UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS INFORME DE

Facultad de Ciencias básicas e ingenierías LABORATORIO

Departamento de Biología y Química PRINCIPIOS QUÍMICOS

AMINOÁCIDOS: CURVAS DE TITULACIÓN Y SEPARACIÓN POR

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Lina marcela Santiago Acuña – Ingeniería Agroindustrial – Grupo 1

Michell Lorena Beltrán – Ingeniería Agroindustrial – Grupo 1

Docente: Lissette Johana Hernández Arrieta

Facultad de Ciencias Agropecuarias y recursos naturales

Resumen

Los aminoácidos son una parte fundamental de la vida en general, así que es muy importante que se tengan ciertos conocimientos de estos,
para ello se implementan estudios que les enseñen a comprender como funcionan, como se identifican y que características presentan cada
uno de ellos, para obtener esta información básica se emplean unos métodos, estos son curvas de titulación, para saber su pK, pH, zona
tampón, cómo reacciona en cuanto a su solubilidad, entre otros factores útiles para el entendimiento, por otro lado se utiliza la cromatografía
en capa fina, que permite conocer si cierto componente tiene presencia de aminoácidos.

Palabras clave: aminoácidos, curvas de titulación, cromatografía, características, orgánico.

Abstract

Amino acids are a fundamental part of life in general, so it is very important to have some knowledge of these, for this, studies are imple-
mented that teach them to understand how they work, how they are identified and what characteristics each one of them presents, To obtain
this basic information, some methods are used, these are titration curves, to know its pK, pH, buffer zone, how it reacts in terms of its solubil-
ity, among other useful factors for understanding, on the other hand, chromatography is used in thin layer, which allows knowing if a certain
component has the presence of amino acids.

Keywords: amino acids, titration curves, chromatography, characteristics, organic.

 Verificación experimental de la constante universal de los gases

resolución y depende de la concentración del compuesto o

compuestos de interés en la muestra. Para las soluciones con-
1. Introducción
centradas bastara una cantidad muy pequeña para aplicar sufi-
ciente cantidad de los solutos o separar sin llegar a saturar la
Los aminoácidos son moléculas orgánicas que contienen un capacidad de la resolución de la placa de cromatografía.
grupo amino en uno de los extremos de la molécula y un grupo
carboxilo en el otro extremo. Los aminoácidos son las unidades
que forman a las proteínas, sin embargo, estos como sus deri- 2. Objetivos
vados participan en funciones celulares tan diversas como la
 Comprobar el carácter anfotérico de los aminoáci-
trasmisión nerviosa y biosíntesis de porfirinas, purinas, pirimidi-
dos y determinar mediante curvas de titulación, los
nas y urea. Los polímeros cortos de aminoácidos tienen funcio-
valores de pK de los grupos ionizables.
nes importantes en el sistema neuroendocrino como hormonas,
factores que liberan hormonas, etc. (Carlos Olvera)
 Hallar el punto isoeléctrico de los aminoácidos.

La titulación es un procedimiento analítico para determinar la

 Separar e identificar una mezcla de aminoácidos
concentración de un analito con propiedades acidas o básicas,
por cromatografía en capa fina.
utilizando una disolución valorada de una base o un ácido me-
diante una reacción de neutralización para formar una sal y
3. Materiales y reactivos
agua. Mediante la titulación también es posible obtener el pK
del analito.
Equipos Materiales Reactivos
Las curvas de titulación son representaciones graficas de la va- Plancha de agi- Vasos de precipi- HCl 0,2 N (valo-
riación de pH durante el transcurso de la valoración. Las curvas tación tado de 100 ml rado)
de titulación de los aminoácidos proporcionan la siguiente infor- (2)
mación: Potenciómetro Vasos de precipi- NaOH 0,2 N (va-
- Medida del pK de los grupos ionizables, se localizan en el punto tado de 250 ml lorado)
medio de la zona tampón. (1)
- Regiones de capacidad tampón. Horno de con- Pipeta graduada Soluciones de
- pI: se localiza en el intervalo del viraje. vección forzada de 25 ml aminoácidos en
- Carga eléctrica del aminoácido en rango del pH. agua 0,1 M (ej.:
- Solubilidad relativa del aminoácido en cada rango del pH. glicina y gluta-
mato)
Los casos más frecuentes en bioquímica son las valoraciones
Pera de succión Sílica gel- 60
de ácidos y bases débiles, ya que muchos metabolitos presen-
tan cierto carácter acido o básico. Bureta graduada Soluciones de
de 25 ml (1) aminoácidos en
Cromatografía en capa fina, CCF o TLC se puede utilizar como agua al 2% (ej.:
soporte cualquier sustancia que peda dividirse en partículas fi- Triptófano, gli-
nas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto in- cina, tirosina)
cluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, oxido de aluminio, Pinza para bureta Mezcla de sol-
tierra de di atormentas, silicato de magnesio, etc.) y orgánicas ventes: n-butanil,
(celulosa, poliamida, polietileno, etc.). La utilización de soportes ácido acético y
hidrófobos facilita la separación de compuestos no polares (lí- agua (relación
pidos). En la CCF, la fase estacionaria es una lamina de 0,25- 12:3:5)
0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la su-
Soporte universal Reactivo de nin-
perficie de la placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas
hindrina: disolver
comerciales suministran placas ya preparadas, estas pueden
0,2 g en 100 mL
hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten de acetona (pre-
extender sobre la placa de vidrio la papilla formada por la sus- parar solución
pensión del material en un disolvente adecuado. La placa se fresca)
deja secar antes de su utilización.
Agitador magné-
Para el desarrollo de la cromatografía las muestras en un disol- tico
vente adecuado se aplican puntualmente con la ayuda de jerin- Frasco lavador
gas, micropipetas, o capilares en un extremo de la placa. El vo-
lumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar a la
 Aminoácidos: curvas de titulación y separación por cromatografía en capa fina.
Probeta gra-
duada de 25 ml
(1)
Cámara cromato-
gráfica
4. Marco teórico
Estructura de los aminoácidos
Los 20 aminoácidos estándar que forman las proteínas son L-
aminoácido (de acuerdo a su estereoquímica, por
convención, el grupo amino se encuentra representado a la iz-
quierda de ahí la letra L) y la ɑ aminoácidos donde
su estructura común está caracterizada por la presencia de un
grupo amino, un grupo carboxilo y un hidrogeno
unidos sobre el mismo átomo de carbono, llamado carbono ɑ.
A su vez, los 20 aminoácidos se diferencian por
la naturaleza del cuarto constituyente, llamado en general
grupo R (Fig. 1), las propiedades de cada aminoácido
dependerán de la naturaleza química de cada grupo R.
Curvas de titulación para aminoácidos
Puesto que lo aminoácidos poseen un grupo amino y uno car-
boxilo (pueden comportarse como una base o
como un ácido), deben reaccionar con ácidos y bases. Dichos
compuestos se conocen como sustancias
anfotéricas. En soluciones de pH neutro los aminoácidos exis-
ten como zwitteriones (iones doblemente
cargados) en los que el grupo carboxilo esta disociado y el
grupo amino protonado. El zwitterion pueden actuar
como acido (donador de protones):
Placas de croma-
tografía
Capilares
O como una base (aceptor de protones):
Los aminoácidos tienen curvas de titulación características, a
partir de las cuales se pueden obtener los valores
de pK de cada uno de los grupos ionizables. El comportamiento
anfótero de cada uno de los aminoácidos y sus
valores de punto isoeléctrico son una consecuencia de su es-
tructura particular, ya que los grupos ionizables de
la cadena lateral R también contribuyen a la carga. Eso se re-
flejaría en la curva de titulación.
Separación por cromatografía en capa fina
La cromatografía es una de las técnicas más útiles para la se-
paración de compuestos que se pre3senta
propiedades químicas estrechamente relacionadas. La separa-
ción se lleva a cabo por la diferencia en la
interacción entre los componentes de una mezcla y dos fases
inmiscibles: la fase estacionaria y la fase móvil.
La fase estacionaria es un medio poroso, como la sílica gel o
alúmina, a través de la cual la mezcla migra bajo
la influencia del movimiento de un disolvente (fase móvil).
La cromatografía en capa fina (o thinlayerchromatography –
TLC) es una técnica utilizada para separar e
identificar compuestos de interés en una mezcla. En esta téc-
nica se utiliza una placa recubierta de una capa
fina de sílica adherida a una lámina de vidrio o aluminio, la sílica
actúa como fase estacionaria y una mezcla de
solventes fase móvil (Fig 2).
 Aminoácidos: curvas de titulación y separación por cromatografía en capa fina.

5. Sección experimental

Titulación de un aminoácido
en la primera parte, se realizó la titulación de un aminoácido
Histidina 0.1M, para realizar la curva completa se utilizó un
ácido titulante (HCl 0.2M) y una base (NaOH 0.2M).

Para realizar una corrida cromatografía utilizando una técnica

primero se debe sembrar la muestra a analizar en
una línea de base. Luego, la placa es puesta en una cámara
cromatográfica y el solvente empezara a ascender
por capilaridad. La cámara debe estar cerrada para que este
saturada con el solvente. A medida que el solvente
avanza de la mezcla se separa en sus componentes, avanzado
con mayor grado aquel componente de la
mezcla que presente menor interacción con la fase estaciona-
ria. Un criterio utilizado pata comparar los
componentes desconocidos de una mezcla y patrones conoci-
dos es el factor de retención (Rf), el cual es una relación arit-
mética entre la distancia que recorrió uno de los componentes
de la mezcla y la distancia que Figura 3. Aminoácido utilizado.
avanzo la fase móvil.

Teniendo en cuenta que los pK de los grupos funcionales de los

Separación cromatografía de aminoácidos
La interacción de los aminoácidos con la fase estacionaria,
como la sílica, varía en función del grupo –R. Por
ejemplo, un aminoácido que interactúe fuertemente con la sí-
lica, luego de efectuar la corrida cromatografía,
recorrerá una pequeña distancia con respecto al punto de siem-
bra de la muestra, mientras que el presente
menos interacción se moverá más. A su vez mediante el uso de
patrones es posible identificar los componentes
de una mezcla. Puesto que los aminoácidos son compuestos
no coloreados, la ninhidrinaes empleada para
detectarlos. (AMINOÁCIDOS: CURVAS DE TITULACIÓN Y
SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA,
2016)
aminoácidos se encuentran localizados en distintos rangos de
pH, se realizó una titulación que abarcó prácticamente todo el
rango pH (ácido y básico) para cada aminoácido. Así, em-
pleando una solución de HCl 0.2 M para los grupos ɑ- carboxilo,
y una solución de NaOH 0.2 M para los grupos ɑ- amino. Bajo
ese esquema, se realizaron dos valoraciones al aminoácido,
histidina, una con ácido y otra con base.
Para realizar la titulación, en un vaso de precipitado de 100 ml
se colocaron 50 ml de la solución de Histidina 0,1M, registrando
el pH inicial, usando la bureta se agregó (HCL 0,2M) adicio-
nando 1 ml hasta obtener un pH de 1,5. De la misma manera
se titularon 50 ml de histidina con hidróxido de sodio hasta ob-
tener un pH de 12,5.
 Verificación experimental de la constante universal de los gases

Desarrollo de la cromatografía
La placa se introdujo dentro de la cámara de cromatografía y se
esperó hasta que ascendió cerca al borde superior. Posterior-
mente se dejó secar a temperatura ambiente.

Figura 4. Montaje titulación del aminoácido.

Separación cromatografía de aminoácidos

Se adiciono la mezcla de solvente en la cámara cromatografía Figura 6. Placas en la cámara de cromatografía.
se cerró y se esperó durante aproximadamente 20 minutos. Se
tomó la placa y se realizó una línea recta a través de lo ancho
de placa (línea base). Usando unos capilares se unas gotas so- Por último, la placa fue llevada al horno a 105 °C.
bre la línea de base y se dejó secar.

Figura 7. Resultado de la cromatografía.

Figura 5. Placas con los aminoácidos sembrados.

6. Resultados y análisis
 Aminoácidos: curvas de titulación y separación por cromatografía en capa fina.

28 ml 2,219
Titulación de un aminoácido
29 ml 2,105
Tabla 1. Titulación de Histidina 0.1M con ácido titulante (HCl 30 ml 2,014
0.2M).
Titulación histidina con ácido (HCl 0.2M) 31 ml 1,937

32 ml 1,859
HCl adicionado (ml) pH obtenido
33 ml 1,793
0 ml 8,206
34 ml 1,735
1 ml 7,694
35 ml 1,679
2 ml 7,433
36 ml 1,634
3 ml 7,214
37 ml 1,594
4 ml 7,048

5 ml 6,908

6 ml 6,698
Tabla 2. Titulación de Histidina 0.1M con base titulante (NaOH
7 ml 6,602
0.2M).
8 ml 6,521 Titulación histidina con base (NaOH 0.2M)
9 ml 6,442 NaOH adicionado (ml) pH obtenido
10 ml 6,342 0 ml 8,206
11 ml 6,289 1 ml 8,402
12 ml 6,205 2 ml 7,728
13 ml 6,115 3 ml 8,967
14 ml 6,054 4 ml 9,134
15 ml 5,950 5 ml 9,253
16 ml 5,857 6 ml 9,379
17 ml 5,753 7 ml 9,484
18 ml 5,647 8 ml 9,574
19 ml 5,533 9 ml 9,663
20 ml 5,393 10 ml 9,744
21 ml 5,220 11 ml 9,819
22 ml 4,984 12 ml 9,894
23 ml 4,615 13 ml 9,919
24 ml 3,752 14 ml 10,045
25 ml 2,890 15 ml 10,109
26 ml 2,565 16 ml 10,208
27 ml 2,407 17 ml 10,300
 Verificación experimental de la constante universal de los gases

18 ml 10,389
Grafica 2. Curva de titulación de la histidina 0.1M, con ácido
19 ml 10,489
(HCl 0.2M).
20 ml 10,595

21 ml 10,683

22 ml 10,841

23 ml 11,033

24 ml 11,222

25 ml 11,557

26 ml 11,987

27 ml 12,373

28 ml 12,578

Grafica 1. Volumen acido base adicionado vs pH obtenido para Grafica 3. Curva de titulación de la histidina 0.1M, con base
cada valoración realizada. (NaOH 0.2M).
 Aminoácidos: curvas de titulación y separación por cromatografía en capa fina.

Separación cromatografía de aminoácidos La histidina a pH acido se encuentra como un ácido diprótico,

ya que tanto el grupo amino como el carboxilo se encuentran
protonados, es decir, a pH = 1, el 100% de las moléculas de
ALANINA GLICINA
aminoácido se encuentran en forma de catión.

Al ir añadiendo equivalentes de base como se puede observar

en la gráfica 3 (. Curva de titulación de la histidina 0.1M, con
base (NaOH 0.2M)), este aminoácido presenta tres grupos ioni-
zables: el grupo carboxilo, el grupo imidazol de la cadena lateral
y el grupo α-amino.

Por lo tanto, la adición de equivalentes de base produce la libe-

La alanina mostro color, esto
quiere decir que tiene presencia
de aminoácidos, la muestra de co-
lor lego hasta los 2,5 cm después
de la marca e la placa, comparado
con la muestra problema, pode-
mos decir que la alanina es una
sustancia polar y no reacciono
bien con el solvente.
MUESTRA PROBLEMA
En cuanto a la glicina mostro co-
loración poco después de la línea
marcada a 1,8 cm aproximada-
mente, es una sustancia polar y
la que menor medida tuvo com-
parada con las otras.
PROLINA
ración secuencial de protones al medio, y estos equilibrios es-
tán determinados por sus correspondientes constantes: el
grupo carboxilo (pKC), el grupo imidazol (pKR) y el grupo amino
(pKN). En este caso, existen tres regiones de capacidad tam-
ponante, una de ellas localizada cerca del pKR = 6, por lo que
la histidina actúa como tampón a pH fisiológico. A su vez, el pI
se calcula como el promedio del pKN y del pKR.
En el caso de la histidina, el hecho de que su pKR esté muy
próximo al pH fisiológico, implica que este aminoácido puede
actuar como ácido ó como base en los medios biológicos. Por
lo tanto, la hemoglobina, que es una proteína rica en histidina,
es capaz de tamponar los excesos de ácido ó de base en san-
gre, constituyendo uno de los sistemas tampón del organismo
(uno de los más importantes junto al tampón bicarbonato). Ade-
más, la histidina forma parte del centro activo de muchas enzi-
mas que catalizan reacciones que cursan con transferencia de
protones.

La muestra problema fue la que La prolina no presenta grupos

más presento aminoácidos, según amino, por esto tiene ausencia de
las medidas llego has los 5,6 cm color en la placa.
de la placa, es una sustancia apo-
lar por lo cual tuvo mejor interac-
ción con el solvente y llego más le-
jos en la placa.

Análisis Figura 8. Curva de titulación de la histidina.

Al terminar el laboratorio, tabular y graficar los datos de manera

adecuada podemos observar en la gráfica 1, (volumen acido
base adicionado vs pH obtenido para cada valoración realizada)
donde se encuentra graficada la información de la tabla 1 y 2.
 Aminoácidos: curvas de titulación y separación por cromatografía en capa fina.

7. Conclusiones 8. Referencias

C Gutierrez O.(2018). Aminoácidos y proteínas. Medicina vete-

 Las curvas de titulación proporcionan el conoci-
miento de las regiones de capacidad tampón: mese-
tas donde se localizan los pKs; dichas regiones se
encuentran en el intervalo pK ± 1 unidad de pH.
rinaria y zootecnia. Recuperado de:
https://fmvz.unam.mx/fmvz/p_estudios/apuntes_bioqui-
mica/Unidad_5.pdf

 La curva de titulación nos ayuda en encontrar rápi-
damente los valores del pKa y pI.
 Los aminoácidos pueden actuar como ácidos o ba-
ses, propiedad anfotérica.
 La técnica de cromatografía en capa fina (CCF) es
muy útil, ya que permite realizar el procedimiento uti-
lizando una pequeña muestra, el procedimiento se
realiza de manera rápida y sencilla.
 La cromatografía en capa fina permite separar e
identificar componentes relacionados presentes en
mezclas complejas. Permitió la distinción de los ami-
noácidos en el procedimiento de las sustancias de
prueba otorgadas.
J Jorrín, N Abril, J Barcena. (2019) separación de aminoácidos
por cromatografía en capa fina y detención mediante reacción
con ninhidrina. Cordoba. Recuperado de:
https://docplayer.es/2396842-11-separacion-de-aminoacidos-
por-cromatografia-en-capa-fina-y-deteccion-mediante-reac-
cion-con-ninhidrina.html
02 de 09 de 2016). (L. D. QUIMICA, Productor) Obtenido de
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loads/PRAC%20%23%202%20Amino%C3%A0cidos%20cur-
vas%20de%20titulaci%C3%B2n%20y%20sepa-
raci%C3%B2n%20por%20cromato-
graf%C3%ACa%20en%20capa%20fina.pdf

 En la cromatografía las separaciones de las molécu-

las en la mezcla dependen de la fuerza de ellas al
asociarse con más fuerza a la fase móvil o estacio-
naria. En este momento se manifiesta un movi-
miento diferencial.