Determinación de proteínas por el método de Bradford

Objetivo:
El estudiante cuantificará proteínas utilizando Método de Coomasie (Bradford).
Fundamento método de Coomasie (Bradford)

Material
Vaso de precipitado
Tubos de ensaye
Pipetas graduadas
Micropipetas de varias medidas
Gradilla
Reactivos:
Solución estándar de albúmina 1mg/ 1ml
Solución de trabajo de Bradford
Buffer de Fosfatos
 1. Prepare una serie de tubos como se indica en la siguiente tabla:

Tubos B 1 2 3 4 5 6 7 8 P1 P2

Solución estándar (µl) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 - -

Solución problema (µl) - - - - - - - - - 500 500

Buffer de fosfatos pH 7.0 (µl) 1000 995 990 985 980 975 970 965 960 500 500

Reactivo Bradford (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

2. Agitar en vórtex y leer absorbancia a 595nm.

3. Anotar los resultados en la siguiente tabla:

Concentración Absorbancia (595nm)
Tubo
(µg/ml)

4. Graficar la curva patrón, en el eje “X” la concentración de albúmina y en el “Y” la

absorbancia, ajustar por mínimos cuadrados.
5. Calcular la concentración de proteína µg de proteína/ ml para la muestra problema.
 Método del sulfúrico-fenol
1. Preparar la curva de calibración con los volúmenes establecidos en la tabla utilizando
una solución estándar de glucosa a una concentración de 1 mg/ ml

Tubo Concentración de Solución Agua Destilada

Glucosa (µg/ml) estándar (ml) (ml)
Blanco 0 0 1.0
1 100 0.10 0.90
2 200 0.20 0.8
3 300 0.30 0.7
4 400 0.40 0.6
5 500 0.50 0.5
6 600 0.6 0.4
7 700 0.7 0.3
8 800 0.8 0.2
9 900 0.9 0.1
10 1000 1.0 0.0
11* Problema 0.1 0.9
12* Problema 0.1 0.9

2. Agregar 3 ml de H2SO4 agitar con cuidado, dejar enfriar en baño de hielo 2 minutos,
agregar 2 ml de fenol al 5%, agitar y reposar 30 minutos. Agitar con cuidado, leer
absorbancia a 490 nm.
Tratamiento de la muestra
* Pesar 10 g de muestra agregar 30 ml de agua destilada y colocar en baño María 30
minutos a 60 °C, filtrar y aforar a 100 ml
*Tomar de la solución preparada 0.1 ml y llevarlo a un volumen de 10 ml, de esta solución
medir 0.1 ml y agregar 0.9 ml de agua (se hace por duplicado) tubos 11 y 12.