín y Diego Figueroa.