PRÁCTICA

CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR MÉTODOS

ESPECTROFOTOMÉTRICOS

INTRODUCCIÓN
Las bases aminadas encontradas en los ácidos nucleicos son cromóforos muy
fuertes que permiten una rápida y eficiente cuantificación de esos polímeros en
solución. Las cinco bases encontradas en el DNA o RNA absorben entre 250 y
270 nm, de forma que es observa habitualmente un pico en torno de 260 nm en
DNA o RNA de alta masa molecular. El DNA de cadena simple tiene un mayor
poder de absorción que el DNA helicoidal de cadena doble, en razón a que las
bases se encuentran dentro de la hélice. Esa característica del DNA es muy útil
en el monitoreo de la desnaturación de la cadena doble, con consecuente
aumento de la absorbancia de la mezcla. Ese abrupto aumento en la
absorbancia es conocido como efecto hipercrómico.
Para cuantificar una muestra, esta debe ser diluida en 1:1000 o 1:500 en agua
o solución tamponada con Tris 1 mM, pH 8,0. La lectura se realiza a una
absorbancia de 260 nm de la muestra y del blanco (la misma solución sin el
ácido nucleico). La concentración puede ser calculada directamente por una de
las ecuaciones siguientes:

[dsDNA (ug/mL)] = 50 X A260 x dilución

[ssDNA (ug/mL)] = 33 X A260 x dilución
[ RNA (ug/mL)] = 50 X A260 x dilución

100 X A260 x dilución

[DNA* (pmol/uL)] = --------------------------------------------------
1,50 Na + 0,71 NC +0,20 NG + 0,84 NT

*Oligonucleótidos sintéticos
Donde [ds DNA], [ss DNA] e [RNA] corresponden a la concentración de DNA
de cadena doble, de cadena simple y de RNA, respectivamente, en ug/mL. La
última ecuación es útil para la determinación de la concentración de
oligonucleótidos de secuencia conocida. La A 260 corresponde a la lectura de la
absorbancia en la longitud de onda y la dilución corresponde a cuantas veces
el material fue diluido para la lectura. Para calcular la concentración de
oligonucleótidos, incorporamos el efecto de la composición de bases, sumando
el número de bases A, C, G y T (NA,NC, NG y NT).

OBJETIVOS
- Cuantificar la concentración de DNA en aislamientos de DNA vegetal
obtenidos en prácticas anteriores.
- Comprobar la pureza que tienen.

MATERIALES – REACTIVOS – EQUIPOS

- Buffer T. E
- Agua destilada
- Tips
- Micropipetas
- Espectofotometro de luz UV.
- Papel toalla
-
PROCEDIMIENTO

- Diluir la muestra de DNA 1:500 en 1

mM Tris-HCL, pH 7,5.
- Adicionar 1 ml de TE (10mM Tris-
HCL, pH 8, 1mM EDTA) a la cubeta de cuarzo y llevar el equipo a 260 nm
(blanco). La cubeta de vidrio es opaca a la radiación ultravioleta
- Adicionar 1 ml de la dilución a la
cubeta de cuarzo.
- Realizar la lectura a A260
- Repetir las lecturas a A280nm y
A230nm
- Evaluar la pureza de la muestra con
la relación de A260/A280
- Calcular la concentración de DNA o
RNA conforme la fórmula más conveniente