Enzimología diagnóstica

Las enzimas son proteínas biológicas específicas que catalizan las reacciones
bioquímicas sin alterar el punto de equilibrio de la reacción o ser consumidas o
experimentar algún cambio de composición. Las enzimas, que se encuentran en
todo el tejido corporal, aparecen con frecuencia en el suero después de una lesión
celular o, en ocasiones, en cantidades más pequeñas, de células degradadas.
Ciertas enzimas como las encargadas de la coagulación son especificas del plasma
por lo que se encuentran en concentraciones significativas. Como proteína, cada
enzima contiene una secuencia de aminoácidos específica (estructura primaria),
con las cadenas polipeptídicas resultantes retorciéndose (estructura secundaria),
que luego se pliega (estructura terciaria) y da como resultado en cavidades
estructurales. Si una enzima contiene más de una unidad polipeptídica, la estructura
cuaternaria se refiere a las relaciones espaciales entre las subunidades. Cada
enzima contiene un sitio activo, a menudo una cavidad sin agua, donde la sustancia
sobre la que actúa la enzima (el sustrato) interactúa con residuos de aminoácidos
cargados en particular. Un sitio alostérico, una cavidad que no sea el sitio activo,
puede unirse a moléculas reguladoras y, por lo tanto, ser significativo para la
estructura enzimática básica.
Aunque una enzima mantenga la misma función catalítica en todo el cuerpo, esa
enzima puede existir en diferentes formas dentro del mismo individuo, las diferentes
formas se pueden diferenciar entre sí por ciertas propiedades físicas como la
movilidad electroforética, solubilidad o la resistencia a la inactivación. Además de la
estructura básica de la enzima, una molécula no proteíca llamada cofactor puede
ser necesario para la actividad de la ezima. Los cofactores inorgánicos como iones
cloruro o magnesio se llaman activadores. Una coenzima es un cofactor inorgánico
tal como nicotinamida adenina dinucleotido (NAD). Cuando se une fuertemente a la
enzima la coenzima se llama grupo prostético.
La porción de enzima (apoenzima es decir la parte proteica), con su respectiva
coenzima, forma un sistema completo y activo, una holoenzima. Algunas enzimas,
en su mayoría enzimas digestivas, se secretan originalmente del órgano de
producción en una forma estructuralmente inactiva, llamada proenzima o zimógeno.
Otras enzimas posteriormente alteran la estructura de la proenzima para hacer que
los sitios activos estén disponibles al hidrolizar residuos de aminoácidos específicos.
Este mecanismo evita que las enzimas digestivas digieran su lugar de síntesis. La
Enzyme Commisision (EC) de la IUB adoptó un sistema de clasificación para
estandarizar la nomenclatura que defina el sustrato en el que actúa, la reacción que
cataliza y posiblemente el nombre de la coenzima que participa en la reacción.
Además, mediante un código numérico que contiene cuatro dígitos separados por
puntos decimales el primer digito coloca a la enzima en una de las seis clases:
 1. Oxidorreductasas: Catalizan una reacción de oxidación-reducción entre dos
sustratos.
2. Transferasas: Catalizan la transferencia de un grupo distinto al hidrógeno de
un sustrato a otro.
3. Hidrolasas: Catalizan la hidrólisis de varios enlaces.
4. Liasas: Catalizan la eliminación de grupos de sustratos sin hidrólisis, el
producto contiene enlaces dobles.
5. Isomerasas: Catalizan la interconversión de isómeros geométricos, ópticos y
posicionales.
6. Ligasas: Catalizan la unión de dos moléculas de sustrato, junto con la rotura
del enlace pirofosfato en trifosfato de adenosina (ATP) o un compuesto
similar.

Cinética enzimática.

Una reacción química puede ocurrir espontáneamente si la energía libre o la energía

cinética disponible es mayor para los reactivos que para los productos. Una forma
de proporcionar más energía para una reacción es aumentar la temperatura y
aumentar así las colisiones intermoleculares; sin embargo, esto normalmente no
ocurre fisiológicamente.
Las enzimas catalizan las reacciones fisiológicas al disminuir el nivel de energía de
activación que los reactivos (sustratos) deben alcanzar para que ocurra la reacción.
La relación general entre una enzima, sustrato y producto se puede presentar como
sigue:
E + S ≈ ES ≈ E+ P
Las diferentes enzimas son específicas para sustratos, algunas exhiben
especificidad absoluta lo que significa que la enzima solo se combina con un solo
sustrato y cataliza solo la reacción correspondiente.
La velocidad a la que procede una reacción enzimática depende de varias
condiciones.

Factores que afectan las reacciones enzimáticas

Concentración de sustrato: Según Michaelis y Menten el sustrato se une fácil con

la enzima libre a una concentración de sustrato baja. Con la cantidad de enzima
mayor que la cantidad de sustrato, la velocidad de reacción se incremente de forma
estable a medida que se agrega más sustrato. La reacción sigue una cinética de
primer orden porque la velocidad de reacción es directamente proporcional a la
cantidad de sustrato. Sin embargo, en algún momento la concentración de sustrato
es bastante alta para saturar toda la enzima disponible y la velocidad de reacción
alcanza su máximo. Cuando se forma el producto la enzima libre resultante se
combina de inmediato con el exceso de sustrato libre, la reacción está en cinética
de orden cero, y a velocidad de reacción depende solo de la concentración de
enzima. La constante de Michaelis-Menten es una expresión de la relación entre la
velocidad de una reacción y la concentración de sustrato. El paso que limita la
velocidad es la formación de producto y enzima a partir del complejo enzima
sustrato (ES), entonces se fija la velocidad máxima y a velocidad de reacción es
una función de sólo la concentración de enzima. La constante de Michaelis-Menten
es específicamente la concentración de sustrato a la que la enzima produce la mitad
de la velocidad máxima posible.
Concentración de enzima: Tan pronto como la concentración de sustrato excede
la concentración de la enzima, la velocidad de la reacción es proporcional a la
concentración de enzima, mientras más alta sea la concentración de enzima la
reacción procederá con más rapidez porque más enzima está presente para unirse
al sustrato.
pH: Los cambios de pH pueden desnaturalizar una enzima o afectar su estado
iónico, lo que da como resultado cambios estructurales o un cambio en la carga de
un residuo de aminoácido en el sitio activo, por lo tanto, cada enzima opera dentro
de un rango de pH específico, la mayor parte de reacciones enzimáticas fisiológicas
ocurren en el intervalo de pH de 7.0 a 8.0.
Temperatura: Al subir la temperatura se incrementa la velocidad de reacción
porque aumenta el movimiento de las moléculas, la tasa a la que ocurren las
colisiones intermoleculares y la energía disponible para la reacción. Esto hasta que
la temperatura es suficientemente alta para desnaturalizar a composición proteica
de la enzima, por cada 10 grados, la velocidad aumenta el doble hasta que por
supuesto se desnaturaliza la proteína. La temperatura óptima por lo regular es
cercana a la del medio fisiológico de la enzima, sin embargo puede ocurrir cierta
desnaturalización a la temperatura fisiológica humana de 37 oC, la tasa de
desnaturalización normalmente es significativa de 40 – 50 oC. A temperaturas bajas
se vuelven reversiblemente inactivas, no obstante, la congelación y descongelación
repetida tienden a desnaturalizar la proteína. Debido a su sensibilidad a la
temperatura se deben analizar bajo estrictas condiciones controladas.
Cofactores: Son entidades no proteicas que se deben enlazar con enzimas
particulares antes de que ocurra una reacción. Los activadores comunes (cofactores
inorgánicos) son metálicos (Ca2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, K+) y no metálicos
(Br- y Cl-). Este puede ser esencial para la reacción o solo incrementar la velocidad
de reacción (activador en exceso puede inhibir reacción). Algunas coenzimas
(cofactores orgánicos) son fosfatos de nucleótidos y vitaminas.
Inhibidores: Los inhibidores competitivos se unen físicamente con el sitio activo de
la enzima y compiten con el sustrato por este. Con una concentración mayor de
sustrato que de inhibidor, la inhibición es reversible ya que hay mayor probabilidad
que el sustrato se una al sitio activo de la enzima. Un inhibidor no competitivo se
une con un enzima en un lugar distinto al sitio activo por lo que mayor concentración
de sustrato no invierte la inhibición. Este se puede unir cuando está sin sustrato o
cuando se ha formado el complejo enzima sustrato este último no dando producto.
Cada una de las tres clases de inhibición es única con respecto a los efectos de las
reacciones enzimáticas de velocidad máxima y la Km. En la inhibición competitiva
el efecto del inhibidor se contrarresta si se añade exceso de sustrato para unirse a
la enzima, la cantidad de inhibidor es insignificante entonces por comparación la
reacción procederá menos rápido, pero con la misma velocidad que una reacción
inhibida. Sin embargo, debido que la cantidad de sustrato necesaria para lograr una
velocidad particular es mayor en presencia de un inhibidor competitivo, la Km al
parecer aumenta al mostrar el efecto del inhibidor. El inhibidor puede inactivar ya
sea un complejo ES o solo la enzima causando cambios estructurales en esta.
Incluso si el inhibidor se une de forma reversible y no desactiva la enzima, la
presencia del inhibidor cuando se une a la enzima disminuye la velocidad de
reacción. Por tanto, por inhibición competitiva, no se puede lograr la velocidad de
reacción máxima. Incrementar las concentraciones de sustrato no tiene efecto en el
enlace de un inhibidor no competitivo de modo que la Km no cambia.

Medición de la actividad enzimática.

Debido a que las enzimas normalmente están presentes en pequeñas cantidades

en los líquidos biológicos y con frecuencia es difícil aislar de compuestos similares,
un método conveniente para cuantificarlas es la medición de la actividad catalítica.
Entonces la actividad se relaciona con la concentración. Si la cantidad de sustrato
y cualquier coenzima está en exceso la cantidad de producto dependerá solo de la
concentración de enzima presente para catalizar la reacción. Por tanto, las
concentraciones de enzima son ejecutadas siempre en cinética de orden cero.
Cualquier coenzima también debe estar en exceso. El NADH absorbe luz a 340 nm
mientras que que el NAD, no lo hace y se mide con facilidad un cambio en la
absorbancia a 340 nm. Al efectuar una cuantificación enzimática de orden cero, no
debe haber inhibidores y es necesario controlar de manera cuidadosa otras
variables como: temperatura, pH, tiempo y no debe de haber inhibidores.
Es posible usar dos métodos para medir el alcance de una reacción enzimática: a)
de tiempo fijo y b) ensayo de monitoreo continuo o cinético que se hacen mediciones
múltiples, normalmente de cambios de absorbancia a intervalos de tiempo
específico o en forma continua mediante un espectrofotómetro de registro continuo,
estos ensayos presentan la ventaja que la linealidad de la reacción se puede
comprobar de forma más adecuada.
Cuando se realiza la cuantificación de enzimas con respecto a su actividad y no con
una medición directa de concentración, la EC definió unidad internacional (UI) como
la cantidad de enzima que catalizará la reacción de un µmol de sustrato por minuto
en condiciones específicas de pH, temperatura, sustratos y activadores.
Métodos inmunológicos
Las enzimas también se utilizan como reactivos en inmunoensayos competitivos y
no competitivos, como los que usan para medir anticuerpos de HIV, fármacos
terapéuticos y antígenos de cáncer. La enzima en estos ensayos funciona como un
indicador que refleja la presencia o ausencia del analito.
Enzimas de importancia clínica
Fosfatasa ácida (ACP) Carcinoma prostático
Aminotranferasa de alanina (ALT) Trastorno hepático
Fosfatasa alcalina (ALP) Trastorno hepático y trastorno óseo
Métodos inmunológicos
Amilasa (AMS) Pancreatitis aguda
Aminotranferasa de aspartato (AST) Infarto de miocardio, trastorno hepático,
trastorno músculo esquelético
Cinasa de creatina (CK) Infarto de miocardio
Gama-Glutamiltranferasa (GGT) Trastorno hepático
Deshidrogenasa de lactato (LD) Infarto de miocardio, Trastorno hepático y
carcinoma.
Deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (G-6- Anemia hemolítica inducida por fármacos
PD) Métodos inmunológicos
Colinesterasa Envenenamiento por organofosfatos
Lipasa (LPS) Pancreatitis aguda
Peróxidasa de rábano Métodos inmunológicos
β-Galactosidasa