RESUMEN

SEMANA 7 DE MICROBIOLOGÍA

TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PRIMARIAS

Procesamiento de muestras para Hemocultivo

Recomendaciones:
-Volumen de muestra de sangre:
 En adultos de 20 mL a 30 mL (Mínimo 10 mL por punción).
 En neonatos de 1 mL a 2 mL.
 De 1 mes a 2 años: 2 mL a 3 mL.
 Mayor a 2 años: 3 mL a 5 mL.
 Adolescentes: 10 mL a 20 mL.

Procedimiento:
-Lavado de manos con antisépticos.
-Uso de guantes estériles.
-Desinfección de la piel con alcohol 70 y con iodo.
-Desinfectar frasco con alcohol 70.
-Inocular los frascos y agitar suavemente.
-Remover iodo con alcohol 70.
-Enviar muestra al laboratorio.
-No se aconseja incubar la muestra a 35°C o 37°C.
-No se debe refrigerar la muestra.
-En caso de no usarse la muestra de una vez, se puede mantener a temperatura ambiente.

Procesamiento de Catéteres
Materiales
-Agar Sangre de Carnero.
-Solución Salina (SSE).
-Bisturí.
-Medios de cultivo alternativo (manitol sal, mac Conkey, tayer martin).

Los catéteres son las vías que se van a poner en yugulares. La punta del catéter es lo que queda dentro
de la vena. Cuando hay una colonización del catéter, cada vez que se pasen por el catéter medicamentos,
está introduciendo bacterias a nivel sanguíneo que se van a ir reproduciendo, entonces el paciente

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puede tener picos de fiebre. Cuando el médico tiene sospecha de que la infección se da por una
colonización del catéter, el médico indica que se tome una muestra de sangre periférica y una muestra
del catéter. Si la botella que sale positiva es la del catéter y la botella de sangre periférica sale negativa,
entonces uno asume que el catéter está colonizado. Entonces el médico extrae el catéter lo manda al
laboratorio y ese catéter es el que se va a trabajar. Si ambos tubos salen positivos, se asume que el
catéter está contaminado y que la sangre periférica también está contaminada.

Procedimiento
-Permite recuperar microorganismos de la superficie interna y externa del catéter.
-Colocar el segmento del catéter en un tubo estéril con 1 mL de solución salina al 0.85%, agitar en un
vórtex (homogenizar) por un minuto.
-Hacer diluciones seriadas 1/100 y 1/10.000, colocando 100 uL del tubo original en 9.9% de solución
salina. Y 100 uL de este tubo a otro con 9.9% de solución salina.
-Colocar en dos placas de Agar Sangre de Carnero (100 uL cada una) de las diluciones anteriores y
enumerarlas: 1 y 2.
-Rayar las placas completamente en tres direcciones diferentes.
-Incubar las placas a 35°C o 37°C en atmósfera enriquecida con Dióxido de Carbono (𝑪𝑶𝟐 ).

Procesamiento de Líquido Cefalorraquídeo (LCR)

-La muestra se toma por medio de punción lumbar.
-Es una muestra muy delicada y prioritaria (no se puede echar a perder).

Materiales
-Agar Tioglicolato.
-Agar Sangre de Carnero.
-Agar Chocolate.
-Agar Mac Conkey.
-Agar Manitol Sal.
-Agar Tayer Martin (Opcional).
-Tinción de Gram para ver si se encuentran bacterias.
-Se le hace una Tinta China para ver que no haya hongos.
-Cámara de Neubauer para hacer un recuento.
-Incubadora de 35-37°C.
-Frasco con candela y humedad (Agar sangre y agar chocolate).

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Procesamiento de LCR
-El líquido se envía a la sección de química para que se le haga un recuento de glucosa y de proteínas
para saber si se tiene una infección viral o bacteriana.
-También se manda el líquido a hematología para ver si hay recuento de células hematológicas.
-La muestra se debe analizar físicamente:
 Volumen.
 Apariencia (transparente, no transparente, turbio).
 Color (rojizo, amarillento).
 Xantocromía: Es un color rojizo que se puede encontrar en la muestra del líquido cefalorraquídeo,
y se puede deber a que la punción haya sido traumática o porque haya habido una fuga de
glóbulos rojos o sangrado a nivel del sistema nervioso central.
-Inocular dos tubos de Tioglicolato.
-En la cámara de Neubauer se realiza el conteo de leucocitos, eritrocitos y crenocitos.
-Centrifugar a 15 minutos entre 2500 y 3000 rpm (revoluciones por minuto).
-Con el sedimento realizar tinciones:
 Tinción de Wright para ver monocitos y neutrófilos.
 Tinta China para descartar hongos, levaduras o histoplasma.
 Tinción de Gram.
-Dejar secar al aire y fijar la extensión en llama.
-Se puede utilizar la fijación por metanol durante 1 minuto.

Procedimiento:
-Cultivar por goteo (5 gotas al agar y se raya) y rayado solo los que presentan ≥10 PMN/𝐦𝐦𝟑 .
-Se incuban los medios a 35-37°C por 24 a 48 horas. Las placas agar sangre, agar chocolate y agar Tayer
Martin se incuban en atmósfera de dióxido de carbono de 2 a 5% y en humedad.
Nota: Cuando los líquidos cefalorraquídeos tienen concentración de proteínas >100 mg/dL y predominio
de linfocitos, se deben cultivar en TB (es un cultivo para detectar bacilos alcohol-ácido resistentes o
tuberculosis).

Interpretación del Gram

 Diplococos Gram (-) dispuestos en parejas como granos de café: es bacteria Neisseria
meningitidis).
 Cocobacilos Gram (-) de diferentes formas: es bacteria Hemophilus influenzae.
 Cocos Gram (+) en forma ovalada, dispuestos en parejas con halo claro alrededor, o en cadenas
cortas: es bacteria Streptococcus pneumoniae en LCR y Streptococcus pyogenes en otros
fluídos.
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  Bacilos Gram (-) típicos: son enterobacterias o Pseudomonas spp.

Interpretación de Ziehl-Neelsen:
 Bacilos Alcohol-Ácido Resistentes (BAAR+): son bacterias Mycobacterium tuberculosis.

Nota: la presencia de bacterias en los frotis es de reporte inmediato.

Procesamiento de muestras de otros fluidos biológicos estériles

Tipo de Muestra:
-Líquido ascético o líquido peritoneal.
-Líquido pleural.
Líquido de pericardio.
-Líquido sinovial o articular.

Materiales:
-Medios de cultivo primario: agar sangre, chocolate, mac Conkey, manitol sal, Tioglicolato (opcional
tayer martin).
-Colorantes para tinción de gram.
-Tinción de Wright.
-Colorantes para tinción de Ziehl-Neelsen.
-Ácido Acético al 5% para líquido articular.
-Agar Saboreaud y Agar Mycosel.

Procedimiento:
-Medios de Cultivo recomendados:

Nota: si el médico sospecha de Neisseria gonorrhoeae, el líquido sinovial se cultiva además en agar
Tayer Martin (ATM). Si se pide por hongos, los líquidos se cultivan en agares Saboreaud y Mycosel.
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-Procesar la muestra en LCR tan pronto como se recibe.
-Indicar el volumen, apariencia.
-En líquido articular registrar coágulos de mucina y cristales (si se observan).
-Preparar cámara de Neubauer cuando la muestra no esté coagulada.
-Se trabaja (inocula) en agar sangre y chocolate según sean los diferentes tipos de muestra (2 o 3 gotas)
y rayar para aislar.
-Incubar hasta por 37°C en CO2 en jarra con candela por 24-48 horas. Si hay mezcla de microorganismos,
se cultiva además en Mac Conkey y Manitol Sal.
-Centrifugar el fluido para hacer las diferentes tinciones del sedimento y reportarlas.
-Inocular de 10 mL de la muestra en una botella para hemocultivo.

Muestras del tracto respiratorio superior (TRS)

Otitis Media Aguda
-La muestra que se recibe es por un aspirado, realizado por timpanocentesis (se perfora el tímpano).
-Realizar un frotis de Gram.
-Los cultivos se hacen en agares: sangre, chocolate, mac Conkey y manitol sal.
-Agregar caldo de Tioglicolato.
-Se incuba con CO2 a 35-37°C hasta por 48 horas.
-Si la muestra trae la indicación de procesarla por hongos, debe realizarse el frotis directo, cultivando
en agar Saboreaud (Asab) e incubar a temperatura ambiente.

Otitis Externa
-La muestra se recibe en dos torundas.
-Cultivar en agares sangre, chocolate y manitol sal.
-Incuban a 35-37°C por 24-48 horas en atmósfera de CO2.

Sinusitis Aguda
-Se recibe la muestra tomada en jeringa por aspiración.

Tinción de Gram
-Revisar la presencia de células inflamatorias y bacterias.
-Cultivar en agares: sangre, chocolate, Tioglicolato.
-Incubar de 35-37°C durante 24-48 horas en atmósfera CO2.
-Además se siembra para anaerobiosis: Agar Sangre y Agar Chocolate, incubar en jarra con sobre Gas
Pak o tubo PRAS.

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-En el caso de sospechas de levaduras (hongos), extender la incubación de los medios para hongos
(Saboreaud y Mycosel) hasta por 30 días a temperatura ambiente.

Muestras del Tracto Respiratorio Inferior (TRI)

-Las muestras se deben de procesar en una cabina de bioseguridad (debido a infecciones respiratorias).
-Procesar las muestras lo más rápidamente posible.
-Seleccionar la porción más purulenta o sanguinolenta de la muestra para los frotis y cultivos.

Muestras No Broncoscópicas
-Esputo.
-Secreciones traqueales.
-Biopsia de pulmón.

Muestras Broncoscópicas
-Secreciones bronquiales.
-Lavado broncoalveolar (BAL).
-Cepillado bronquial protegido (CEP).
-Biopsia transbronquial.

Materiales
-Solución Salina (SSE).
-Agares sangre, chocolate, mac Conkey, manitol sal.
-El Tioglicolato (no para esputos).
-Disco de Optoquin (opcional).
-Jarra con candela y humedad.
-Microscopio.
-Centrífuga (no para esputos, ya que puede generar aerosoles).

Procedimiento
-El esputo no debe permanecer más de una hora a temperatura ambiente sin ser procesado.
-Hacer frotis con solución salina para evaluar leucocitos y macrófagos.
-Se debe hacer la tinción de Gram para reportar microorganismos, neutrófilos y células epiteliales.
-La parte más purulenta es la que se utiliza para hacer los rayados en los diferentes medios de cultivo.
Los rayados se realizan con el asa bacteriológica, dividiendo la zona en tres o cuatro partes, haciendo
una o dos cortadas de un centímetro y tocando el fondo del medio para incrementar la hemólisis (agar
sangre únicamente).

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-Introduzca la placa de agar sangre y agar chocolate en el frasco con candela poniendo una toalla de
papel húmeda por debajo, enriquecido con atmósfera de CO2.
-Incubar placas de 35 a 37°C por 24 a 48 horas.

Métodos Opcionales
-Depositar un disco de bacitracina de 10 microgramos (ug) entre el primer y segundo cuadrante de la
placa de agar chocolate para inhibir la flora del tracto respiratorio superior y mejorar la detección de
Haemophilus spp.
-Depositar un disco de Optoquin en el segundo cuadrante del agar sangre, para demostrar la inhibición
del crecimiento alrededor del disco de Streptococcus pneumoniae.
-La evaluación adecuada de Gram de la muestra es crítica para asegurar que sólo se procesan muestras
de calidad.
-Las muestras que presenten criterios de Gram no aceptables deberían de cultivarse solo para la
búsqueda de patógenos indudables como Mycobacterium tuberculosis, Histoplasma capsulatum,
Coccidioides immitis, Legionella.

(*) Tratar de aislar el morfotipo predominante visto en el Gram, realizar ID y PSA. Si no se puede reaislar
el germen predominante, informar el Gram, hacer hincapié en el predominio e informar FON.
FON = Flora Orofaringea Normal.

Secreciones traqueales o bronquiales

-El cultivo del aspirado traqueal (AT) y las muestras obtenidas por técnicas ciegas deben procesarse
por el método de Diluciones seriadas cuantitativa.
Procedimiento:
-Mezclar partes iguales de secreciones y de N-acetil cisteína al 1%.
-dejar en contacto durante un minuto.

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-Realizar una dilución: 1/100 (100 uL en 9.9 mL de solución salina).
-Agregar dos diluciones más: 100 uL en 9,9 mL de solución salina de la anterior y 100 uL de esta en 9,9
mL de solución salina.
-Sembrar 100 uL de cada dilución en agares Sangre, Chocolate, Mac Conkey y manitol Sal.

Cultivos Cuantitativos de muestras de BAL y/o CEP

Principio:
-Estos cultivos cuantitativos se emplean en pacientes de Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) para el
diagnóstico de neumonía:
 Asociada a ventilación mecánica asistida.
 En pacientes con fibrosis quística.
 Sospecha de tuberculosis en ausencia de esputo.
Procedimiento:
Método de Dilución Seriada
-CEP:
 La muestra se recibe en 1 mL de solución salina o Tioglicolato, agitar en vórtex por 1 minuto.
 Sembrar 100 uL en cada placa estriando al centro y luego en zig-zag (dilución 1/10).
 Realizar otra dilución: 1/100 (100 uL del anterior en 9.9 mL de solución salina) y sembrar 100 uL
igual a la dilución 1/10.
 Incubar por 24-48 horas con CO2 a 37°C.
-LBA:
 Sembrar 100 uL en cada placa estriando al centro y luego en zig-zag (dilución 1/10).
 Realizar otra dilución: 1/100 (100 uL del anterior en 9.9 mL de solución salina) y sembrar 100 uL
igual a la dilución 1/10.
 Incubar por 24-48 horas con atmósfera de CO2 al 5%-10%, a 37°C.

Interpretación del Gram:

-Centrifugar 1500-2000 rpm de 10 a 15 minutos y preparar con el sedimento los frotis necesarios.
-Si se cuenta una cantidad mayor a 300 elementos entre macrófagos, células epiteliales y neutrófilos, se
considera una muestra contaminada con secreciones respiratorias de vías superiores.

Procesamiento de Cultivo de Médula Ósea

Materiales:
-Agar sangre, chocolate y Tioglicolato.
-Agar Saboreaud, Agar Mycosel y agar Lowenstein-Jensen (LJ).

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Procedimiento:
-Se reciben 2 placas de agar sangre con la muestra inoculada por el médico.
-Utilizar una placa para realizar los sub-cultivos y la otra placa se quedará intacta por lo que es
importante identificarla como “Testigo”.
-Sub-cultivar las placas en los medios descritos en materiales.
-Realizar frotis para hongos, microbacterias y bacterias.
-Incubar placas a 37°C con CO2.

Interpretación del Gram:

-Centrifugar 1500-2000 rpm de 10 a 15 minutos y preparar con el sedimento los frotis necesarios.
-Si se cuenta una cantidad mayor a 300 elementos entre macrófagos, células epiteliales y neutrófilos, se
considera una muestra contaminada con secreciones respiratorias de vías superiores.