Cuantificación del gen E2 del papiloma virus humano tipo 16 por PCR anidada en

tiempo real en displasias del cuello uterino en mujeres mayores a 25 años en la

ciudad de La-Paz

2. RESUMEN:

El Virus del Papiloma Humano (VPH) pertenece a un grupo de virus con ADN de doble
cadena, con 35 genotipos capaces de infectar el epitelio de superficies cutáneas en todo
el cuerpo y mucosas del área ano-genital. El genotipo 16 es clasificado como un VPH de
alto riesgo oncogénico y ha sido identificado con más frecuencia en infecciones y
carcinomas cérvico-uterinos. El objetivo planteado en este trabajo fue evaluar la
expresión de los ARNm virales como indicadores de progresión de las lesiones
intraepiteliales (LIE), causadas por VPH 16. Se procedió a la determinación y
cuantificación de los ARNm de los genes virales E2, E6 y E7 mediante el uso de una
prueba de reacción en cadena polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa en
tiempo real (RT-qPCR)

3. DESCRIPCION DEL PROYECTO:

La PCR aninada emplea dos parejas de primers, una externa y otra interna una
característica de esta técnica es que la primera amplificación (20ciclos), el producto se
diluye pudiendo así eliminar inhibidores presentes en la muestra.

3.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:

En la actualidad millones de personas en el mundo sexualmente activas presentan

enfermedades de transmisión sexual. Una de las más comunes es el Virus del Papiloma
Humano (VPH) que se considera la enfermedad de transmisión sexual más común que
existe y contradictoriamente unas de las menos conocidas por las personas.

En el mundo las mayores frecuencias de virus de papiloma humano de alto riesgo

se encuentran en América Latina. el más frecuente en América Latina es el VPH-16.

Estos datos señalaron que la sociedad boliviana afronta una crisis en cuanto a la
educación sexual producto de tabúes, ignorancia y temor que son los principales factores
que favorecen el incremento de esta enfermedad que hoy en día se puede decir que un
gran porcentaje de personas sexualmente activas son portadoras del VPH. Muchas de
ellas sin saberlo ya, que esta enfermedad es silenciosa, llega al organismo sin mayor
ruido y cuando llega es para quedarse de por vida.
1
 Para contrarrestar esta enfermedad el Ministerio de Salud debe efectuar políticas,
planes y programas de salud, implementando estrategias cuyo objetivo primordial es la
lucha de enfermedades a través del personal de salud que trabaja a nivel de la atención
primaria que se basa en la prevención como método, ejecutando actividades informativas
para las comunidades.

Cabe señalar que durante estas consultas se realiza un examen físico e

interrogatorio, no obstante, se toman muestras de secreciones vaginales (citológicas), en
algunos casos se toman muestras de tejido (biopsia); determinando diagnósticos que van
a ser registrados en la morbilidad que lleva la consulta de ginecología. Por todas estas
causas ya nombradas, es primordial que esta población conozca la importancia del
suministro de datos y todos los aspectos relacionados con este virus que cada vez suele
ser mayor por falta de conocimientos adecuados.

¿Cuál es la importancia de la cuantificación del gen E2 del papiloma virus humano tipo
16 por PCR anidada en tiempo real en displasias del cuello uterino en mujeres mayores a
25 años en la ciudad de La-paz?

3.2 MARCO TEORICO

ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN

Antecedentes Históricos del Virus del Papiloma Humano. Descubrimiento del virus

La existencia de los virus se estableció en 1892, cuando el científico ruso Dmitri I.

Ivanovsky descubrió unas partículas microscópicas, conocidas más tarde como el virus
del mosaico del tabaco. En 1898 el botánico holandés Martinus W. Beijerinck denominó
virus a estas partículas infecciosas. Pocos años más tarde, se descubrieron virus que
crecían en bacterias, a los que se denominó bacteriófagos. En 1935, el bioquímico
estadounidense Wendell Meredith Stanley cristalizó el virus del mosaico del tabaco,
demostrando que estaba compuesto sólo del material genético llamado ácido
ribonucleico (ARN) y de una envoltura proteica.

En la década de 1940 el desarrollo del microscopio electrónico posibilitó la

visualización de los virus por primera vez. Años después, el desarrollo de centrífugas de
alta velocidad permitió concentrarlos y purificarlos. El estudio de los virus animales
alcanzó su culminación en la década de 1950, con el desarrollo de los métodos del
cultivo de células, soporte de la replicación viral en el laboratorio. Después, se
descubrieron numerosos virus, la mayoría de los cuales fueron analizados en las
décadas de 1960 y 1970, con el fin de determinar sus características físicas y químicas.

Signos y síntomas.
2
 La mayoría de las personas que tienen infección genital por VPH no saben que
están infectadas. El virus vive en la piel en las membranas mucosas y generalmente la
población infectada es asintomática. A ciertas personas le saldrán verrugas genitales
visibles o presentarán lesiones en el cuello uterino, vulva, ano o pene, en muy contadas
ocasiones la infección suele causar cáncer.

El cambio celular se refiere principalmente a la presencia de células precancerosas

en el cuello uterino o ano, estos cambios pueden ser no evidentes ni causar síntoma
alguno, en cambio son notables los condilomas o verrugas que aparecen en los
genitales. Las verrugas genitales aparecen por lo general como elevaciones o masas
suaves y húmedas, rosadas o de color de la piel, en el área genital. En los actuales
momentos se han identificado cuatro variantes de verrugas: Condilomas acumulados, las
verrugas querostaticas, verrugas populares y verrugas planas.

CICLO VIRAL Y PROGRESIÓN NEOPLÁSICA:

Adsorción, penetración y replicación

Los papilomavirus son especie-específicos, tienen tropismo por células epiteliales, y la

producción de viriones en las células infectadas depende de la diferenciación de las
mismas, dado que requieren de la maquinaria celular para llevar a cabo el ciclo
explicativo. La infección por papilomavirus requiere que las células de la capa basal del
epitelio sean infectadas por lo que se propone que para iniciar la infección debe ocurrir
una lesión o abrasión del epitelio; esta idea se desarrolló por la presencia de proteínas
virales tempranas en las células basales mientras que la expresión de los genes virales
tardíos, la producción de proteínas de la cápside, la replicación del DNA viral y el
ensamble de los viriones ocurren sólo en células completamente diferenciadas de las
capas epiteliales superiores. La unión de los papilomavirus a la membrana celular no se
ha descrito detalladamente. Los viriones parecen unirse a residuos de
glucosaminoglucanas en la superficie de la membrana plasmática (Joyce et al. 1999,
Saeed et al. 2003). La integrina alfa-6 parece ser el principal receptor de VPH16 y la
adsorción es 8 seguida de endocitosis dependiente de clatrina como un evento de
internalización celular.

La proteína L2 interviene en la salida del endosoma y en el transporte del genoma viral al

núcleo celular y una vez ocurrida la infección el virus se establece dentro del núcleo de
las células basales. El DNA viral permanece en estado episomal (circular) fuera de los
cromosomas del hospedero, replicándose en niveles bajos en coordinación con la
división celular.

3
Transcripción:

El mecanismo transcripcional es complejo y no es comprendido completamente debido a

la intervención de múltiples moléculas reguladoras involucradas, a las diferencias
encontradas en los distintos modelos de estudio y las limitaciones técnicas para su
estudio in vitro. La transcripción es unidireccional, requiere una sola cadena de DNA
como molde, depende de la maquinaria transcripcional de la célula eucariota (RNApol II)
y factores que permiten a la enzima reconocer el inicio de la transcripción (caja TATA) y
unirse a la cadena molde, notablemente TFIID y TBP.

La transcripción requiere promotores que se encuentran en la LCR y en los genes E6 y

E7 cuya intensidad de uso es determinada por diversos elementos de regulación que se
unen a sitios específicos.

Promotores tempranos.- El promotor E6 es empleado para iniciar la transcripción viral

con RNApol II, que junto con los factores de transcripción reconoce y se une al promotor
para continuar el proceso de elongación de la cadena de RNA que se transcribe. Los
factores de transcripción que activan a este promotor tienen sitios de unión en regiones
distintas. Sp1 se une en la región larga de control LCR (31 pb corriente arriba del
promotor E6 )

1) alto número de copias del DNA de VPH (el DNA de VPH16 aumenta en órdenes
de magnitud al aumentar el grado de enfermedad cervical)

2) mutaciones que afectan los motivos YY1 en la región larga de control del
genoma de VPH

3) integración del DNA de VPH al genoma celular (el ORF E2, cuyo producto
reprime al promotor P97 de los genes E6 y E7 es interrumpido o destruido
preferentemente durante la integración.

La integración del genoma viral es más frecuente en las lesiones de alto grado y
parece aumentar la velocidad de progresión hacia el cáncer micro invasor.

4
episomal pura de formas mixtas del DNA de VPH16, cuando 40% o más del DNA viral
está integrado con ausencia de E2. El método se basa en la supuesta interrupción
preferente del gen E2 en el caso de integración del genoma viral, que a su vez
provocaría la pérdida de secuencias amplificables del gen E2. El número de copias de los
genes E6 y E2 son equivalentes en las formas episomales; el número de copias del gen
E2 es menor que el de E6 en las formas de DNA de VPH16 concomitantes (integrada y
episomal) y nulo en las formas integradas

3.3 OBJETIVOS:

3.3.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la expresión del gen E2 del papiloma virus humano tipo 16 por PCR anidada en
tiempo real en displasias del cuello uterino en mujeres mayores a 25 años en la ciudad
de La-Paz.

3.3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Aplicar el ensayo de PCR anidada al diagnóstico precoz de VPH en muestras biológicas

cervicales incluidas en el estudio.

Identificar la frecuencia de los genotipos de mayor incidencia VPH 16 en muestras

cervicales de lesiones intraepiteliales de alto grado, mediante PRC anidada.

3.4 Formulación del Problema

FALTA

3.5 Justificación

Las enfermedades de transmisión sexual a pesar de las diversas campañas de

prevención que se llevan a cabo, la cifra aumenta cada día en especial el virus del
papiloma humano (VPH) el cual es uno de los más comunes; por lo tanto, es importante
dar a conocer este virus a todas las personas de ambos sexos que tengan una vida
sexual activa y en especial a los jóvenes que comiencen su sexualidad a una edad
temprana sin ninguna información.

Ante la problemática de la Enfermedad de transmisión sexual, se pretende que este

trabajo cumpla con algunos criterios debidamente ajustados que permita evaluar la
importancia de la investigación.

5
 Este trabajo, aporta conocimientos sobre nuevas alternativas moleculares para evaluar
la expresión de los ARNm virales como indicadores de progresión de las lesiones
intraepiteliales (LIE), causadas por VPH 16. Se procederá a la determinación y
cuantificación de los ARNm de los genes virales E2, E6 y E7 mediante el uso de una
prueba de reacción en cadena polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa en
tiempo real (RT-qPCR)

Del mismo modo, el estudio está plenamente justificado ya que servirá como
fundamento informativo para implementar nuevas técnicas moleculares de este virus
para el diagnóstico precoz en la ciudad de La Paz, Bolivia.

En esta investigación, se quiere dar a conocer la importancia de los genotipos (E2, E6,
E7) del genotipo 16, el cual aportara en la prevención de lesiones severas del cuello
uterino y estimular el desarrollo de nuevos proyectos para os especialistas.

3.6. ALCANCE:
Hasta la actualidad la técnica más utilizada para el diagnóstico de cáncer cervical y
displasia severa es el análisis histopatológico. Sin embargo, con el avance de la
tecnología se han desarrollado técnicas de detección de VPH basados en biología
molecular mediante la PCR anidada, el cual ayudara a tener un rápido y acertado
diagnóstico en mujeres mayores a 25 años que presenten displasias de cuello uterino.
3.7. METODOLOGÍA (EN ORDEN, SEGÚN OBJETIVOS)
Construcción de pEV201
Amplificamos el segmento E2-VPH16 de 1031 pb con la pareja de oligonucleótidos
E2-1F/1R a partir del plásmido pHPV16 que contiene el genoma completo del
prototipo europeo VPH16.
Las mezclas de PCR, de 50 µl, contenían 1 µl de DNA y los siguientes
componentes: MgCl2 4 mM, dNTPs 20 M c/u, mezcla de oligonucleótidos 0.6 µM
(cada uno) y 2.5 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen). El programa del
termociclador incluyó desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, seguida de 40
ciclos con desnaturalización a 94°C por 1 min, annealing a 45°C por 1 min y
extensión a 72°C por 1 min y una extensión final a 72°C por 10 min.
El producto resultante fue ligado a pGEM (Invitrogen) y clonado en
Escherichia coli TOP10. La mezcla de ligación fue preparada en un volumen total
de 10 µl [5 µl de amortiguador de ligación 2×, 1.5 µl de agua, 2 µl de la mezcla de
PCR, 1 µl de DNA ligasa T4 (3U/µl), 0.5 µl del vector pGEM (50 ng/µl)] e incubada

6
 toda la noche a 4°C.

Transformación de E. coli TOP 10 con pEV201

Añadimos 5 µl de la mezcla de ligación a 50 µl de suspensiones de células E. coli
TOP10 (electrocompetentes) que mantuvimos en hielo por 2 min y luego las
electroporamos con un pulso de 25 µF, 400 Ω, 2.5 kV. Inoculamos la mezcla
electroporada en un tubo con 1 ml de caldo LB y la incubamos con agitación
a 37°C por 45 min; después centrifugamos a 12,000×g e inoculamos la pastilla
celular en un matraz con 200 ml de caldo LB que incubamos con agitación a 37°C
toda la noche.
Del cultivo en matraz tomamos 30 ó 50 µl que inoculamos en placas
de agar LB-ampicilina (1 mg/ml) cada una de las cuales había sido hervido a
con
14 µl de X-Gal al 10% y 20 µl de isopropil-β-tiogalactósido (IPTG, 20 mg/ml).

7
Después de incubar toda la noche a 37°C aparecieron colonias blancas (Lac-) o
azules (Lac+).

Detección ultrarrápida de transformantes

Realizamos la detección ultrarrápida del plásmido en seis cepas transformantes
(cuatro Lac– y dos Lac+). La mezcla de lisis de cada muestra contenía 20 µl de
amortiguador de carga 6× (glicerol 30%, xilencianol 0.02%, orange G 0.02%), 3 µl
de SDS 1% y 10 µl de agua. Etiquetamos un tubo Eppendorf (1.5 ml) para cada
muestra, con la punta de la pipeta tomamos la colonia transformante y la
depositamos en el tubo Eppendorf etiquetado, la mezclamos con 33 µl de la
solución de lisis, agitamos con el vórtex por 5 s, luego agregamos 33 µl de fenol-
cloroformo (1:1), centrifugamos a 1500×g, y cargamos 10 µl de la fase acuosa en
un gel de agarosa con bufer de sodio-ácido borico (SB) al 1%. El bufer SB se
compone por borato disodico decahidratado 5mM o hidroxico de sodio 10mM
ajustado a pH: 8.5 con ácido borico. Corrimos el gel por 1 h a 80 V y luego lo
teñimos con bromuro de etidio (1 mg/ml) por 15 min. Adquirimos las imágenes
digitales en el fotodocumentador ChemiDoc EQ (BioRad, Hercules, CA) y
cuantificamos los pixeles con el programa Quantity One (BioRad, Hercules, CA).

Preparación de pEV201
Una asada con una colonia de la clona SL201 AmpR Lac- fue inoculada en 50 ml
de caldo LB-ampicilina e incubada toda la noche a 37°C. La preparación del DNA
(“midiprep”) de pEV201 fue obtenida con el kit PureYieldTM □erviño Midiprep
System (Promega, Madison, WI).
Centrifugamos el cultivo a 10000×g por 10 min, descartamos el
sobrenadante y drenamos el medio de cultivo invirtiendo el tubo sobre una toalla
de papel. Mezclamos la pastilla con 3 ml de solución para resuspensión (Tris-HCl
50 mM, EDTA 10 mM, 100 µg de Rnasa A, pH 7.5). Agregamos 3.0 ml de solución
de lisis (NaOH 0.2 M, SDS 1%) y mezclamos el contenido del tubo
suavemente por inversión 3 a 5 veces. Incubamos 3 min a temperatura ambiente
y agregamos
50 ml de solución neutralizante (clorhidrato de guanidina 4.09 M, acetato de

8
potasio 759 mM, acido acético glacial 2.12 M, pH 4.8), mezclamos el tubo
suavemente 3 a 5 veces y lo dejamos reposar verticalmente hasta observar una
precipitación blanquecina.
Para limpiar el lisado, colocamos una columna azul del kit PureYieldTM en
un tubo Falcon nuevo de 50 ml, añadimos el lisado al interior de la columna e
incubamos 2 min para desprender el resto de las partículas celulares.
Centrifugamos la columna azul a 1500×g por 5 min y colocamos la columna de
unión de color blanco en un tubo Falcon nuevo de 50 ml. Añadimos el filtrado de la
columna azul a la columna blanca y centrifugamos a 1500×g por 3 min. A la
columna blanca agregamos 5 ml de la solución de lavado y removedora de
endotoxinas (fórmula secreta del proveedor) y centrifugamos a 1500×g por 3 min;
la columna fue entonces removida, el líquido fue descartado y luego se vuelve a
inserta en el tubo. Añadimos 20 ml de la solución de lavado en la columna (etanol
60%, acetato de potasio 60 mM, EDTA 0.04mM, Tris-HCl 8.3 mM, pH 7.5) y
centrifugamos a 1500×g por 5 min; la columna es entonces removida, el
líquido fue descartado y luego se volvio a insertar en el tubo. Aplicamos una
centrifugación adicional por 10 min para eliminar el resto de etanol y cubrimos la
tapa con una toalla de papel para eliminar los restos de etanol de la columna.
Para eluir el DNA colocamos la columna blanca en un tubo Falcon nuevo de
50 ml, añadimos 600 µl de agua libre de nucleasas, centrifugamos a 1500×g por 5
min y transferimos el filtrado a un tubo Eppendorf de 1.5 ml. El DNA de
pEV201 fue cuantificado en el fluorómetro GENios (TECAN, San Jose, CA)
acoplado a una computadora con el programa □erviño□ 4, empleando el kit
PicoGreen dsDNA Quantitation (Molecular Probes, Eugene, OR). En una
microplaca FIA negra de 96 pozos (Greiner Bio-one, Frickenhausen, Alemania)
fueron colocados 198 µl de la solución de ensayo (PicoGreen 1:400 en TE 1×) y 2
µl de DNA estándar o de cada muestra problema. El contenido de DNA de los
problemas fue calculado por interpolación en la curva tipo derivada de pozos que
contenían 5, 10, 25 ó 50 ng de DNA del fago λ.

9
 Condiciones de amplificación de E2-1031 y E2-177
En mezclas de PCR convencional directa ensayamos concentraciones variables
de MgCl2, dNTPs y oligonucleótidos y un gradiente de temperatura de annealing
para determinar las condiciones para maximizar la amplificación de los productos
E2-1031 y E2-177.
En el caso de E2-1031 probamos MgCl 2 1 a 4 mM, dNTPs 20 a 80 µM, y
oligonucleótidos 0.08 a 0.12 M e incubamos las mezclas de PCR a temperaturas
de annealing en el rango de 44 a 49°C. Para E2-177 probamos MgCl 2 1 a 5 mM,
dNTPs 0.02 a 0.012 mM, y oligonucleótidos 0.06 a 0.14 M e incubamos las
mezclas a temperaturas de annealing en el rango de 56 a 62°C. El programa del
termociclador para ambos productos consistió en desnaturalización inicial a 94°C
por 3 min, seguida de 25 ciclos de desnaturalización a 94°C por 1 min, annealing
(45°C para E2-1031 y 59°C para E2-177) por 1 min y extensión a 72°C por 1 min,
seguida de extensión final a 72°C por 5 min.
Los productos de PCR fueron visualizados □erviño□ la electroforesis de
muestras de 10 µl en geles de SB-agarosa al 1.5% (Jonathan et al. 2004) seguida
de tinción con bromuro de etidio por transiluminación con luz ultravioleta y
registramos las imágenes digitales en un fotodocumentador ChemiDoc EQ
(BioRad, Hercules, CA). Los pixeles de las bandas principales de cada
experimento fueron cuantificados con el programa Quantity One (BioRad,
Hercules, CA).

Amplificación de E2-1031
Usamos 1 µl de pEV201 (92.5 ng/µl) lineal o intacto como molde para la
amplificación de E2-1031. La mezcla de PCR contenía MgCl 2 1 mM, dNTP 40 µM
(c/u), oligonucleótidos E2-1F/1R 0.1 M (c/u), amortiguador de PCR 1× y 2.5 U de
Taq DNA polimerasa (Invitrogen). El programa del termociclador constó de
desnaturalización inicial a 94°C por 3 min, 25 ciclos de desnaturalización a 94°C
por 1 min, annealing a 45°C por 1 min, extensión a 72°C por 1 min y
extensión final a 72°C por 5 min.

Amplificación de E2-177

10
Diluimos 1:10 la mezcla con el producto E2-1031 y añadimos 1 µl como
molde para la reacción anidada de E2-177. La mezcla contenía MgCl 2 1 mM,
dNTP 0.06 mM (c/u), oligonucleótidos E2-2F/2R 0.12 M (c/u), amortiguador de
PCR 1× y 2.5 U de Taq DNA polimerasa. El programa del termociclador constó de
desnaturalización inicial a 94°C por 3 min, 25 ciclos con desnaturalización a 94°C
por 1 min, annealing a 59°C por 1min, extensión a 72°C por 1 min y extensión final
a 72°C por 5 min.

Calibración de la PCR-TR anidada

Preamplificación
En la primera reacción (PCR1) usamos la pareja de oligonucleótidos E2-1F/1R con
las condiciones establecidas por 15 ciclos con 0.096 ngde DNA de pEV201
(equivalentes a 2.1×107 copias). El programa del termociclador consistió en
desnaturalización inicial a 95°C por 3 min seguido por 15 ciclos con
desnaturalización a 95°C por 15 s, annealing a 45°C por 30 s y extensión a 72°C
por 1min.

11
Calibración de la PCR-TR anidada
Con las mezclas de la PCR1 preamplificadas preparamos diluciones
logarítmicas seriadas de las cuales añadimos 1 µl a las mezclas de PCR-TR
anidada (PCR2) equivalentes a 2.1×104-2.1×107 copias originales de
pEV201 como molde para amplificar el producto E2-177. El programa del
termociclador en tiempo real constó de desnaturalización inicial a 95°C por 2
min, seguido de 35 ciclos con desnaturalización a 95°C por 15 s, annealing a
59°C por 30 s y extensión a 72°C por 1 min, con una extensión final a 72°C
por 5 min.

Perfil de extinción de la fluorescencia

Para obtenerlo, a partir de 60°C programamos en el iCycler iQ Multicolor
Real- Time PCR Detection System, el aumento de temperatura de 0.5°C
cada 30 sundos por 72 veces hasta alcanzar 96°C.

Cuantificación del número de copias del gen E2-VPH16

El número de copias fue calculado por interpolación del valor de Ct de las
muestras problema con la ecuación de la recta resultante de la familia de
curvas tipo.

Incubación y fluorometría
Las incubaciones y la detección de las mezclas de PCR-TR tiempo real
seran realizadas en el iCycler iQ con ayuda del Optical System software
versión 3.1 (Bio- Rad).

12
13
3.7 CRONOGRAMA (DIAGRAMA GANTT)

0 0 0 1
Actividades Inicio Final 02 03 05 06 08 09 10 12
1 4 7 1
1.- Elaboración propuesta de Proyecto. 29/4/2022 4/5/2021                        
2.- Revisión y Aprobación de la
5/5/2022 6/5/2021
Propuesta.                        
3.- Evaluación de los pacientes 7/5/2022 9/5/2021                        
4.- valoración de la población 10/5/2022 16/5/2021                        
5.- compra de materials 17/5/2022 17/7/2021                        
6.- adq 18/7/2022 25/7/2021                        
7.- toma de muestra 26/7/2022 1/8/2021                        
8.- procesamiento de muestra 2/8/2022 15/8/2021                        
9.- Revisión de los resultados 16/8/2022 22/8/2021                        
10.- Desarrollo del proyecto 23/8/2022  22/8/2022                        
11.- diagnóstico de pacientes 24/8/2022 31/8/202                        
24/8/202
12.- conclusión del proyecto 31/8/2022
2                        
                         
3.8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA

 4. Lupiani Castellanos MP y Fraga Hernández ME. Vacunas del Papiloma

Humano: Se amplía el calendario vacunal. Canar Ped.Enero-Abril 2008;
32(1): Disponible
en: http://www.comtf.es/pediatria/Bol_2008_1/Papiloma_Humano_vacuna_P
Lupiani.pdf

 5. Zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical

application. Nat Res Cancer. 2002 may; 2(5):342-50. Disponible
en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12044010

 6. Jung WW, Chun T, Sul D, Hwang KW, Kang HS, Lee DJ, Han IK.
Strategies against human papillomavirus infection and cervical cancer. J
Microbiol. 2004 Dec; 42(4):255-66. Disponible
en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15650698

 7. Castro-Jiménez Miguel Ángel, Vera-Cala Lina María, Posso-Valencia

Héctor Jaime. Epidemiología del cáncer de cuello uterino: estado del arte.
Rev Colomb Obstet Ginecol  [serial on the Internet]. 2006  Sep [cited]; 57(3):
182-189. Available from: http://www.scielo.org.co/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0034-74342006000300006&lng=en

 8. Burchell AN,Winer RL, De Sanjosé S, Franco E. Epidemiology and

transmission dynamics of genital HPV infection. Vaccine. 2006; 24 (Suppl)
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 9. Baseman JG, Koutsky LA. The epidemiology of human Papillomavirus

infections. J Clin Virol. 2005 Mar;32 Suppl 1:S16-24. Disponible
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 10. Frazer IH. Prevention of cervical cancer through papillomavirus

vaccination. Nat Rev Immunol. 2004 Jan; 4(1):46-54. Disponible
en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14704767

 11. Doorbar J. Eventos del ciclo vital del VPH y selección de biomarcadores.
HPV Today. Feb 13,  2007; No 10: Disponible
en: http://www.seap.es/bibliografia/HPVToday/HPVToday010SEAP.pdf

4. EQUIPO DE TRABAJO:

Númer NOMBRE RESPONSABILIDAD EN EL

o PROYECTO
1 Elizabeth Castillo Vaca
2 Marisabel Leyva Galvan 15
3 Jhonny Roberto Martinez Galvan
4 Guadalupe Gladys Machicado
Mamani
5 Noemi Quiroga Linarez
6 Brayan Gabriel Mercado Michel

16