INSTITUTO

POLITECNICO
CENTRO DE ESTUDIOS
CIENTÍFICOS Y
NACIONAL
TECNOLÓGICOS No. 6
“MIGUEL OTHÓN DE
MENDIZABAL”
CONTROL SANITARIO
MICROBIOLOGICO.

PRACTICA No. 7
RENCUENTRO DE COLIFORMES TOTALES POR METODO NMP

PRESENTA:

Alonso Flores Samantha Guadalupe.

Delgado Mendoza Ximena.
López Guzman Angel Damian.
Rendon Mata Diego Omar.
Solis Flores Ricio.

GRUPO: 5IV11

PROFESOR :
Jose David Chalini
Herrera.

FECHA DE ENTREGA: 02
DE DICIEMBRE DEL 2020.
 INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
C.E.C.yT. 6 “Miguel Othón de Mendizábal”
CARRERA ACREDITADA DE TECNICO
LABORATORISTA
QUÍMICO.

Nombre de la práctica: PRÁCTICA No. Tiempo: 3 Hrs.

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y Unidad III

FECALES EN PLACA Y POR NMP EN UN
ALIMENTO. Fecha:02-12-2020

UNIDAD DE APRENDIZAJE: CONTROL SANITARIO MICROBIOLÓGICO.

COMPETENCIA DE APRENDIZAJE: Realiza el recuento de organismos coliformes totales y fecales
usando técnicas establecidas en la normatividad respectiva.

RESULTADO DE APRENDIZAJE PROPUESTO (RAP) ASOCIADO CON LA PRÁCTICA. RAP N° 1.- Realiza el
recuento de organismos coliformes totales en placa y por NMP así como el recuento de
organismos coliformes fecales por la técnica anterior.

INTRODUCCIÓN:

La palabra coliforme etimológicamente significa “con forma de coli”, refiriéndose a la bacteria

representativa del grupo, Escherichia coli; descubierta por el bacteriólogo alemán Theodor Von Escherich en
1860, quien la denominó “Bacterium coli” (bacteria del intestino). Posteriormente la microbiología
sistemática la nombraría Escherichia en honor a su descubridor.

El hábitat primordial de este grupo heterogéneo de bacterias es el intestino del hombre y otros animales, lo
cual explica su amplia distribución en el suelo, semillas y vegetales. Tales microorganismos presentan las
siguientes propiedades bioquímicas:

• Son bacilos Gram negativos.

• Son aerobios o anaerobios facultativos.
• Son oxidasa negativos.
• No son esporógenos (no producen esporas).
• Fermentan la lactosa a 35 ± 2 °C/48 hrs, produciendo ácido láctico y gas.

Este grupo bacteriano, sin guardar forzosamente una relación directa con una contaminación fecal y por
tanto no necesariamente patógena, está formado por los siguientes microorganismos:
1. Escherichia coli
2. Klebsiella pneumoniae
3. Enterobacter aerogenes
4. Enterobacter cloacae
5. Citrobacter (aunque no todos los autores lo incluyen en el grupo coliforme)

La importancia de cuantificar estos organismos coliformes es que se usan como indicador sanitario para:

• La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente

implica un riesgo sanitario.
• La evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo.
• Evaluar la calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de
alimentos.
• La evaluación de la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo, helados, pastas frescas,
fórmulas para lactantes, fideos y cereales para el desayuno.

Fundamentalmente el método en placa permite determinar el número de microorganismos coliformes

presentes en una muestra utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis), en el cual se desarrollan
bacterias a 35° C en aproximadamente 24 horas, dando como resultado la producción de gas y ácidos
orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan sales biliares.

Por otra parte, si el recuento de coliformes se efectuara en medios de cultivo líquidos se aplica la técnica del
recuento de organismos coliformes por la técnica del número más probable (NMP), la cual es seleccionada
cuando la densidad es como mínimo una bacteria en 1 mL. de producto líquido o gramo de alimento sólido;
como ya se mencionó en esta técnica se utilizan medios de cultivo líquidos en tubos de ensaye provistos de
pequeños tubos de cristal invertidos, de tal forma que puedan atrapar en su interior el gas desprendido por
las bacterias al metabolizar la lactosa.

Esta técnica se efectúa en dos partes; la primera que es una prueba presuntiva, utilizando caldo lactosado o
caldo lauril sulfato (a 35± 2°C/48 hrs.); bajo tales condiciones de incubación, los coliformes fermentan la
lactosa produciendo gas; En la segunda fase, conocida como fase confirmativa se utiliza caldo de bilis verde
brillante al 2% con campana de Durham o campana de fermentación incubados en las mismas condiciones
anteriormente explicadas; este medio al contener bilis deshidratada de buey y verde brillante, inhibe el
crecimiento de los microorganismos aerobios fermentadores de lactosa como por ejemplo Clostridium
perfringens, el cual ocasionaría resultados falsos positivos.

Los coliformes fecales al fermentar la lactosa a 44.5 ± 0.2°C, permiten descartar al género Enterobacter (el
cual no crece a esta temperatura); aplicando este criterio, principalmente crecerá Escherichia coli (en un
90%) y algunas cepas de Klebsiella y Citrobacter; por lo que la prueba de coliformes fecales positiva indica
un 90% de probabilidad de que el coliforme aislado sea Escherichia coli.

Para el caso particular, los niveles permisibles de microorganismos coliformes fecales en agua, de acuerdo a la
norma son:

• Agua potable: menor a 0 UFC/100 mL. de muestra de agua.

• Agua para natación: menor de 200 UFC/100 mL. de muestra de agua.

• Agua para navegar o pescar: menor de 1,000 UFC/100 mL. de muestra de agua.

Debemos tener presente que el aislamiento de Escherichia coli en el agua, da un alto grado de certeza de
contaminación de origen fecal; no es absoluto ya que se han aislado cepas de Escherichia coli que no son de
origen fecal, pero el grado de certeza es más que razonable para certificar contaminación con ese origen.

Aunque el aislamiento de Escherichia coli no permite distinguir si la contaminación proviene de excretas

humanas o animales, la contaminación que se desea controlar es la de origen humano, lo cual no significa
que debemos menospreciar la de origen animal, especialmente por la zoonosis que también puede
transmitirse por el agua por lo que los coliformes fecales también son usados para evaluar sanitariamente
mariscos frescos. En lo particular, Escherichia coli se usa como indicador en quesos, quesillos, cereales,
masas para relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO:

• Mechero
• Frasco de vidrio para recolectar especímenes de de 125 mL con 90 mL de solución diluyente estéril
• Tubos de ensaye de 15 x 150 con 9 mL. de solución diluyente estéril
• Agar bilis rojo violeta estéril conservado a 45/50°C en baño maría
• Pipetas graduadas estériles de 1 y 10 mL
• Cajas de Petri estériles
• Horno bacteriológico
• Asa bacteriológica
• Gradilla metálica para 72 tubos
• Espátula estéril.
• Balanza granataria.
• Tubos de ensaye con campana de Durham y caldo lactosado o caldo lauril sulfato estéril.
• Tubos con caldo lactosa bilis verde brillante al 2% con campana de Durham estéril.
• Tubos de ensaye de 20x180 conteniendo 10 mL. de caldo lauril sulfato triptosa estéril con campana
de
Durham.
• Tubos con caldo EC estéril.
• Tubos con caldo lactosa bilis verde brillante al 2% en agua peptonada estéril.
• Baño maría a 44.5 ± 0.2°C.
• Reactivo de Kovac.
• Estufa bacteriológica.
• Refrigerador.
• Autoclave.
 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA.

(ROTULE PREVIAMENTE CAJAS DE PETRI, TUBOS Y PIPETAS).

1. En condiciones de asepsia, hacer una serie de diluciones decimales de 10 -1 hasta 10-5.

2. Marcar 3 cajas de Petri como 10 -1, 10-3 y 10-5.
3. Inocular estas cajas con 1 mL de la dilución respectiva.
4. Agregar 12-15 mL de agar rojo violeta bilis (RVBA) mantenido a 45-50 °C en baño maría.
5. Sobre la mesa de trabajo, homogeneizar el inóculo y el medio de cultivo utilizando movimientos
circulares suaves y hacia los cuatro puntos cardinales.
6. Dejar solidificar.
7. Adicionar aproximadamente 4 mL. de RVBA a 45-50 °C, de tal manera que cubra la superficie de la
placa, formando una doble capa.
8. Dejar solidificar.
9. Invertir las cajas e incubar a 35± 2°C/24± 2 hrs.
10. Seleccionar la placa que contenga entre 15 y 150 colonias típicas esto es, de color rojo oscuro,
generalmente rodeadas de un halo de precipitación de sales biliares, el cual es de color rosa o rojo ,
biconvexas con un diámetro de 0.5-2.0 mm.
11. Contar las colonias típicas y multiplicar por el inverso de la dilución.

RESULTADO DE APRENDIZAJE:

a.- Reportar: ______ UFC de coliformes/g. o mL. de muestra, en placa de agar rojo violeta bilis
incubadas a 35± 2°C/24± 2 hrs.

NOTA 1: Si no hay colonias características, entonces:

Reportar: ______ menos de un coliforme por 1/d por g. o mL. de muestra (donde d, es el factor de
dilución).

NOTA 2: Ocasionalmente los cocos intestinales forman colonias puntiformes de

color rosa.

b.- Considerando el resultado obtenido y con base en las NOM̕ѕ: NOM-092-SSA1-1994, NOM-093-SSA1-
1994, NOM-121-SSA1-1994, NOM-117-SSA1-1994, NOM-114-SSA1-1994 y NOM-145-SSA1-1995; emita el
criterio de aceptación microbiológica.

c.- Con los resultados de todos los equipos, haga un cuadro en el pizarrón y discútalo en grupo.
 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES POR NÚMERO MAS PROBABLE (NMP)

Esta técnica se efectúa en dos partes; en la primera que es una prueba presuntiva, se utiliza caldo de
lactosa o caldo de laurilsulfato, los cuales liberan gas al ser fermentados por los coliformes; en la segunda
fase, conocida como confirmativa, se utiliza caldo lactosa bilis verde brillante al 2% con campana de Durham o
campana de fermentación.

(ROTULE PREVIAMENTE CAJAS DE PETRI, TUBOS Y PIPETAS).

 PRUEBA PRESUNTIVA

1. Realizar una serie de diluciones decimales hasta 10 -3.

2. Inocular 1 mL. de cada dilución en cada uno de los tres tubos conteniendo 10 mL. de caldo de
lactosa o caldo de laurilsulfato con campana de Durham.
3. Incubar los 9 tubos a 35 ± 2°C/48± 2hrs.
4. Revisar los tubos a las 24 ± 2 hrs (esto para observar si hay producción de gas en las campanas de
Durham); de no ser así, seguir incubando hasta las 48 ± 2 hrs.

NOTA: La presencia de cualquier cantidad de gas dentro de la campana indica muestra positiva; por lo que, si
después de 48 ± 2 hrs., todos los tubos resultan negativos, ahí finaliza la prueba.

PRUEBA CONFIRMATIVA

1. Agitar suavemente aquellos tubos que dieron positiva la prueba presuntiva.

2. De cada uno de ellos, inocular con 2-3 asadas a tubos con caldo lactosa bilis verde brillante al 2%
(previamente rotulados).

NOTA: Al efectuar la inoculación, sostener el tubo positivo de tal modo que pueda sacar el asa, evitando el arrastre de la “nata”
presente en el medio.

3. Incubar los tubos con caldo a 35 ± 2°C/48 ± 2 hrs.

4. Determinar el número de microorganismos coliformes de acuerdo a la tabla correspondiente
tomando como base el número de tubos positivos; esto es, en los que se observa producción de gas.

RESULTADO DE APRENDIZAJE:

Reportar: ____________ Número más probable (NMP) de coliformes totales por g. o mL. de muestra
TABLA PARA DETERMINAR EL NMP DE ORGANISMOS
CUANDO SE UTILIZAN 3 TUBOS PARA CADA DILUCIÓN

De acuerdo al número 3 con 1 mL. de dilución 1:10 = 0.1 g. de muestra

de tubos inoculados 3 con 1 mL. de dilución 1:100 = 0.01 g. de muestra
3 con 1 mL. de dilución 1:1000 = 0.001 g. de muestra

Tubos positivos Tubos positivos

3 3 3 NMP/g. o mL. 3 3 3 NMP/g. o mL.

(0.1) (0.01) (0.001) (0.1) (0.01) (0.001)

0 0 0 -3.0 2 0 0 9.1
0 0 1 3.0 2 0 1 14.0
0 0 2 6.0 2 0 2 20.0
0 0 3 9.0 2 0 3 26.0
0 1 0 3.0 2 1 0 15.0
0 1 1 6.1 2 1 1 20.0
0 1 2 9.2 2 1 2 27.0
0 1 3 12.0 2 1 3 34.0
0 2 0 6.2 2 2 0 21.0
0 2 1 9.3 2 2 1 28.0
0 2 2 12.0 2 2 2 35.0
0 2 3 16.0 2 2 3 42.0
0 3 0 9.4 2 3 0 29.0
0 3 1 13.0 2 3 1 36.0
0 3 2 16.0 2 3 2 44.0
0 3 3 19.0 2 3 3 53.0
1 0 0 3.6 3 0 0 23.0
1 0 1 7.2 3 0 1 39.0
1 0 2 11.0 3 0 2 64.0
1 0 3 15.0 3 0 3 95.0
1 1 0 7.3 3 1 0 43.0
1 1 1 11.0 3 1 1 75.0
1 1 2 15.0 3 1 2 120.0
1 1 3 19.0 3 1 3 160.0
1 2 0 11.0 3 2 0 93.0
1 2 1 15.0 3 2 1 150.0
1 2 2 20.0 3 2 2 210.0
1 2 3 24.0 3 2 3 290.0
1 3 0 16.0 3 3 0 240.0
1 3 1 20.0 3 3 1 460.0
1 3 2 24.0 3 3 2 1100.0
1 3 3 29.0 3 3 3 >1100.0
Así, por ejemplo:

Suponga que al final del análisis se obtuvo un tubo positivo de la dilución 10 -1, dos de la
dilución 10-2 y cero de la dilución 10-3, luego entonces el resultado será de 11 por lo que
usted deberá reportar:

Número más probable (NMP) de organismos coliformes totales por g. o mL. de muestra
= 11

OBJETIVO:

Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales,

evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la búsqueda de
microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli, y en caso de
poder realizar la práctica de manera presencial en el laboratorio realizar el recuento de
coliformes por el método de NMP (Número Más Probable), para así poder organizar e
interpretar los resultados.

CUESTIONARIO:

1. Elabora el diagrama y resuelve el siguiente problema

Consultando la tabla de probabilidades de cuenta totales el método NMP, indique el
número de microorganismos presentes en la muestra, si se efectuó por triplicado en 3
diluciones diferentes 10-1, 10-2 y 10-3, teniendo como resultados del análisis de las
diluciones, 2, 3, 0 que presentaron la prueba positiva, en la prueba confirmativa.

Resultado 29 microorganismos / g o ml

Si la muestra es leche, indique si esta sanitariamente segura para consumo humano.

Los resultados obtenidos en el conteo de bacterias mesofílicas y coliformes, tanto en

muestras de leche como en los productos lácteos, exceden los límites máximos
permitidos por la NOM-243-SSA1-2010 indica que no deberán contener más de 100
UFC/g de microorganismos no patógenos y 0 UFC/g de organismos patógenos,
como Salmonella spp, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes y, además,
contener menos de 3 NMP/g por ml de producto así que sí es sanitariamente segura.

2. Indica cinco cuidados que hay que considerar al realizar la cuantificación de

coliformes totales por el método de Número más Probable justifica tu respuesta.

1) Realizar una correcta homogenización en un matraz Erlenmeyer completamente limpio

y estéril de la muestra de agua peptonada la cual es nuestro diluyente, así como los
gramos a tomar para la muestra agitando correctamente.

2) Después de obtener esta homogenización se realiza la dilución seriada donde se

deberá llevar a diferentes tubos obteniendo una disolución 1:10 adicionando 10 mL de la
muestra con ayuda de una pipeta estéril para evitar contaminación de nuestra muestra

3) Para los demás tubos se tiene que agitar el tubo donde se depositó la primera dilución
y con ayuda de una pipeta estéril se van adicionando a los demás tubos cada uno con un
total de 9 mL de diluyente y 1 mL de dilución
4) En la prueba presuntiva se necesitará 3 tubos de ensayo más pequeños para cada una
de la muestra de 1:10 1:100 1:1000 de disolución de caldo Lauril Sulfato

5) Al tener todos nuestros tubos incubar entre 24-48 horas y Revisar los tubos a las 24 ±
2 hrs (esto para observar si hay producción de gas en las campanas de

Durham); de no ser así, seguir incubando hasta las 48 ± 2 hrs. tubo es positivo o no

3. ¿Cuál es la morfología colonial típica de los coliformes en RVBA?

Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de
un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la
morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.

4.Mencione por lo menos 3 características bioquímicas de los coliformes.

1.AEROBIAS O ANAEROBIAS FACULTATIVAS

2.GRAM NEGATIVAS
3.NO ESPORÓGENAS

5. Si los organismos coliformes no están necesariamente relacionados con

contaminación fecal ¿Por qué desde el punto de vista práctico se determinan
coliforme

Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el

control de calidad del agua destinada al consumo humano debido a que, en los medios
acuáticos, los coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y
porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es
bacteriológicamente segura, asimismo, su número en el agua es directamente
proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más coliformes se aíslan del
agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces por ende la elevación de
incidencias de patologías entéricas.
6. ¿Qué entiende por zoonosis?
Zoonosis es reconocida como la infección o enfermedad del animal. El término deriva de
dos vocablos griegos: zoon (“animal”) y nósos (“enfermedad”).
Las enfermedades zoonóticas son un grupo de enfermedades infecciosas que se
transmiten de forma natural de los animales a los seres humanos. El mayor riesgo de
transmisión de enfermedades zoonóticas se produce en la interfaz entre el ser humano y
los animales a través de la exposición directa o indirecta a los animales, los productos
derivados de estos (por ejemplo, carne, leche, huevos) o su entorno.

La OMS colabora con entidades asociadas de distintos sectores para evaluar y reducir
los riesgos de transmisión de zoonosis al ser humano a través del consumo de productos
de origen animal. La OMS formula recomendaciones dirigidas a los Estados Miembros y
a la población acerca del modo de reducir esos riesgos en la cadena alimentaria.

7. De acuerdo con la temperatura óptima de crecimiento. ¿Qué tipo de

microorganismo es Escherichia coli?

Atendiendo a este margen de temperatura de crecimiento, los microorganismos se

clasifican en:
Hipertermófilos: Su temperatura óptima se encuentra por encima de los 80ºC. Muchos de
ellos son arqueas.
Termófilos: Su temperatura óptima se encuentra entre 45-70ºC. Suelen ser
microorganismos de vida libre
Mesófilos: Su temperatura óptima se encuentra entre los 25-45ºC. Incluye
microorganismos patógenos y comensales del hombre y animales de sangre caliente y
algunos de vida libre.
Psicótrofos: La temperatura óptima de los microorganismos de este grupo está por
debajo de los 25 – 30°C incluye microorganismos de vida libre.
Psicrófilos: Su temperatura óptima de desarrollo se encuentra entre los 12 – 15°C

Escherichia coli (EC) es una de las 6 especies del género Escherichia. Es la principal

bacteria aerobia (anaerobia facultativa) de nuestro intestino y cumple importantes
funciones junto con otras bacterias de la microbiota (flora) intestinal. E. coli productora de
toxina Shiga puede crecer a temperaturas que oscilan entre 7 °C y 50 °C, con
una temperatura óptima de 37 ºC. Algunas pueden proliferar en alimentos ácidos
8. Indica cinco buenas prácticas de laboratorio que se deben de aplicar en un
análisis microbiológico

Esterilización, Desinfección y Antisepsis

En el laboratorio de microbiología es imprescindible trabajar con material y soluciones
estériles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al
microorganismo o microorganismos que están presentes en la muestra en estudio y no a
contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y
falsear las pruebas.

o Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en el

laboratorio.
o Evitar llevarse a la boca algún objeto (bolígrafos, material de laboratorio o muestra
a evaluar...) o tocarse los ojos y nariz.
o En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u
objetos personales.

o Los métodos de esterilización pueden ser por medios físicos o químicos.

o Autoclave
o Mechero Bunsen
o Ebullición
o Filtración
o Radiaciones: Ultravioleta
o Antisepsia - Eliminación o inhibición de microorganismos mediante el empleo de
agentes químicos (antisépticos), que por su baja toxicidad pueden aplicarse en
tejidos vivos, piel, mucosas, etc. Es un tipo concreto de desinfección empleado,
habitualmente, en el tratamiento de heridas o en la limpieza de la piel previa a una
operación.
CONCLUSION:
Mediante la información otorgada por los profesores pudimos identificar los organismos
coliformes totales, así como, los microorganismos coliformes fecales, evaluamos la
calidad sanitaria en muestras de alimentos asegurando la inocuidad de un producto
consumible, aunque esta calidad también puede ser evaluada en muestras de agua para
confirmar su posible uso y o consumo humano, además aprendimos el proceso de
recuento de coliformes por el método de NMP (Número Más Probable) mediante videos.

REFERENCIAS
o Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. NOM-008-SCFI-1993. Norma Oficial
Mexicana. Sistema General de Unidades de Medida. México, D.F.
o EcuRed. (s. f.). Bacterias mesófilas - EcuRed. BM. Recuperado 1 de diciembre de
2020, de https://www.ecured.cu/Bacterias_mes%C3%B3filas
o Escherichia coli microbiologia baterias. (s. f.). Escherichia coli microbiologia
baterias. https://es.slideshare.net/OscarRomoFlores1/escherichia-coli-
microbiologia-baterias