Polymerase Chain Reaction Methods Princi

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Revista Internacional de Investigación Biomédica
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: MÉTODOS, PRINCIPIOS Y
SOLICITUD
Dra. Mohini Joshi1* , Dra. Deshpande J.D2 .
1Departamento de Anatomía, Colegio Médico Rural, Instituto Pravara de Ciencias Médicas,
Loni, Maharastra, India
2Departamento de Medicina Comunitaria, Facultad de Medicina Rural, Instituto Pravara de Medicina
Ciencias, Loni, Maharashtra, India
Autor para correspondencia*: atharvamohini@gmail.com
Este artículo está disponible en línea en www.ssjournals.com
RESUMEN La
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica científica en biología molecular para
amplificar una sola o unas pocas copias de una pieza de ADN en varios órdenes de magnitud,
generando de miles a millones de copias de una secuencia de ADN particular. La PCR es ahora una
técnica común y a menudo indispensable utilizada en laboratorios de investigación médica y
biológica para una variedad de aplicaciones. Hay tres pasos principales involucrados en la técnica
de PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. La PCR es útil en la investigación y el diagnóstico
de un número creciente de enfermedades. La PCR cualitativa se puede utilizar para detectar no solo
genes humanos sino también genes de bacterias y virus. La PCR también se usa en laboratorios
forenses y es especialmente útil porque solo se requiere una pequeña cantidad de ADN original. La
PCR puede identificar genes que se han implicado en el desarrollo del cáncer. La clonación
molecular se ha beneficiado del surgimiento de la PCR como técnica. El presente documento es un
intento de revisar los conceptos básicos de PCR.
PALABRAS CLAVE: PCR, Principios, Aplicación
INTRODUCCIÓN
La reacción en cadena de la polimerasa y problemas de purificación de la polimerasa.2
(PCR) es una técnica científica en biología La PCR es ahora una técnica común y a
molecular para amplificar una sola o unas menudo indispensable utilizada en laboratorios
pocas copias de una pieza de ADN en de investigación médica y biológica para una
varios órdenes de magnitud, generando de variedad de aplicaciones.3 La reacción en
miles a millones de copias de una secuencia cadena de la polimerasa es una técnica
de ADN particular. La reacción en cadena poderosa que se ha convertido rápidamente
de la polimerasa fue desarrollada en 1984 en una de las técnicas más utilizadas en la
por el bioquímico estadounidense Kary investigación molecular. biología porque es
Mullis. Mullis recibió el Premio Nobel y el rápido, barato y sencillo. La técnica amplifica
Premio de Japón por desarrollar PCR en fragmentos de ADN específicos a partir de
1993.1 Sin embargo, el principio básico de cantidades diminutas de material de origen
replicar una pieza de ADN utilizando dos de ADN, incluso cuando ese origen de ADN
cebadores ya había sido descrito por Gobind Khorana es dee
n
c1alidad
971. relativamente baja.4 PCR; el
El progreso estuvo limitado por la síntesis de cebadores método rápido y fácil para generar copias ilimitadas de cualqui
IJBR [5] []
Joshi et al Artículo de revisión
fragmento de ADN, es uno de esos como una fotocopiadora molecular. La PCR
desarrollos científicos que realmente puede amplificar una cantidad utilizable de
merecen superlativos desgastados ADN (visible por electroforesis en gel) en ~2
como "revolucionario" y "avance". horas. La plantilla de ADN no necesita estar
análisis de pequeñas cantidades de altamente purificada: una colonia bacteriana
material genético, incluso material hervida. El producto de PCR puede digerirse
genético dañado a un nuevo nivel de con enzimas de restricción, secuenciarse o
precisión y confiabilidad. clonarse. La PCR puede amplificar una sola
molécula de ADN, por ejemplo , de un solo
espermatozoide. La reacción en cadena de la
polimerasa se basa en la capacidad de las
Además, se han realizado muchas enzimas que copian el ADN para permanecer
contribuciones importantes al desarrollo y la estables a altas temperaturas. La PCR ha
aplicación de la tecnología PCR; sin embargo, transformado la forma en que se pueden
el presente documento es un intento de revisar realizar casi todos los estudios que requieren la
los conceptos básicos de PCR. manipulación de fragmentos de ADN debido a
su simplicidad y utilidad.5 En el proceso de PCR original de Mullis
Concepto básico de PCR El ADN de doble cadena se separó en
dos cadenas sencillas de ADN calentándolo
El principio básico de PCR es simple. Como su a 96°C. Sin embargo, a esta temperatura,
nombre lo indica, es una reacción en cadena: la ADN polimerasa de E.Coli se destruyó,
una molécula de ADN se usa para producir dos por lo que la enzima tuvo que ser repuesta
copias, luego cuatro, luego ocho y así sucesivamente. con nueva enzima fresca después de la
Esta duplicación continua se logra mediante etapa de calentamiento de cada ciclo. El
proteínas específicas conocidas como proceso de PCR original de Mullis era
polimerasas, enzimas que pueden unir muy ineficiente ya que requería mucho
bloques de construcción de ADN individuales tiempo, grandes cantidades de ADN
para formar cadenas moleculares largas. polimerasa y atención continua durante
Para hacer su trabajo, las polimerasas todo el proceso de PCR.6
requieren un suministro de bloques de
construcción de ADN, es decir, los nucleótidos Pasos en PCR
que consisten en las cuatro bases adenina
(A), timina (T), citosina (C) y guanina (G). Hay tres pasos principales involucrados en la
También necesitan un pequeño fragmento técnica de PCR: desnaturalización, hibridación
de ADN, conocido como cebador, al que se y extensión. En el paso uno; el ADN se
unen los componentes básicos, así como desnaturaliza a altas temperaturas (de 90 a 97
una molécula de ADN más larga que sirva grados centígrados). En el paso dos, los
como plantilla para construir la nueva hebra. cebadores se hibridan con las hebras de la
Si se suministran estos tres ingredientes, las plantilla de ADN para cebar la extensión. En el
enzimas construirán copias exactas de las paso tres, la extensión se produce al final de
plantillas. La PCR es un método utilizado los cebadores recocidos que a crean una a
para adquirir muchas copias de cualquier copia complementaria de la cadena de ADN.
cadena particular de ácidos nucleicos. Es un Esto duplica efectivamente la cantidad de ADN
medio de amplificar selectivamente un a través de los terceros pasos en el ciclo de PCR.
segmento particular de ADN. El segmento Para amplificar un segmento de ADN mediante
puede representar una pequeña parte de una PCR, primero se calienta la muestra para que el
mezcla grande y compleja de ADN, por ejemplo, un exón
ADN esspecífico de un
e desnaturalice og sen
e shepare
umano.
en dsos
e ppuede
iezas pdensar
e
IJBR [] []
ADN monocatenario. A continuación, una realizar experimentación. Suponiendo la
enzima llamada "Taq polimerasa" sintetiza cantidad máxima de tiempo para cada
(construye) dos nuevas hebras de ADN, paso, 30 ciclos solo tardarían 6 horas en
utilizando las hebras originales como moldes. completarse.
Este proceso da como resultado la duplicación A medida que continúa el proceso de
del ADN original, con cada una de las nuevas desnaturalización, hibridación y extensión
moléculas que contienen una hebra de ADN de polimerasa, los cebadores se unen
antigua y otra nueva. Luego, cada una de repetidamente tanto a la plantilla de ADN
estas hebras se puede usar para crear dos original como a los sitios complementarios
nuevas copias, y así sucesivamente.7 La en las cadenas recién sintetizadas y se
fase de recocido ocurre a una temperatura más baja, extienden
5060°C. para producir nuevas copias de
Esto permite que los cebadores hibriden con ADN. El resultado final es un aumento
sus respectivas cadenas de plantilla exponencial en el número total de
complementarias, una herramienta muy útil fragmentos de ADN que incluyen las
para la química forense. La hebra de ADN secuencias entre los cebadores de PCR,
recién formada del cebador unida a la plantilla que finalmente se representan en una
8
se usa luego para crear copias idénticas a abundancia teórica de 2n, donde n, es el número de ciclos.5
partir de las hebras de plantilla originales Debido a la introducción de una ADN
deseadas. La polimerasa Taq agrega los polimerasa termoestable, la ADN
nucleótidos disponibles al final de los polimerasa Taq una vez, al comienzo de
cebadores recocidos. La extensión de los la reacción de PCR.9 Las propiedades
cebadores por la polimerasa Taq se produce termoestables de la actividad de la ADN
aproximadamente a 72 °C durante 25 polimerasa se aislaron de Thermus
minutos. La ADN polimerasa I no puede aquaticus (Taq) que crecen en géiseres de
usarse para alargar los cebadores como más de 110 °C. y han contribuido en gran
cabría esperar porque no es estable a las medida al rendimiento, la especificidad, la
altas temperaturas requeridas para la PCR. automatización y la utilidad de la reacción en cadena de la
La belleza del ciclo y proceso de PCR es que La enzima Taq puede resistir el calentamiento
es muy rápido en comparación con otras repetido a 94 °C, por lo que cada vez que se
técnicas y cada ciclo duplica el número de enfría la mezcla para permitir que los
copias de la cadena de ADN deseada. cebadores de oligonucleótidos se unan, el
Después de 2530 ciclos, quien esté catalizador para la extensión ya está
realizando el proceso de PCR en una presente.10 Después del último ciclo, las
muestra de ADN tendrá muchas copias de la muestra
de ADN ogriginal
muestras para Y se incuban a 72 °C
eneralmente
durante 5 minutos para rellenar los extremos
sobresalientes de los productos de PCR
recién sintetizados. Para asegurar el éxito,
se debe tener cuidado tanto al preparar la
mezcla de reacción como al establecer las
condiciones del ciclo. Aumentar el número
de ciclos por encima de ~35 tiene poco
efecto positivo porque la meseta se produce
cuando se agotan los reactivos; acumular.
La especificidad de la amplificación depende
de la medida en que los cebadores puedan
reconocer y unirse a secuencias distintas de las secuencias de
X
IJBR [] []
MÉTODOS muestra, sin embargo, la muestra se separa
en un gran número de particiones y la
En biología molecular, la reacción en cadena de reacción se lleva a cabo en cada partición
la polimerasa en tiempo real, también llamada individualmente. Esta separación permite
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa una recolección más confiable y una
en tiempo real, es una técnica de laboratorio medición sensible de las cantidades de
basada en la PCR, que se utiliza para amplificar ácido nucleico.14 La PCR inversa es una
y cuantificar simultáneamente una molécula de variante de la reacción en cadena de la
ADN objetivo. Tradicionalmente, la PCR polimerasa que se usa para amplificar el
se realiza en un tubo y cuando se ADN con una sola secuencia conocida.
completa la reacción, los productos de Una limitación de la PCR convencional es
la reacción (los fragmentos de ADN que requiere cebadores complementarios
amplificados) se analizan y visualizan a ambos extremos del ADN diana, pero
mediante electroforesis en gel. Sin este método permite llevar a cabo la PCR
embargo, la PCR en tiempo real permite incluso si solo se dispone de una secuencia
el análisis de los productos mientras la reacción a
está en
partir curso.
de la cual se pueden diseñar los cebadores.15 Polim
Esto se logra mediante el uso de varios La reacción en cadena es una modificación de la
tintes fluorescentes que reaccionan con el reacción en cadena de la polimerasa destinada a
producto amplificado y pueden medirse con reducir la contaminación en los productos debido
un instrumento. Esto también facilita la a la amplificación de sitios de unión inesperados
cuantificación del ADN. La PCR cuantitativa del cebador.16 La reacción en cadena de la
(QPCR), como se conoce esta técnica, se polimerasa Touchdown es un método de reacción
utiliza para medir la cantidad de un producto en cadena de la polimerasa mediante el cual los
de PCR (generalmente en un procedimiento cebadores evitarán amplificar secuencias no específicas.
de PCR en tiempo real). Es el método Los primeros pasos de un ciclo de reacción
elegido para medir cuantitativamente las en cadena de la polimerasa tienen altas
cantidades iniciales de ADN, ADNc o ARN. temperaturas de recocido. La temperatura
Por lo tanto, la PCR se usa a menudo para de recocido se reduce en incrementos para
determinar si una secuencia de ADN está cada conjunto subsiguiente de ciclos.17
presente en una muestra y el número de sus copias en la muestra.
Otra ventaja de la PCR en tiempo real Aplicaciones de PCR
es la rapidez del ensayo, ya que no es
necesario realizar electroforesis u otro La PCR está ayudando en la investigación y el
procedimiento después de la reacción diagnóstico de un número creciente de
11, 12
de amplificación del ADN. El concepto enfermedades. También ha sido durante mucho
de PCR digital fue concebido en 1992 por Sykes tiempo un método estándar en todos los
et al.13. Es un perfeccionamiento de los laboratorios que realizan investigaciones sobre
métodos convencionales de reacción en cadena o con ácidos nucleicos. Incluso las técnicas de
de la polimerasa que se pueden utilizar para la competencia, como los chips de ADN, a
cuantificar directamente y amplificar clonalmente menudo requieren la amplificación del ADN
ácidos nucleicos, incluidos ADN, ADNc o ARN. mediante PCR como un paso preliminar
La diferencia clave entre la dPCR y la PCR esencial. La reacción en cadena de la
tradicional radica en el método de medición de polimerasa es utilizada por un amplio espectro
las cantidades de ácidos nucleicos, siendo el de científicos en una gama cada vez mayor de
primero un método más preciso que la PCR. La disciplinas científicas. El uso de transcriptasa
PCR lleva a cabo una reacción por cada inversa para evaluar los niveles de ARN y la
extensión
muestra. La dPCR también lleva a cabo una sola reacción dentro dd e
ulna tecnología PCR para cuantificar la amplificación d
e
IJBR [] []
ha traído grandes avances a la aplicación cualquier muestra, ya sea de fluidos
de PCR. Al permitir la determinación y corporales, alimentos o agua potable. La
cuantificación de los cambios en la expresión PCR cuantitativa proporciona información
génica, estas técnicas han brindado una adicional más allá de la mera detección de
mayor comprensión de los procesos de las ADN. Indica no solo si un segmento de
enfermedades y ahora sirven como base ADN específico está presente en una
para el diagnóstico y la investigación muestra, sino también cuánto hay. Esta
científica básica.18 En microbiología y información es necesaria en una serie de
biología molecular, por ejemplo, la PCR se aplicaciones que van desde pruebas de
utiliza en la investigación. laboratorios en diagnóstico médico hasta búsquedas de objetivos e investiga
procedimientos de clonación de ADN, Otra aplicación importante de la PCR
transferencia Southern, secuenciación de cuantitativa es el diagnóstico molecular, es
ADN, tecnología de ADN recombinante, por decir, el diagnóstico de enfermedades basado
nombrar solo algunos. En los laboratorios en hallazgos moleculares en lugar de síntomas
de microbiología clínica, la PCR es fisiológicos. En este sentido, el diagnóstico
invaluable para el diagnóstico de infecciones de enfermedades virales es un área que está
microbianas y estudios epidemiológicos. La adquiriendo una importancia creciente. La
PCR también se usa en laboratorios PCR es la prueba más sensible para las
forenses y es especialmente útil porque solo infecciones por el virus del herpes simple, el
se requiere una pequeña cantidad de ADN virus de la varicela zoster y el virus del
original; por ejemplo, se puede obtener papiloma humano. Están evolucionando otros
suficiente ADN de una gota de sangre o de usos diagnósticos, incluidas las pruebas para
un solo cabello. De hecho, se han informado enfermedades genéticas, cánceres y otras
varios ensayos que utilizan PCR para la enfermedades infecciosas.23 Otra aplicación
detección de una amplia gama de bacterias importante en la que se utiliza la PCR
en muestras de LCR.1921 Dado que el cuantitativa en el campo de las enfermedades
cultivo de C. pneumoniae es difícil en la infecciosas es el SIDA. Puede detectar el
mayoría de los laboratorios clínicos, la virus del SIDA antes durante las primeras
determinación de esta bacteria en muestras semanas después de la infección que la prueba ELISA estánda
clínicas ha sido ampliamente realizado Los factores genéticos siempre están
utilizando la técnica de PCR a pesar de que involucrados en el desarrollo del cáncer. Su
no existe un método de PCR estandarizado contribución varía mucho según el tipo de
para la detección de este organismo. La cáncer. Los genes no solo ayudan a
PCR anidada es uno de estos determinar la progresión de la enfermedad,
protocolos para la detección de solo unas sino que también pueden tener una
pocas bacterias en muestras clínicas.22 influencia sustancial en la eficacia de los tratamientos dispon
Por supuesto, la PCR cualitativa puede Por lo tanto, identificar los genes que
usarse para detectar no solo genes humanos juegan un papel en el desarrollo del
sino también genes de bacterias y virus. cáncer es un paso importante para
Por lo tanto, una de las aplicaciones mejorar el tratamiento. Tanto la PCR
médicas más importantes del método PCR cualitativa como la cuantitativa juegan un
clásico es la detección de patógenos. papel crucial en la lucha contra el cáncer.
Muchos virus contienen ARN en lugar de La PCR puede identificar genes que se
ADN. En tales casos, el genoma viral debe han implicado en el desarrollo del cáncer.
transcribirse antes de realizar la PCR y, por Existen numerosas aplicaciones para la
lo tanto, se utiliza RTPCR. A veces también reacción en cadena de la polimerasa en
es necesario detectar patógenos fuera del cuerpo. Atiempo real en el elaboratorio.
fortunadamente, Se
puuede
l método PCR sa comúnmente
detectar el Ap ara
DN am
de
IJBR [] []
investigación básica y se despliega como una sitios de reconocimiento de endonucleasas añadidos a 25
herramienta para detectar enfermedades de sus extremos 5'.
emergentes, como la gripe, en pruebas de
diagnóstico. La PCR digital tiene muchas CONCLUSIÓN
aplicaciones potenciales, incluida la detección
y cuantificación de patógenos de bajo nivel, El avance de la ciencia ha transformado
secuencias genéticas raras, variaciones en el nuestras vidas de maneras que habrían sido
número de copias y expresión génica relativa impredecibles hace solo medio siglo. Los
en células individuales. La amplificación clonal métodos moleculares han mostrado ser
habilitada por PCR digital de un solo paso es prometedores en este aspecto. La PCR y sus
un factor clave para reducir el tiempo y el aplicaciones son prometedoras desde el
costo de muchos de los métodos de punto de vista científico y médico. La PCR se
"secuenciación de próxima generación" y, por ha convertido rápidamente en una herramienta
lo tanto, permite la genómica personal.14 La esencial para mejorar la salud humana y la
PCR inversa es especialmente útil para vida humana. La PCR ha revolucionado por
determinar las ubicaciones de inserción. Por completo la detección de virus de ARN y
ejemplo, varios retrovirus y transposones se ADN. La PCR es valiosa como prueba de
integran al azar en el ADN genómico. Para confirmación. La PCR es una técnica rápida
identificar los sitios en los que han entrado, con alta sensibilidad y especificidad. También
las secuencias virales o de transposones se ha acreditado que la PCR ha sido capaz
"internas" conocidas pueden usarse para de detectar infecciones mixtas con facilidad
diseñar cebadores que amplificarán una en muchos estudios. La PCR, una técnica
pequeña porción del ADN genómico "externo" más sofisticada, requiere soporte de
flanqueante.15 La reacción en cadena de la infraestructura, es costosa pero, sin embargo,
polimerasa anidada es una parte clave de no se pueden descartar sus ventajas utilitarias,
muchos laboratorios de investigación genética, que son muchas en comparación con los
métodos
junto con usos en la toma de huellas dactilares de ADN de diagnóstico
para análisis forense y octros
onvencionales existentes.
casos de genética
humana.
La PCR convencional requiere cebadores
complementarios a los extremos del ADN REFERENCIAS
diana. Un problema común es la unión de
los cebadores a regiones incorrectas del 1. Bartlett, JMS y Stirling D. Breve
ADN, lo que genera productos inesperados.16 historia de la reacción en cadena de
La RTPCR se usa comúnmente para la polimerasa. Métodos en Biología
estudiar los genomas de virus cuyos Molecular, 2003. 226, 36.
genomas están compuestos de ARN, como 2. Kleppe et al. J. Mol. Biol. 1971, 56,
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el VIH. La PCR se puede utilizar para el 3. Saiki, RK; Scharf S, Faloona F, Mullis KB,
diagnóstico de la leishmaniasis visceral india Horn GT, Erlich HA, Arnheim N
con gran precisión. La PCR también se "Amplificación enzimática de secuencias
puede emplear con una precisión significativa genómicas de beta globina y análisis de
para predecir la curación de la enfermedad.24 sitios de restricción para el diagnóstico
La clonación molecular se ha beneficiado de anemia de células falciformes".
del surgimiento La
de cla
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