M.

IDENTIFICACIÓN BACTERIANA EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA
INTRODUCCIÓN

Se presenta una revisión que trata de mostrar de manera somera y lo más concisa posible una
actualización de la metodología que se usa de manera habitual en el laboratorio de
microbiología clínica, con el fin de identificar el agente etiológico responsable de un cuadro
infeccioso. Esta revisión profundiza en tres tipos de metodología: los métodos fenotípicos,
moleculares y otros que han irrumpido recientemente en el laboratorio, y que están basados
en métodos proteómicos.

METODOS FENOTIPICOS

Estos métodos se basan en características observables de las bacterias, como su morfología,

desarrollo y propiedades bioquímicas y metabólicas. El cultivo bacteriano sigue siendo el
método de diagnóstico preferido, ya que permite el aislamiento del microorganismo, su
identificación, la evaluación de su sensibilidad a los antimicrobianos y el análisis
epidemiológico.

En el proceso de identificación bacteriana, la experiencia del microbiólogo es fundamental para

seleccionar pruebas o una batería de pruebas secuencialmente, teniendo en cuenta la
fiabilidad, el género o especie bacteriana a identificar, el origen del aislado y el costo. Se
recomienda que los laboratorios establezcan un proceso de identificación normalizado que
utilice un conjunto de pruebas secuenciales o simultáneas para identificar el microorganismo a
nivel de género y especie.

Se destacan diversas pruebas bioquímicas en esta batería, como las características

microscópicas, características macroscópicas (morfología y hemólisis) y pruebas como la
catalasa, oxidasa, hidrólisis del hipurato, β-galactosidasa, aminopeptidasas, ureasa, indol, entre
otras. También se mencionan pruebas basadas en la resistencia a ciertas sustancias, como
optoquina, bacitracina, solubilidad en bilis y crecimiento en caldo hipersalino.

Existen sistemas o equipos multipruebas en el mercado que permiten una identificación más
rápida de algunas bacterias. Estos sistemas pueden ser manuales o automatizados. Los
sistemas manuales son celdillas con sustrato liofilizado que se inoculan individualmente y
permiten realizar entre 10 y 50 pruebas bioquímicas simultáneamente. Cada especie
bacteriana está definida por un código numérico basado en las reacciones de las pruebas
utilizadas. Ejemplos de sistemas comerciales manuales son API, Enterotube, Oxi/Ferm Tube,
RapID systems y MicroID.

Los sistemas comerciales automatizados también son galerías multipruebas, pero la

inoculación, incubación y lectura se realizan de forma automatizada. Algunos paneles incluyen
sustratos para pruebas bioquímicas y antimicrobianos a diferentes concentraciones, lo que
permite realizar simultáneamente la identificación y el antibiograma del microorganismo. Estos
sistemas automatizados proporcionan una identificación confiable del microorganismo.
Ejemplos de sistemas en paneles comerciales son MicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider y
Phoenix.

METODOS GENOTIPICOS
Problemas con los métodos fenotípicos: Los métodos fenotípicos no proporcionan una
identificación definitiva debido a la falta de concordancia entre las características observables
del aislamiento en estudio y las cepas de la especie tipo. Esto ha llevado a utilizar métodos
genotípicos como complemento o alternativa.

Gen ARNr 16S: Es un marcador molecular ampliamente utilizado en estudios taxonómicos y de

filogenia bacteriana. El ARNr 16S, presente en la subunidad 30S del ribosoma bacteriano, actúa
como un cronómetro molecular debido a su alta conservación. Aunque algunas mutaciones
pueden llevar a resistencia a antimicrobianos, el ARNr 16S sigue siendo útil para la
identificación bacteriana y la asignación de género y especie.

Espacio intergénico del 16S-23S ARNr (ITS): Estas regiones intergénicas presentan diversidad
en diferentes géneros, especies y cepas bacterianas debido a variaciones en el número,
tamaño y composición de las ITS del 16S-23S ARNr. Esto permite utilizar las ITS en la
identificación, filogenia y tipificación bacteriana.

ARNr 23S: Es una alternativa útil cuando la fracción 16S no proporciona resultados
concluyentes. Sin embargo, el uso del ARNr 23S puede ser limitado debido al aumento de
costos y algunas dificultades técnicas en la amplificación de fragmentos más grandes.

Gen rpoB: Este gen codifica la subunidad beta de la ARN polimerasa y se ha propuesto como
un cronómetro molecular de alta potencia. El análisis del rpoB ofrece ventajas sobre el ARNr
16S, como secuencias de mayor calidad y una mayor correlación en la similitud de secuencia
con la hibridación ADN-ADN. Además, el rpoB se utiliza para la genotipificación y filogenia
bacteriana.

Gen gyrB: Codifica la subunidad beta de la ADN girasa o topoisomerasa II, involucrada en la
replicación del ADN bacteriano. La presencia de gyrB en monocopia permite la discriminación e
identificación de especies relacionadas en varios géneros bacterianos. Este gen es útil en la
sistemática bacteriana debido a su tasa de sustituciones sinónimas o silentes, que es al menos
cuatro veces mayor que la del ARNr 16S.

Análisis de secuencias y criterios para la interpretación de resultados

 Las técnicas de identificación molecular en bacterias se basan en la amplificación

genómica y la secuenciación de genes como el 16S ARNr.
 La extracción del ADN cromosómico y la amplificación son procesos críticos en la
metodología de identificación molecular.
 Después de la secuenciación, se analiza el electroferograma para corregir posibles
errores y obtener una secuencia consenso.
 Las bases de datos en línea, como GenBank NCBI, se utilizan para comparar la
secuencia consenso y buscar coincidencias con otras secuencias depositadas.
 Hay varias bases de datos ampliamente utilizadas en el análisis de secuencias del 16S
ARNr, como BIBI, Ribosomal Database Project, Smart Gene IDNS, RIDOM y Ribosomal
Database Project (RDP-II).
 Los criterios para la interpretación de resultados varían, pero generalmente se
considera que un porcentaje de similitud del 98,5% define una especie y tasas del 95%
al 99% definen un género.
 La microheterogeneidad dentro de una misma especie en la secuencia del ARNr 16S
puede tener implicaciones en la virulencia, la especificidad de nicho y los estudios
epidemiológicos.
 El gen rpoB se considera adecuado para la identificación y discriminación filogenética a
nivel de especies y subespecies.
 Se utilizan alineamientos lineales y dendrogramas para comparar y visualizar las
secuencias. Se utilizan diferentes algoritmos, como el método NJ, el método UPGMA y
el método WPGMA.
 Los árboles construidos con secuencias del gen rpoB suelen ser más robustos que los
obtenidos con secuencias del ARNr 16S.

Indicaciones de la identificación molecular

Indicaciones de la identificación molecular: Las técnicas de identificación molecular, como

el análisis del ARNr 16S y el rpoB, son útiles en varias situaciones en la microbiología
clínica, como cuando hay dificultades en el aislamiento de bacterias, crecimiento lento,
resultados bioquímicos poco claros, entre otros. Estas técnicas moleculares son
especialmente útiles en los siguientes casos:

Identificación de cepas poco descritas, de baja frecuencia de aislamiento o

fenotípicamente atípicas.

Identificación de cepas de difícil identificación fenotípica o con crecimiento fastidioso,

como ocurre en las especies de Nocardia y Mycobacterium.

Descripción de nuevos patógenos: El ARNr 16S es ampliamente aplicable en todos los

grupos taxonómicos y es la elección preferida para identificar bacterias desconocidas.

Descripción de nuevas especies: Se recomienda la presencia de diferencias fenotípicas

claras y diferencias en la secuencia de más de 1 pb/100 bases para considerar la existencia
de una nueva especie. Diferencias superiores al 5% podrían indicar la existencia de un
nuevo género.

Importancia del análisis del gen rpoB: El contenido GC del gen rpoB puede estimarse
matemáticamente para determinar el contenido bacteriano GC. Además, la similitud en las
secuencias rpoB se correlaciona significativamente con los valores de hibridación ADN-ADN
(DDH) y con la identidad media en nucleótidos (ANI).

Identificación de bacterias de difícil cultivo: Las técnicas moleculares han sido

exitosamente aplicadas en la identificación de agentes etiológicos en casos de endocarditis
con cultivo negativo, como Bartonella quintana y Coxiella burnetii. Sin embargo, en
muestras con origen no estéril o con flora mixta, estas estrategias pueden no ser eficientes.

Descripción de nuevos patógenos

El gen ARNr 16S es altamente aplicable en todos los grupos taxonómicos para la
identificación de bacterias desconocidas. Es la mejor elección cuando no se tiene
conocimiento previo sobre la bacteria en cuestión.

Para describir una nueva especie, se recomienda buscar diferencias fenotípicas claras y
diferencias en la secuencia de más de 1 pb/100 bases. Si las diferencias son superiores al
5%, podría indicar la existencia de un nuevo género.

Se estima que entre el 10% y el 20% de los aislamientos bacterianos no coinciden con los
microorganismos descritos, lo que sugiere la posibilidad de que sean géneros o especies
nuevas. Sin embargo, en las cepas obtenidas en la práctica clínica, esta frecuencia es
menor.

El análisis del gen rpoB está ganando importancia. Por un lado, el contenido bacteriano de
GC se puede estimar mediante el contenido GC del gen rpoB. Por otro lado, la similitud en
las secuencias del gen rpoB entre dos especies bacterianas se correlaciona
significativamente con los valores de hibridación ADN-ADN (DDH) y con la identidad media
en nucleótidos (ANI).

Identificación de bacterias de difícil cultivo

Como ejemplo, se ha aplicado exitosamente y se ha podido constatar, la presencia de

Bartonella quintana y Coxiella burnetii como principales agentes etiológicos en
endocarditis con cultivo negativo8. Pero en el caso de que la muestra
poseaunorigennoestéril o del medio ambiente, y se presente flora mixta, esta estrategia no
es eficiente.

Desventajas de la identificación molecular

Distintas causas originan una incorrecta asignación de género y especie cuando se realiza
una identificación mediante el análisis de la secuencia y su alineamiento con otras
secuencias. Calidad disminuida de las secuencias depositadas en la base de datos y errónea
asignación de especies. Ya que en la identificación molecular existe una fuerte
dependencia con la precisión de las secuencias depositadas y la idoneidad en la asignación
de especie de esas cepas.

Ausente o baja correlación entre la identificación genotípica y fenotípica:

 Se observa la falta de correspondencia entre la identificación genotípica y fenotípica en

casos como Mycobacterium tuberculosis y M. bovis o M. africanum, Bordetella
pertussis y B. parapertussis, y diferentes especies de Brucella, entre otros ejemplos.

Baja resolución en la identificación mediante ARNr 16S:

 El ARNr 16S puede presentar una baja capacidad de discriminación en algunos géneros
y especies debido a recientes divergencias. En estos casos, se recomienda
complementar la identificación con el estudio de otros genes o pruebas fenotípicas.
Algunos ejemplos incluyen Bacillus, Brucella, Achromobacter, Streptotrophomonas,
Actinomyces, Acinetobacter baumannii-A. calcoaceticus y ciertas micobacterias de
crecimiento rápido.

Presencia de electroferogramas o cromatogramas de ADN mixtos:

 El uso del ARNr 16S como herramienta de diagnóstico se limita a infecciones

monobacterianas, ya que en infecciones polimicrobianas se obtendrían resultados
mixtos. Se han desarrollado estrategias como la electroforesis en gel en gradiente
desnaturalizante o el uso de algoritmos informáticos para resolver estas situaciones.

El análisis del ARNr 16S como herramienta de identificación bacteriana:

 El análisis del ARNr 16S es más certero, sólido y reproducible que los análisis
fenotípicos, resolviendo aproximadamente el 90% de las identificaciones. Sin embargo,
no es infalible y se necesitan bases de datos con secuencias de alta calidad y
recomendaciones específicas para cada género y especie.
Nuevas tecnologías en la identificación molecular microbiana:

 Han surgido técnicas como PCR-multiplex acoplada a un análisis de la temperatura de

melting, pirosecuenciación y espectrofotometría de masas para la identificación
molecular de patógenos. Estas tecnologías permiten la detección de diferentes agentes
etiológicos bacterianos y fúngicos, pero aún tienen limitaciones como la necesidad de
cultivo y el alto costo y carga de trabajo.

La identificación molecular bacteriana y la importancia del análisis del rpoB:

 Se espera que en el futuro las plataformas de identificación molecular bacteriana sean

más eficientes gracias a la aplicación complementaria o en sustitución de otros genes
housekeeping, como el análisis del gen rpoB. Esto contribuirá a una identificación más
eficiente a nivel de género, especie y subespecie, y mejorará la resolución filogenética
del ARNr 16S.

La plataforma PLEX-ID:

 La plataforma comercial PLEX-ID, basada en la amplificación-espectrofotometría de

masas, permite el análisis directo e identificación de microorganismos en muestras,
incluyendo hemocultivos. Ha demostrado buenos resultados incluso en bacteriemias
polimicrobianas y puede utilizarse como un método cuantitativo.

METODO BASADO EN PROTEOMICA

La proteómica se refiere al estudio de las proteínas expresadas por un genoma. Los

métodos más comunes en proteómica son la electroforesis y la espectrometría de masas.
Esta última es una técnica analítica que permite analizar la composición química de manera
precisa. Utiliza iones derivados de moléculas y los separa según su relación masa/carga. La
espectrometría de masas MALDI-TOF es especialmente útil en microbiología para la
identificación rápida y confiable de microorganismos. Permite obtener una "huella
química" de las proteínas y ha demostrado ser efectiva en la identificación bacteriana en
muestras clínicas habituales sin condiciones especiales.

Plataformas comerciales de espectrometría de masas MALDI-TOFpara identificación

microbiana

Las plataformas comerciales de espectrometría de masas MALDI-TOF permiten la

identificación rápida y directa de bacterias sin la necesidad de procedimientos previos
complejos. Estas plataformas se basan en la detección de proteínas ribosómicas y
comparan los perfiles espectrales de bacterias desconocidas con los de bacterias conocidas
en una base de datos. Son rápidas, pudiendo identificar alrededor de 90 microorganismos
por hora, y pueden proporcionar identificaciones a nivel de género y especie. Es
importante utilizar un protocolo estandarizado y comparar los perfiles obtenidos con una
base de datos previa. Algunos ejemplos de sistemas comerciales son MicrobeLynxTM,
MALDI BiotyperTM, AXIMA@SARAMISTM y MS-ID. El objetivo final es determinar el género
y especie del microorganismo, y las plataformas informan al usuario sobre el grado de
confianza de los resultados. Sin embargo, es necesario validar los resultados y tener en
cuenta la naturaleza de la colección de aislamientos y la posibilidad de que un
microorganismo no esté presente en la base de datos.

Ventajas, inconvenientes y limitaciones

existen algunos inconvenientes en esta metodología. Es crucial mantener el vacío
requerido por el espectrómetro, y cualquier incumplimiento de los procedimientos puede
causar demoras en el tiempo de análisis. Se requieren calibraciones y controles de calidad
frecuentes, y los usuarios necesitan recibir una formación adecuada. En cuanto a los
reactivos, la matriz utilizada no es estable por más de 15 días aproximadamente, ya que
cristaliza en el vial, lo que puede ser un inconveniente.

En resumen, la espectrometría de masas MALDI-TOF ofrece ventajas significativas en

términos de identificación rápida y precisa de microorganismos en el laboratorio de
microbiología, pero también presenta desafíos relacionados con el mantenimiento del
equipo, la calibración, la formación de usuarios y la estabilidad de los reactivos.

Las principales limitaciones de la técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF se

pueden clasificar en cuatro puntos:

La relación entre la cantidad de microorganismos y el volumen de la matriz utilizada influye

significativamente en la obtención de resultados precisos. Por lo tanto, es importante
estandarizar el inóculo y la concentración entre el analito y la matriz.

La identificación no depende de si los medios de cultivo son selectivos o no, pero la

antigüedad del cultivo es un factor importante. Se recomienda un máximo de 18-24 horas
de incubación, especialmente para bacterias que forman esporas, acumulan productos
metabólicos o sufren autólisis a medida que envejecen. En el caso de microorganismos
anaerobios, es crucial mantener las condiciones de anaerobiosis hasta el momento de la
inoculación en la tarjeta metálica. Se deben utilizar cultivos puros para obtener resultados
confiables.

Puede haber errores en la identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF en

microorganismos del grupo de los estreptococos viridans y pneumococos. Aunque es
adecuado para enterococos y estreptococos hemolíticos, las especies dentro de estos
grupos son muy similares, lo que dificulta la identificación precisa. Se recomienda
confirmar las identificaciones de S. pneumoniae con pruebas alternativas.

Aunque existen bases de datos comerciales con un amplio número de referencias para la
comparación e identificación de microorganismos, todavía son limitadas. Se necesita un
esfuerzo para ampliar estas bases de datos con un mayor número de cepas que
representen a más especies bien caracterizadas, especialmente en el caso de
micobacterias, nocardias y patógenos oportunistas ambientales.