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POTENCIAL ANTIOXIDANTE PELO MÉTODO DPPH

(por Mensor et al., 2001)

Este método evalúa la capacidad de una sustancia o extracto para transferir electrones al
radical libre estable DPPH˙ (2,2-difenil-1-picril-hidrazila), de color púrpura, para formar o 2,2-
difenil-1-picril-hidrazina (DPPH-H). La reacción ocurre lentamente en solventes que permitan
enlaces de hidrogeno, como agua, etanol y metanol, motivo por el cual la reacción es
influenciada por el tipo de solvente y pH del medio.
A partir dos resultados obtenidos por espectrofotometría se determina el porcentaje de
actividad antioxidante, esto es, la cantidad de DPPH consumido por la sustancia o extracto. La
absorbancia es reducida y la coloración cambia de violeta para amarillo.

Materiales:
- 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate, DPPH, MW= 394.32 (Sigma-Aldrich),
- Etanol
- Agua
- Balao volumétrico 25 ml

Preparación de la disolución stock de extracto (1 mg/ml):


Pesar 0.01 g de extracto en un frasco ámbar e diluir en 10 ml de etanol. Usar ultrasonido
durante 5 minutos para garantizar la dilución del extracto sin calentar. Mantener la solución
protegida de la luz y siempre con el frasco cerrado.

Nota: Si la masa no fuere exactamente 0.01 g, anotar el valor y realizar la corrección


para obtener la concentración de 1 mg/ml, adicionando el volumen corregido V = m / C

Algunos ensayos comprueban que dependiendo del solvente usado en la obtención del
extracto, el etanol no es el solvente más indicado para solubilizar el extracto, así, usar el
mismo solvente usado en la extracción (agua, hexano, acetona, etc.) puede ocasionar una
actividad antioxidante mayor. Lógicamente, se debe verificar la miscibilidad entre todos los
reactivos involucrados y la formación o no de turbidez y separación de fases, lo que no
permitiría la reacción y, de esta manera, imposibilitaría la evaluación del potencial
antioxidante.

Preparación de la disolución stock de DPPH:


Nota: El DPPH es un polvo violeta que debe ser almacenado en bajas temperaturas
(refrigerador o congelador, siempre que no se lo esté usando para análisis).
- Disolución stock de DPPH 0.3 mM: Pesar exactamente 0.003 g de DPPH en frasco ámbar y
solubilizar en 20ml de etanol PA.
Transferir la solución para un balón volumétrico de 25ml y completar el volumen con etanol.
Caso sea necesario, usar el ultrasonido durante 5 minutos para la dilución completa sin
calentamiento.
La solución debe ser mantenida protegida de la luz, en refrigeración y con el balón siempre
cerrado para evitar la evaporación mientras no esté en uso. En caso de que sobre, se
recomienda utilizar el restante de la solución hasta un mes cuando sea almacenado en
congelamiento, sin embargo, se debe resaltar la importancia de preparar la solución de DPPH
únicamente el día de análisis.

Preparación del medio de reacción:

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Con la solución stock del extracto (1mg/ml), diluciones serán hechas en triplicata en
concentraciones: 500, 250, 125, 50, 25, 10 µg/ml, según la regla de la dilución C1xV1 = C2xV2,
recordando que el volumen final es de 2500 µl (para usar menos reactivos/extracto, en casos
de rendimientos de extracción muy bajos, ver NOTA 3).
Para cada dilución solamente un blanco debe ser preparado (extracto en la respectiva
concentración con el solvente de solubilización – etanol). El control negativo será únicamente
el solvente usado en la dilución y DPPH. Identificar los tubos y proceder a la adición de los
reactivos según la siguiente tabla:

Tabla 1: Preparo dos tubos de ensaio


Concentración (μg/mL)
0
(control 5 10 50 125 250 500
negativo)
Tubos A (ensayo de la muestra) en triplicata
Solvente (μL) 2500 2487,5 2475 2375 2187,5 1875 1250
Extracto (μL) 0 12,5 25 125 312,5 625 1250
DPPH (μL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Tubos B (blanco de la muestra)
Solvente (μL) 3500 3482,5 3465 3325 3062,5 2625 1750
Extracto (μL) 0 17,5 35 175 437,5 875 1750

Homogenizar los tubos tapados con un vortex e incubar en un lugar oscuro a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Encender el espectrofotómetro y esperar su estabilización.

Seleccionar la longitud de onda 517 nm. Encerar el espectrofotómetro con etanol, leer la
absorbancia de los tubos B y A.

Lavar la cubeta con agua entre las muestras y anotar los valores de las absorbancias.

Cálculos de resultados:

Registrar en una tabla (por ejemplo en el formato de la tabla 2), los resultados de absorbancia
obtenidos para cada concentración, en triplicata y el respectivo blanco.

Tabla 2: Resultados de la espectrofotometría


Concentración (μg/ml) Absorbancia
Blanco Muestras
0 (control negativo)
5
10
50
125
250
500

Calcular el porcentaje de inhibición de la muestra analizada con el radical DPPH a partir de la


conversión en porcentaje de la actividad antioxidante (AA) a partir de la ecuación:

(𝐴𝐵𝑆𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝐵𝑆𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 ) ∗ 100


𝐴𝐴(%) = 100 − [ ]
𝐴𝐵𝑆𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

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Completar la Tabla 3 con los valores de actividad antioxidante

Tabla 3: Resultados AA

Concentración (μg/ml) AA [%]


5
10
50
125
250
500

Graficar la concentración (eje x) vs. Actividad antioxidante (eje y) y trazar las tres ecuaciones
de la recta y=ax + b. con la ecuación de la recta (y = ax + b), se realiza el cálculo del valor EC 50
así:
𝑌−𝑏 50 − 𝑏
𝑌 = 𝑎𝑋 + 𝑏 ∴ 𝑋 = ∴𝑋=
𝑎 𝑎
El valor EC50 es la concentración mínima eficaz necesaria para disminuir la cantidad inicial de
DPPH en 50%.
Para calcular o EC50 de forma confiable es necesario:
a) La ecuación de la recta debe contener el valor de AA = 50% aproximadamente en el
centro.
b) La regresión linear debe presentar un valor de R2 lo más próximo posible a 1.
c) La regresión debe ser hecha con mínimo tres puntos, pero, mientras más puntos
posibles (en un intervalo de aproximadamente 20-80%), menor será el error de
análisis, siempre y cuando las premisas anteriores a y b sean respetadas (inserción de
AA = 50% en la regresión, comportamiento linear).

Observación importante: En el caso de que la AA del extracto fuera mucho menor o mucho
mayor que 50%, no se debe calcular EC50 por la ecuación obtenida, y se debe repetir el
experimento, concentrando o diluyendo el extracto respectivamente. Para algunos extractos,
el comportamiento entre AA y la concentración no es lineal, entonces se sugiere graficar la
concentración en escala logarítmica. Por eso los puntos a ser escogidos deben ser lo más
próximos posibles a AA=50%, con la intención de considerar la parte rectilínea de la curva
sigmoidea (teorema del triángulo rectángulo). Los resultados de la AA de diferentes extractos
deberán ser comparados por el mismo método de cálculo.

Referências
MENSOR, L. L.; MENEZES, F. S.; LEITÃO, G. G.; REIS, A. S.; SANTOS, T. C.; COUBE, C. S.; LEITÃO,
S. G. Screening of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH Free
Radical Method. Phitotherapy Research, v.15, 127-130, 2001.
ALEXANDER, B., BROWSE, D. J., READING, S. J., & BENJAMIN, I. S. (1999). A simple and accurate
mathematical method for calculation of the EC 50.Journal of pharmacological and toxicological
methods, 41(2), 55-58.

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NOTA: debido al bajo rendimiento de extracción o poca cantidad de muestra, se sugiere el uso
de un volumen de medio de reacción reducido en 2.5 veces, de forma que las reacciones
sucedan en tubos eppendorf con un volumen final de 1400 µl. La tabla 1 es substituida por la
tabla 1.a a continuación. Los demás procedimientos continúan semejantes. Realizar la lectura
en espectrofotómetro con cubeta de 1 ml.

Tabela 1a: Preparo dos tubos eppendorf

Concentración (μg/mL)
0 (controle
5 10 50 125 250 500
negativo)
Tubos A (teste de amostra) em triplicata
Solvente (μL) 1000 995 990 950 875 750 500
Extrato (μL) 0 5 10 50 125 250 500
DPPH (μL) 400 400 400 400 400 400 400
Tubos B (branco da amostra)
Solvente (μL) 1400 1393 1386 1330 1225 1050 700
Extrato (μL) 0 7 14 70 175 350 700

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