CUESTIONES DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE EXPRESIÓN

GÉNICA Y CONTROL METABÓLICO

Práctica 1: SEPARACIÓN DE LAS DIFERENTES ISOZIMAS DE LA LDH POR

ELECTROFOSFORESIS

Resultados:

- Dibuja el patrón de bandas observado tras la electroforesis de los tejidos, indicando

la posición del ánodo y cátodo, así como el punto de aplicación de la muestra y los
nombres de cada banda

- Ordena según la proporción, de mayor a menor, las distintas LDH de cada tejido.
En el hígado: LDH-4>LDH-5>LDH3>LDH-2>LDH-1
En el corazón: LDH-1>LDH-2

Cuestiones:

1.- ¿Por qué se han desplazado más unas isoenzimas que otras?
Porque cada isozima tiene un determinado número de cargas diferentes.

2.- ¿Quién tiene más cargas negativas superficiales, la subunidad H o la M?

Al estar en pH básico, las que más cargas negativas tengan, se moverán más al polo
positivo. En este caso, la subunidad H es la que más cargas negativas por lo que tiene una
mayor movilidad hacia el polo positivo.

3.- ¿Por debajo de qué valor de pH estarán los pI de todas las isozimas?
Por debajo de 8,6 ya que ese es el pH de la disolución tampón. En este pH básico la
proteína tendrá cargas negativas porque estará en medio básico por encima de su punto
isoeléctrico. De este modo, las cargas se podrán mover hacia el polo positivo.

4.- ¿Qué le pasaría a una isozima cuyo punto isoeléctrico coincidiese con el pH del
tampón?
Si coincidiese el punto isoeléctrico con el pH del tampón, las cargas positivas y negativas se
anularían, es decir, la carga neta sería cero. En consecuencia, la isozima no se movería.

5.- ¿El experimento desnaturaliza nuestras enzimas?

No, ya que ha aparecido el color violeta esperado en la reacción. La tinción la hemos
basado en su actividad enzimática por lo que no se puede desnaturalizar. Si se
desnaturalizarse perdería su función, la reacción no ocurriría y no aparecería ese color
violeta en la reacción.

6.- La distribución en humanos de las isoenzimas LDH es:

LDH-1(HHHH): corazón, cerebro, hematíes, riñón, células germinales
LDH-2(HHHM): corazón, glóbulos rojos, riñón (en menor cantidad que LDH-1)
LDH-3(HHMM): pulmones, bazo, glándulas endocrinas, nódulos linfáticos y plaquetas
LDH-4(HMMM): glóbulos blancos, nódulos linfáticos, músculo, hígado (menos cantidad que
LDH5)
LDH-5(MMMM): hígado, músculo esquelético

¿Concuerda con tus resultados en conejo?

Si, concuerda. La isozima presente en el corazón es la LDH-1 y en el hígado predomina la
LDH-4 y LDH-5. Esto lo hemos sabido ya que en la tira de acetato de celulosa de
electroforesis se visualiza un precipitado violeta intenso en estas isozimas para cada tejido.

7.-Sabiendo que tenemos un gen para cada una de las subunidades (es decir, dos
genes distintos), se puede concluir lo siguiente: la composición isoenzimática de un
tejido está determinada principalmente por el nivel de expresión de cada uno de los
dos genes. ¿Cuál de los dos genes tiene un nivel más alto de expresión en los
distintos tejidos de conejo analizados?

En el hígado se expresa más el gen M (LDH-4 y LDH-5) y en el corazón el gen H (LDH-1)

Práctica 2: PURIFICACIÓN DE DNA Y CUANTIFICACIÓN DE DNA

Temperatura Tª 40 60 80 100
ºC ambiente

A260 0,504 0,546 0,632 0,604 0,639

Resultados:
1.- Determina la pureza de la disolución del DNA obtenido: A260/A280

A260=0,504
A280=0,305

R= A260/A280= 1, 65

2.- Calcula la concentración de DNA en la disolución diluida

[DNA] (μg/mL)= A260 x 50= 0,504 x 50 = 25,2 μg/mL

3.- Teniendo en cuenta la dilución, calcula la concentración de DNA en la disolución

original y la correspondiente a un gramo de hígado ([DNA]/g hígado).
Será 50 veces mayor porque la hemos diluido 50 veces

25,2 x 50 = 1260 μg/mL = 1,26 mg/mL

Estos 1,26 mg/mL los tenemos en los 0,2 g de hígado que nos han dado en la muestra y los
tenemos disueltos en 1 mL.

Por lo tanto:
1,26 𝑚𝑔/𝑚𝐿
1 𝑔 𝑑𝑒 ℎí𝑔𝑎𝑑𝑜 0,2 𝑔 𝑑𝑒 ℎí𝑔𝑎𝑑𝑜
= 6, 3 𝑚𝑔 / 1 𝑔 𝑑𝑒 ℎí𝑔𝑎𝑑𝑜

4.- Calcula el porcentaje de aumento de absorbancia debido a la desnaturalización.

0,639 * 100
0,504
= 126, 70% → 126,70 - 100= 26, 70% (aumento de absorbancia)

Cuestiones:

1.- El DNA en las células eucariotas está en el núcleo. ¿Cómo se consigue que forme
parte de una disolución de homogeneizado?
Se consigue añadiendo un detergente llamado SDS que solubiliza las membranas celulares.

2.- Cuando el DNA forma parte del homogeneizado, se pone en contacto con enzimas
citoplasmáticas que pueden degradarlo (DNasas). ¿Cómo protegemos el DNA?
Porque anteriormente hemos echado EDTA, que secuestra el Mg2+ necesario para la
actividad de enzimas que degradan el DNA (DNAsas)

3.- ¿Por qué añadimos a un homogeneizado celular, para obtener el DNA, la mezcla
fenol: cloroformo: alcohol isoamílico?
Añadimos esta mezcla para desnaturalizar únicamente las proteínas y así no tocar el DNA.

4.- Una vez obtenido el DNA, se diluye la muestra 50 veces. ¿Cuál podría ser el
motivo?
Por el factor de conversión. Ya que se tiene en cuenta que una disolución en A260nm tiene
una absorbancia de 1,0 y se corresponde con una concentración de 50 μg/mL de DNA puro.

5.- Calcular la concentración de DNA en una muestra pura que absorbe 0,8 a 260 nm.
[DNA]= A260 x 50 = 0,8 x 50 = 40 µg/mL. Por lo tanto, la concentración de DNA en una
muestra pura que absorbe 0,8 a 260nm es de 40 µg/mL

6.- La temperatura a la que se desnaturaliza una molécula de DNA depende del

contenido de bases. ¿Cómo? Razónalo.
La guanina y citosina resisten más las altas temperaturas, por lo que cuanto mayor sea la
proporción del par guanina y citosina, más estable será la molécula y se requerirá una
temperatura más alta para su desnaturalización.

7.- Una molécula de DNA humano tiene, como media, 1,3x10⁸ nucleótidos en cada
cadena. Teniendo en cuenta que el peso molecular medio de un nucleótido es 5x10-20
g, que una célula humana tiene 46 moléculas de DNA, y que el cuerpo humano tiene
aproximadamente 2x1012 células, ¿cuánto pesa el DNA de una célula? ¿Y el del
organismo entero?
1, 3𝑥10⁸ * 2 = 260000000 pares de bases en una molécula de DNA
260000000 * (5 * 10⁻²⁰) = 1, 3 * 10⁻¹¹ g de una molécula de DNA
1, 3 * 10⁻¹¹ * 46 = 5, 98 * 10⁻¹⁰ gramos de DNA en una célula
5, 98 * 10⁻¹⁰ * (2 * 10¹²) = 1196 gramos de DNA en todo el organismo

El DNA de una célula pesa 5,98 x 10-10 gramos y el del organismo entero pesa 1196
gramos.

8.- ¿Por qué absorben las proteínas luz a 280 nm? ¿Sirve esta propiedad para medir
su concentración?

Porque los anillos aromáticos de los aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y en menor
medida la fenilalanina) absorben la luz UV a una longitud de onda de 280 nm.

Como estos aminoácidos absorben la luz UV a 280 nm, puede obtenerse la absorbancia a
esta longitud de onda y utilizarse para estimar las concentraciones proteicas de las
muestras.

Pero, puede tener una gran variabilidad debido a que los componentes no proteicos de la
solución que absorben la luz ultravioleta a 280 nm podría interferir con las mediciones y las
mezclas con diferentes proteínas en una muestra pueden provocar diversas lecturas de
absorbancia debido a la diferencia en la composición de aminoácidos.

Práctica 3: APLICACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS STR EN LA IDENTIFICACIÓN DE

PERSONAS

Análisis de los resultados:

- Compara los alelos de cada muestra con los de la escala de alelos y rellena la
siguiente tabla:

Muestra Nº de bandas Tamaño de los alelos

1 Escala de alelos 8 1-15 repeticiones

2 CS 2 3-7 repeticiones

3 A 2 3-10 repeticiones

4 B 2 2-4 repeticiones

5 C 2 3-10 repeticiones

6 D 2 3-7 repeticiones

- De acuerdo a estos resultados, ¿es posible que entre las muestras analizadas pueda
haber más de una perteneciente a la misma persona? Esto es, ¿hay más de una
muestra que tenga el mismo perfil genético para el locus TH01? ¿Cuáles?
Sí, hay más de una muestra que tenga el perfil genético para el locus TH01. En este caso,
son la C y la CS. Además, se aprecia en la tabla que los alelos tienen el mismo tamaño.

Cuestiones:

1. ¿Qué función tienen los siguientes componentes utilizados para la realización de la

PCR? Muestra de DNA Cebador Taq polimerasa dNTP-s
● Muestra de ADN. Lo que le sucede a la muestra de ADN es multiplicarse. Es decir,
multiplicamos la secuencia exacta que queremos analizar.
● Cebador. Sirve para que el DNA polimerasa pueda sintetizar y alargar el fragmento
de DNA exacto desde un punto exacto (el DNA que queremos analizar)
● Taq polimerasa. Es termorresistente y es la que alarga la secuencia modelo
● dNTP-s. Son los nucleótidos del DNA, que la Taq polimerasa los va uniendo para
copiar la secuencia origen y replicarla.
2. ¿Todas las muestras de DNA han generado productos en la PCR? Si no es así, dar
alguna razón que lo explique
Sí, todas las muestras de DNA han generado productos en la PCR ya que si no no hubieran
avanzado hacia el polo positivo en la electroforesis.

3. ¿Cuáles hubieran sido los resultados de la electroforesis si no se hubiese llevado a

cabo la PCR?
Si no se hubiese llevado a cabo la PCR no se verían bandas ya que la concentración o la
cantidad de ADN sería muy pequeña.

4. Suponiendo que cada uno de los 20 alelos del locus TH01 se encuentra con la
misma frecuencia en la población caucásica (p=0,05)¿cuál es la frecuencia de cada
genotipo posible?
La frecuencia de cada genotipo posible es de 0,005 (0,05 x 0,05 x 2)

5. ¿Es suficiente con utilizar únicamente el genotipo del locus TH01 para la
identificación de personas? ¿Por qué?
No es suficiente porque podemos tener 2 personas con el mismo genotipo del locus TH01 y
no ser la misma persona, ya que todos los demás genotipos pueden ser diferentes y solo
coincidir en ese. Hay que mirar los demás locus también.

Noah Arroyo y Ainara Pisabarro

2º NUTRICIÓN HUMANA Y DIETÉTICA