EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN

Y CUANTIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS

TM. MSc Sebastián Gutiérrez V.

Marzo 2023
 BASE
NITROGENADA/NUCLEOSIDO/NUCLEOTIDO
ENLACE FOSFODIÉSTER
MODELO DE WATSON & CRICK

• Formada por 2 cadenas

• naturaleza helicoidal (R. Franklin).
• Son antiparalelas.
• Las bases nitrogenadas van hacia el
centro.
• Las cadenas están unidas por puentes
de hidrógeno.
 BIOFÍSICA DEL ADN
• Las bases nitrogenadas absorben la luz a una longitud de onda de 260nm.
• Al aumentar la temperatura del ADN, el ADN se denatura.

La temperatura de melting corresponde al

50% de la hebra de ADN denaturalizada.
 ¿DESDE DÓNDE PUEDO EXTRAER ÁCIDOS
NUCLEICOS?
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 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN

• Métodos de precipitación

• Métodos por columna

 MÉTODO DE PRECIPITACIÓN

• Buffer de Lisis: Solución hipertónica suplementada con algún detergente no-iónico

como es el Tritón X-100, en pH básico (pH ~8)
• Precipitación de proteínas: Por “Salting-Out”, 5M de NaCl.
 MÉTODO DE PRECIPITACIÓN

• Precipitación de DNA: Usando alcohol al 100%, Ojo que todos los ácidos nucleicos
precipitan con este porcentaje de alcohol.
• Lavados, tampón Tris-HCl/EDTA pH 8,0
MÉTODO POR COLUMNA
 MÉTODO POR COLUMNA

• Buffer de Lisis, Proteinasa K

• Separación DNA proteínas/Debris
• Unión del DNA a columna
• Lavados
• Elusión

https://youtu.be/O5d4yA4ZIRs
EXTRACCIÓN DE ARN POR PRECIPITACIÓN

Método de Trizol
Separación:
Muestra+Trizol+Cloroformo

Precipitación:
Isopropanol

Lavado
Etanol absoluto

Agua o Buffer TE pH 8

https://youtu.be/RmPsLoIPRwc
 EVALUACIÓN DE LA EXTRACCIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
1. Cuantificación

2. Índice de purificación

3. Integridad
CUANTIFICACIÓN
 EJEMPLO:

SI luego de la extracción de dsDNA obtengo una Abs260nm de 0,300. El blanco de

muestra dio justamente 0.000. ¿Cuál es la concentración de DNA en mi muestra?

[dsDNA] = Abs260nm x 50 = 0,300 x 50 = ?

 EJEMPLO:

Si luego de la extracción de dsDNA obtengo una Abs260nm de 0,300. El blanco de

muestra dio justamente 0.000. ¿Cuál es la concentración de DNA en mi muestra?

[dsDNA] = Abs260nm x 50 = 0,300 x 50 = 15 µg/ml o ng/µl

 EJEMPLO:

Si luego de la extracción de RNA obtengo una Abs260nm de 0,310. El blanco de

muestra dio justamente 0.000. ¿Cuál es la concentración de RNA en mi muestra?

[RNA] = Abs260nm x 40 = 0,310 x 40 = ?

 EJEMPLO:

Si luego de la extracción de RNA obtengo una Abs260nm de 0,310. El blanco de

muestra dio justamente 0.000. ¿Cuál es la concentración de RNA en mi muestra?

[RNA] = Abs260nm x 40 = 0,310 x 40 = 12,4 µg/ml o ng/µl

ÍNDICE DE PURIFICACIÓN

IP ideal 1,8 – 2,0

 EJEMPLO

• Extracción de DNA de una muestra de pelo.

Abs260nm: 0,420
Abs280nm: 0,281

Calcular Concentración e Índice de Pureza.

Concentración:
0,420 x ? = ?
 EJEMPLO
• Extracción de DNA de una muestra de pelo.
Abs260nm: 0,420
Abs280nm: 0,221

Calcular Concentración e Índice de Pureza.

Concentración:
0,420 x 50 = 21ng/µl
IP:
Abs260/Abs280 = 0,420/0,221 = ?
 EJEMPLO
• Extracción de DNA de una muestra de pelo.
Abs260nm: 0,420
Abs280nm: 0,221

Calcular Concentración e Índice de Pureza.

Concentración:
0,420 x 50 = 21ng/µl
IP:
Abs260/Abs280 = 0,420/0,221 = 1,9
 INTEGRIDAD DEL ÁCIDO NUCLEICO
• Determinar si el ácido nucleico extraído está en condiciones optimas de trabajo.
Gel de agarosa al 1-3%p/v
Intercalante DNA (Safeview, otro)
Marcador de peso molecular
Buffer de carga
Equipo de electroforesis + Fuente de poder
Transiluminador

https://youtu.be/vq759wKCCUQ
INTEGRIDAD DE ADN
 INTEGRIDAD ADN

A B C D E F G H I J K L
INTEGRIDAD DE ARN
 CONCLUSIONES

• Los Métodos de Extracción de ácido nucleicos se clasifican en métodos por

Precipitación y por columna.
• La evaluación de la extracción se realiza bajo 3 criterios: Concentración, Índice de
pureza e Integridad.