DIAGNOSTICO MOLECULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS

DIAGNOSTICO MOLECULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE

INDIVIDUOS

INTRODUCCIÓN

El concepto de “diagnóstico molecular” es un término amplio que incluye

técnicas de biología molecular en beneficio de la salud humana, detectando y/o
cuantificando secuencias genéticas específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN),
ácido ribonucleico (ARN) o proteínas. Inicialmente, el concepto de “Biología
Molecular” se aplicó a los trabajos realizados sobre el ADN. Esta molécula, descubierta
por el biólogo y médico suizo Johan Friedrich Miescher en el año 1869, capturó la
atención de la comunidad científica, luego que los investigadores James D. Watson,
Francis Crick y Rosalind Franklin descubrieran la estructura del ADN en el año 1953
(Watson y Crick, 1953). Este descubrimiento abrió un nuevo horizonte para futuras
generaciones en diferentes áreas de la ciencia, incluida la investigación biomédica.

El campo del diagnóstico molecular ha tenido un sostenido crecimiento en los últimos

años, sobre el 12% anual, esperando que para el 2017 alcance un mercado por sobre los
US$60 billones. En la actualidad, el diagnóstico molecular se ha enfocado
principalmente en el diagnóstico de enfermedades infecciosas (50-60%), sin embargo,
existe un aumento progresivo de técnicas moleculares en el área de cáncer y
enfermedades genéticas, convirtiendo al diagnóstico molecular en una de las áreas de
diagnóstico de mayor dinamismo y crecimiento, revolucionando las estrategias para el
tratamiento de diversas patologías y condiciones de salud, ofreciendo técnicas con altos
estándares de calidad que entregan al equipo clínico información crítica para el cuidado
de los pacientes.

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LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Esta técnica fue descubierto por el bioquímico Kary B. Mullis quien recibió el
premio Nobel de química en 1993, quizás el mayor aporte en la era del diagnóstico
molecular (Saiki y cols., 1988). De forma general esta tecnica permite la amplificación
de una región especifica de ADN haciendo uso de partidores o secuencias de ADN que
delimitan la parte de la amplificación. A partir de una copia de la región a amplificar se
obtienen millones de copias, lo que permite su detección y de esta forma se evidencia la
presencia de la región de ADN en una muestra determinada. Dada la naturaleza de la
técnica, la alta especificidad de la RPC viene dada por la hibridación de los partidores
complementarios a la secuencia blanco y su elevada sensibilidad a la baja cantidad de
ADN que requiere para iniciar la amplificación.

RESUMEN DE LAS PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS Y APLICACIONES

DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES

TÉCNICA CARACTERÍSTICAS Y APLICACIONES

Amplificación en cadena de la polimerasa. Alta sensibilidad y
especificidad. El producto final de esta reacción exponencial es un
PCR ácido nucleico de doble cadena que puede ser analizado en tamaño,
secuencia y cantidad o servir para otras técnicas moleculares. Se utiliza
para la búsqueda de material genético de un agente infeccioso en una
muestra clínica y para la identificación de aislamientos
La PCR a tiempo real es una variante de la PCR convencional que se
emplea para la cuantificación de ácidos tiempo real nucleicos, tanto de
ADN como de ARN mensajero en una muestra. Permite cuantificar
proporciones de P. gingivalis, P. intermedia y A.
actinomycetemcomitans, y debido a su gran rapidez y sensibilidad son
de gran utilidad en los estudios epidemiológicos. La presencia o
PCR a tiempo
ausencia de la bacteria puede ser insuficiente para evaluar los efectos
real
terapéuticos de algún tratamiento, por lo que la cuantificación de los
niveles o proporciones de las especies en el biofilm proporciona un
mejor resultado.

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Esta técnica es similar a la PCR, pero utiliza cebadores (primers)

aleatorios. La amplificación aleatoria del ADN se utiliza para
PCR aleatoria desarrollar marcadores genéticos en distintas especies y para
discriminar entre variedades y aislamientos de microorganismos
patógenos. Constituye una herramienta epidemiológica para la
investigación de fuentes de infección o vías de transmisión.

Southern Blot Transferencia de fragmentos de ADN originados por endonucleasas de

restricción y posterior hibridación con una sonda marcada. Permite la
comparación de patrones genéticos.
Dot Blot Técnicas de hibridación. Detección cualitativa de un agente infeccioso
en muestras de sangre, heces, esputos, etcétera.
Las muestras subgingivales son sometidas a la digestión enzimática
del ADN bacteriano, estos fragmentos desconocidos son expuestos a
sondas marcadas complementarias y bajo determinadas condiciones de
temperatura e ionización, se permite su hibridación en un sustrato de
nitrocelulosa. El ADN puede ser detectado por radiomarcado o
reacción calorimétrica. Las sondas de ADN permiten identificar
Sondas
secuencias de nucleótidos específicos para especies bacterianas
concretas. Permiten detectar bacterias específicas de la placa
subgingival en niveles de 103. Esta técnica se utiliza para identificar de
forma rápida las especies de micobacterias aisladas.

Es una nueva técnica que combina el método molecular de la

hibridación con sondas de ADN, con la tecnología de los biochips o
chip microelectrónico. Un array es un conjunto de sondas moleculares
fijadas en forma ordenada a un soporte sólido, que pueden llegar a ser
Microarrays
de hasta más de 100 000 sondas, lo que supone posibilidades casi
infinitas de detección simultánea de diferentes genes, ya sea de un solo
microorganismo o de numerosas especies. Esta tecnología permite
identificar no sólo los posibles patógenos implicados, sino también
conocer sus características de patogenicidad, epidemiológicas y de
resistencia a los antimicrobianos.

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Interrupción controlada de la síntesis de una hebra complementaria

durante una replicación in vitro. Se utiliza para relacionar
filogenéticamente aislamientos microbianos. Detección y
caracterización de secuencias de ADN por su tamaño en muestras
Secuenciación clínicas o en aislamientos.Se emplea para: bacterias no cultivables
presentes en muestras clínicas, bacterias cuyas características
bioquímicas no se adaptan a las de ningún género o especie reconocida,
bacterias fastidiosas por sus requerimientos nutricionales o su
crecimiento lento. Actualmente, se usa para la detección de las
principales especies periodontopatógenas.
Análisis Esta técnica ofrece el perfil de proteínas totales de una célula o un
proteomica microorganismo. Como método de estudio de la Proteómica se usa la
electroforesis en gel bidireccional para separar las proteínas,
identificándose las mismas mediante espectrometría de masas.
Separación electroforética de cromosomas. Utilizada como arma
epidemiológica para comparar genéticamente cepas pertenecientes a
Cariotipificació una misma especie o a diferentes especies. Utilidad en epidemiología
n molecular.
Restricción Digestión del material genético con enzimas de restricción. Utilizada
(FRLP) para generar patrones electroforéticos de aislamientos pertenecientes a
una misma especie o a especies diferentes. Utilidad en epidemiología
molecular.

Digestión del ADN utilizando enzimas de restricción (Restriction Fragment Length

Polymorphism - RFLP)

La técnica conocida como polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción o

RFLP permite no sólo diferenciar especies, sino también variantes genotípicas mediante
el análisis de patrones de productos de la degradacióndel ADN utilizando enzimas. Este
método básico utiliza restrictasas que rompen el ADN en dianas o secuencias
específicas. La molécula de ADN es digerida en diferentes sitios y da lugar a
fragmentos definidos de diferentes longitudes, que dan origen a los llamados patrones
de restricción, cuando son analizados por electroforesis. La técnica permite identificar
cepas a partir de los fragmentos de ADN obtenidos cuando esta molécula es digerida
por una enzima de restricción en particular que reconoce secuencias concretas. Los
fragmentos generados al cortar el ADN con una restrictasa pueden separarse fácilmente

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por electroforesis en gel de agarosa. La velocidad de corrida de los fragmentos depende

de la longitud de éstos: los más pequeños migran más rápido que los más grandes. Los
fragmentos de restricción no sufren daños por su paso por el gel y la tinción con
colorante de ADN (bromuro de etidio) los revela como una serie de bandas. Las
restrictasas más útiles suelen ser las que producen pocos fragmentos fáciles de separar
en geles de agarosa.

Uso de algunas técnicas moleculares para la identificación de individuos

SEXO técnicas basadas en la hibridación de ADN
El cromosoma W contiene una gran proporción de secuencias repetitivas, que pueden
ser buscado marcadores ligados W. Esas secuencias repetitivas incluyen ADN repetidas
en tándem: microsatélites y minisatélites.
Los microsatélites se forman grupos de por lo general menos de 150 pb de longitud, con
unidades de repetición de hasta 13 pb.
Los minisatélites son más largos, con los racimos de hasta 20 kb de longitud y repetir
unidades de hasta 25 pb (BROWN 2002).
Para detectar marcadores de microsatélites o minisatélites ligados al sexo, el ADN se
digiere con enzimas de restricción, que escinden el ADN en sitios específicos definidos
por la secuencia de nucleótidos. fragmentos de ADN obtenidos se separan por tamaño
próximo con electroforesis en un gel de agarosa y se transfirieron a una membrana de
nylon (transferencia de Southern), que se incuba a continuación en una solución que
contiene sondas, (fragmentos de ADN marcados). Las sondas se hibridan con el ADN
genómico a secuencias complementarias. La hibridación se detecta en función del tipo
de sonda de etiquetado (por lo general radiactivamente con 32P o con biotina) por el
autorradiograma, fluorescencia, o reacción enzimática. Como resultado, se obtiene un
perfil específico de fragmentos de ADN. Con el fin de visualizar si la sonda genera
fragmentos específicos de las hembras, los perfiles de ADN de los machos y hembras de
referencia deben compararse. Por ejemplo, una repetición de trinucleótidos (TCC n) ha
demostrado ser ligada al sexo en las palomas y gallinas (EPPLEN et al., 1991).
Longmire et al. (1993) probaron 4 sondas: 3 repeticiones de dinucleótidos (CT
n), (GT n), (CG n) y 1 repetición de trinucleótidos (TCC n) en combinación con 1 de los
3 enzimas de restricción (HaeIII, HinfI, PstI) en 9 especies de aves de 6 órdenes. La
mejor sonda (CT n) detectaron secuencias específicas de la mujer en 6 especies,
mientras que la repetición de dinucleótido (CG n) no produjo ningún fragmento

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específico del sexo en cualquiera de las especies probadas. Lo más comúnmente usados
incluyen marcadores mini satélite sonda 33.15 (Jeffreys et al., 1985).
MIYAKI et al. (1997), mediante la aplicación de esta sonda de 36 especies de
loros de América del Sur a partir de 13 géneros, fueron capaces de identificar
fragmentos específicos de la mujer en 28 especies. Cada especie mostraron un conjunto
de fragmentos ligados por mujeres (entre 2 y 4) peculiar para una especie dada.

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SEXO técnicas basadas en la reacción de la polimerasa en cadena (RPC)

la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD). RAPD emplea en una
reacción de PCR una sola y elegido al azar cebador 10-nucleótidos que amplifica
fragmentos genómicos. La temperatura requemada está baja (por lo general 35 a 40 °
C), que es típico de esta técnica, se reduce la especificidad de la reacción, y por lo tanto
la repetibilidad de los resultados. Sin embargo, al mismo tiempo, baja temperatura
permite la amplificación de una amplia gama de fragmentos genómicos (Williams et al.
1990, WILLIAMS et al. 1993). Si una de las bandas en un gel es específica sólo para
hembras, lo más probablemente refleja una secuencia ligada-W (GRIFFITHS y
TIWARI 1993). Una reacción en cadena de la polimerasa con un único cebador
amplifica generalmente 10-20 fragmentos de ADN. Por lo tanto, los análisis RAPD se
inicia con la prueba de unas pocas docenas de cebadores para detectar aquellos que
amplifican los productos específicos para las mujeres. Sin embargo, a pesar del gran
número de cebadores ensayados, un producto específico de las hembras no siempre
puede ser encontrado. Por ejemplo, LESSELLS y Mateman (1998) no se identificaron
cebadores adecuados para 3 de las 10 especies estudiadas después de cribado hasta los
69 cebadores diferentes por especie. Como RAPD se desarrolló para estudiar
polimorfismo genético, las diferencias entre los 2 individuos pueden ser generados por
polimorfismo autosómica o Z cromosómico (Williams et al. 1990). Por lo tanto, para
localizar el marcador, el cual es más probable ligada al cromosoma W, mezcla de ADN,
es decir, muestra de ADN de diferentes individuos del mismo sexo, se debe utilizar. De
esta manera, la mayoría de los polimorfismos comunes en una población se amplifican
dentro de cada conjunto (análisis segregante granel), que permite la identificación de los
productos que se encuentran sólo en la piscina hembra (Michelmore et al. 1991).
En general, los productos de PCR de una muestra conjunta de 3 a 5 machos deben
compararse con los productos de PCR de una muestra conjunta de 3 a 5 hembras.
fragmento de ADN se resuelven ya sea en un gel de agarosa o poliacrilamida y
fragmentos seleccionados como marcador específico del sexo debe ser una de las 4
bandas más intensas sobre un gel (GRIFFITHS 2000).
La técnica AFLP combina PCR con digestión del ADN con enzimas de restricción
(VOS et al. 1995).
Una sola reacción resulta en alrededor de 100 fragmentos de ADN.
El primer paso de la técnica de AFLP incluye la digestión del ADN con 2
diferentes endonucleasas de restricción: un cortador de 4-base y un cortador de 6-base

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El siguiente paso es la ligadura, durante el cual los adaptadores de

oligonucleótidos (20 a 30 pb) se unen a los extremos cohesivos y es producido por
endonucleasas. Este paso es seguido por una amplificación preselectiva con cebadores
seleccionados complementarios a un adaptador y un único nucleótido específico en la
secuencia de fragmento original. Esto reduce la piscina de los fragmentos de la mezcla
original. El último paso del AFLP incluye una amplificación selectiva con los mismos
cebadores, pero por lo general con una extensión de 3 nucleótidos. Los productos se
muestran en geles de poliacrilamida. De manera similar a RAPD, la identificación de
marcadores específicos del sexo es difícil debido a la alta polimorfismo de secuencias
de ADN. Sin embargo, a diferencia de RAPD, el uso de muestras de ADN reunidas para
detectar fragmentos específicos de la mujer no es recomendable, ya que los productos
de la PCR no siempre pueden reflejar cada una de las muestras individuales en el ADN
agrupado. Por lo tanto, los marcadores específicos del sexo deben ser detectadas
mediante encuestas a los cebadores en 3 machos y 3 hembras individualmente
(GRIFFITHS 2000

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