Biología molecular ADN/PAP Captura de Híbridos y PCR

Carbajal Navarro Juan Fernando Profesor: Rosas Jiménez Enrique. Materia

Obstetricia. Universidad de Guadalajara. Centro Universitario de Tonalá. 30-08-
2023.

El virus del papiloma humano (VPH) pertenece al grupo de virus con tropismo por
los epitelios; infectan predominantemente la piel y las membranas mucosas y
producen proliferaciones benignas o papilomas, que bajo ciertas circunstancias
pueden experimentar transformación maligna. El VPH es considerado el agente
causal más importante del carcinoma del cérvix uterino y el conocimiento de su
biología es fundamental para el entendimiento de la carcinogénesis cervical.
Esta familia infecta los epitelios de mamíferos y otras especies vertebradas. El
VPH pertenece a cinco de 18 géneros de la familia Papillomaviridae: alfa, beta,
gamma, mu y nu.16 Los papilomavirus se caracterizan por ser pequeños virus no
envueltos que miden entre 45 mm a 55 nm de diámetro, con una cápside
icosaédrica de proteína. Su genoma de ácido desoxirribonucléico (ADN) circular
de doble cadena de aproximadamente 8,000 pares de bases de longitud, contiene
nueve o 10 regiones codificantes, denominadas zonas abiertas de lectura (ORFs
por sus siglas en inglés). Dichas ORFs son secuencias de nucleótidos que
codifican proteínas no estructurales (enzimas) involucradas en la regulación de las
funciones virales, así como proteínas estructurales involucradas en la producción
de las diferentes partículas del virus. Aquellas que codifican proteínas no
estructurales son conocidas como genes de expresión temprana o E ("early") y las
que codifican proteínas estructurales se denominan genes de expresión tardía o L
("late"), de acuerdo a si son expresados antes o después de la síntesis del ADN
destinado a ser ensamblado en las partículas de progenie viral. En el VPH, siete u
ocho de las regiones ORFs codifican para genes tempranos y únicamente dos
para genes tardíos. Contiene además una región no codificante, conocida como
región larga de control o región reguladora principal, cuyas secuencias se
encargan de la regulación de la expresión de todos sus genes, tanto de las
regiones temprana como tardía
Captura de híbridos
La prueba de Captura de Híbridos 2 (CH2) es la prueba más antigua utilizada en
tamizaje y ha sido validada clínicamente en múltiples estudios. Esta prueba
permite la detección de VPH-AR por medio de la utilización de un cóctel de sondas
para los 13 VPH-AR. Como su nombre indica, es una técnica en la cual se
identifican híbridos ADN con sondas de ARN. La técnica de Captura de Híbridos 2
(Hybrid Capture 2, HC2) fue desarrollada originalmente por Digene Corporation
(EE.UU.) y actualmente por Qiagen (EE.UU.) y desde el año 2000 cuenta con la
aprobación de la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados
Unidos (FDA) para uso rutinario en las actividades de detección temprana en
combinación con la citología.
La captura de híbridos 2 (CH2) es una prueba de ADN que utiliza la alta
especificidad de las sondas de ARN para detectar 13 genotipos de alto riesgo del
VPH (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68); es la prueba molecular
más antigua de uso rutinario en las actividades de detección temprana. Tiene una
alta sensibilidad y valor predictivo negativo, si una mujer obtiene resultados
negativos en la citología y en la prueba de captura de híbridos 2 tiene una
probabilidad nula de tener lesiones al menos durante 5 a 7 años.
En el laboratorio, las células cervicales se someten a una solución alcalina
desnaturalizante que expone el material genético. Posteriormente, mediante el uso
de un cóctel de sondas de ARN (correspondientes a los 13 tipos de VPH-AR 16,
18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68), se produce, en presencia de
cualquiera de estos virus, la formación de un híbrido ADN viral-ARN. La
hibridación se identifica mediante anticuerpos específicos y una solución quimio-
luminiscente que produce una emisión de luz cuando hay presencia de híbridos.
Para el revelado de los híbridos, se requiere de un luminómetro
Prueba de PCR
La amplificación de genes mediante PCR permite obtener millones de copias a
partir de un fragmento de ADN particular. Se han diseñado diferentes conjuntos de
primers o cebos, que en su mayoría han sido dirigidos hacia la región L1 y que
permiten diferenciar, mediante sondas específicas, los tipos más frecuentes de
VPH de alto, intermedio y bajo riesgo efectuando una hibridación en placa de los
productos biotinilados previamente amplificados por PCR. Esta técnica es muy
sensible, con un nivel de detección hasta de una copia viral. Sin embargo, debido
a su alta sensibilidad, este método es muy susceptible a contaminación. En la
actualidad existen, además de las PCR genéricas, aquellas tipo-específicas que
reportan algunos tipos virales y las PCR múltiples que identifican varios
fragmentos del genoma.
Los productos de PCR se hibridan a una mezcla de oligonucleótidos específicos.
Para la detección, se utiliza un ensayo inmunoenzimático. Entre sus ventajas, se
encuentra que maneja un formato simple, hasta 42 productos de la PCR se
pueden escribir simultáneamente por membrana por día, las membranas se
pueden rehibridar fácilmente al menos 15 veces sin una pérdida de especificidad
ni sensibilidad. Su limitación es que no se encuentra disponible comercialmente.
Bibliografia:
Raby, B. A. (2016). Tools for genetics and genomics: Polymerase chain reaction.
U: UpToDate.
Menéndez, A. A. (2007). Virus del papiloma humano. Aspectos virológicos e
inmunitarios. Semergen: revista española de medicina de familia, (2), 3-8.
Picconi, M. A. (2013). Detección de virus papiloma humano en la prevención del
cáncer cérvico-uterino. Medicina (Buenos Aires), 73(6), 585-596. Topete M, &
Magaña A (2016). Técnicas de
hibridación. Montes A, & Rodríguez A, & Borunda J(Eds.), Biología Molecular.
Fundament