TRABAJO

PRACTICO
INTEGRANTES:
Yerco Mirones Fernandez 23268
Daniela Romina Martinez Santillan 24037
Brigette Karen Zarate Garnica 22912
Ingrid Rosario Ramos Vallejos 22661
Abigail Yazmin Xalizaya Nina 22605
Dayna Paola Flores Eulate 22749
Yulisa Ivonne Ayma Cabezas 17707
Claudina R Huanca Calle 25591
MATERIA: Control de Medicamentos 1

ORURO-BOLIVIA
METODOS MICROBIOLOGICOS
Los métodos microbiológicos se han
basado clásicamente y aún se basan
esencialmente en la detección y
cuantificación de microorganismos según
su capacidad de crecer en un medio de
cultivo específico y posterior confirmación
del aislado mediante ensayos bioquímicos
o inmunológicos. El aislamiento en cultivo
permite disponer del microorganismo
investigado, su identificación, el estudio
de sensibilidad a los antimicrobianos y
además facilita la aplicación de
marcadores epidemiológicos.

¿QUE SON LOS ENSAYOS MICROBIOLOGICOS?

Los ensayos microbiológicos son muy importantes ya que permiten verificar y evaluar la seguridad
higiénica del producto, determinando la carga microbiana presente y los posibles puntos de
contaminación para tomar acciones y eliminar los focos de contaminación que puedan provocar un
riesgo en la salud.

¿QUE ES EL UNGÜENTO?
Los ungüentos son preparaciones semisólidas que se aplican a la piel, los ojos y las membranas
mucosas que generalmente tiene una consistencia aceitosa o grasosa y pueden sentirse rígidas
cuando se aplican sobre la piel. Son a base de aceite (80% de aceite y 20% de agua) y no contienen
conservantes. Son los más absorbentes y proporcionan una barrera oclusiva sobre la piel que evita
la perdida de humedad, permitiendo el mayor beneficio.
Los ungüentos o pomadas, están constituidos por grasas o sustancias de parecidas características
que presenten aspecto semisólido a 25 °C. Es esta propiedad física lo que realmente las define ya
que la composición química es enormemente variada. A nivel químico, los ungüentos son muy
variados. La característica en común es su composición
grasa y que generalmente se encuentran, a temperatura
ambiente, en un estado semisólido.
Lo habitual es que la base del ungüento sea vaselina, que
es una combinación de hidrocarburos. También puede
usarse lanolina o parafina líquida. Entre los ingredientes
frecuentes aparecen distintas clases de aceites (como
aceite de almendras o aceite de sésamo) y cera de abeja.
Los usos de los ungüentos pueden variar. Muchas veces se
emplean para el tratamiento de lesiones secas y para
mejorar las condiciones de la piel cuando este órgano se
encuentra agrietado o excesivamente seco.
Diversos tipos de erupciones, quemaduras, sarpullidos, heridas y otros problemas cutáneos pueden
ser tratados con ungüentos.

TIPOS DE UNGÜENTO
Hay cuatro clases generales de ungüentos:

 Bases de hidrocarburos (bases de pomadas oleaginosas) que mantienen los medicamentos

en contacto con la piel y pueden actuar como humectantes.
 Bases de absorción, que incorporan soluciones a base de agua que permiten una mejor
absorción de algunos medicamentos y también se pueden utilizar para hidratar.
 Las bases removibles en agua son emulsiones de aceite en agua que contienen vaselina,
lanolina anhidra o ceras que se lavan más fácilmente de la piel con agua y se usan con más
frecuencias con razones cosméticas.
 bases solubles en agua (bases de ungüentos sin grasa) que contienen solo sustancias
solubles en agua.
Hay muchas formas de medicamentos disponibles en forma de pomadas. Algunas preparaciones
comunes incluyen:

 Esteroides tópicos: se usa para tratar afecciones inflamatorias de la piel, como la hiedra
venenosa o el eccema.
 Humectantes: los ejemplos incluyen Eucerin, Aquaphor y Vaseline.

 Ungüento Antibiótico: los ejemplos incluyen sulfato de neomicina, sulfato de polimixina B,

bacitracina y sulfato de polimixina B.

¿EN QUE NOS AYUDA EL ANALISIS MICROBIOLOGICO?

El análisis microbiológico ayuda a mantener bajo control la proliferación de virus, bacterias y
microorganismos que pueden causar contaminación, intoxicación y enfermedades.

Los ensayos microbiológicos en ungüentos podemos realizarlo por:

 Recuento total de microorganismos aerobios

 Método en placa
  Método tubos múltiples
 Prueba de ausencia de Staphylococcus aureus
 Prueba de ausencia de Pseudomona aeruginosa
 Prueba de ausencia de Salmonella spp
 Prueba de ausencia de Echerichia coli
 Recuento total combinado de hongos y levaduras

1. RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS

El recuento total aerobio es una técnica general ampliamente utilizada para estimar el número de
microorganismos en muestras. El recuento total aerobio se utiliza como un indicador de la
población bacteriana en las muestras y resulta útil para evaluar su calidad.

El procedimiento general para realizar un recuento total aerobio incluye la preparación de la

muestra, diluciones decimales, montaje de las diluciones en placas en un medio apropiado,
incubación de las placas y recuento.

Las diluciones decimales se realizan para poder tener placas en las que se puede contar fácilmente
y con precisión el número de colonias.

Estas diluciones consisten en colocar un volumen de la muestra en un volumen de diluyente en una

relación 1:10, como por ejemplo 11 ml de muestra en 99 ml de diluyente o 10 ml de muestra en 90
ml de diluyente. Estos dos últimos ejemplos son los volúmenes aceptados en los métodos oficiales y
son los que tradicionalmente se utilizan.
 METODO DE PLACA

Fundamento.

En este método incluyen la siembra, identificación y conteo de bacterias. En este método la

muestra se realiza sucesivas diluciones y una pequeña muestra de cada dilución se coloca en una
caja para la siembra de bacterias, las colonias que aparecen después de la incubación son
contadas, asumiendo que cada colonia se formó de una sola bacteria, el número total de bacterias
se establece de acuerdo con la dilución.

El recuento en placa es uno de los métodos más utilizados para determinar cuál es el número de
microorganismos viables en un medio líquido. Cuando la concentración es baja se procede a filtrar
la muestra a través de una membrana que será pasada al medio de cultivo, en una placa de Petri.

Material y equipo

 Balanza

 Pipeta 10 ml

 Pipeta 1 ml

 Cajas Petri

 Baño maria

 Incubadora

 Cuenta colonias

 Termómetro

 Frasco de dilución

Medios y reactivos

 Solución amortiguadora de fosfato pH 7.2

 Medio agar digerido de caseína y soja

PROCEDIMEINTO

1) Preparar una suspensión agregando una cantidad mínima de un agente emulsionante estéril
adecuado (uno de los polisorbatos).

2) Mezclar con un agitador mecánico.

3) Calentar a una temperatura de 45 oC si fuera necesario.

4) Medir 10 mL de la suspensión de la muestra y disolver en solución amortiguadora de Fosfato pH

7.2 para obtener 100 mL. Diluir aun más si fuera necesario en diluciones decimales de 10-2, y 10-3,
para que 1 mL permita obtener entre 30 y 300 colonias.
5) Pipetear 1 mL de la dilución final y transferir a dos placas de Petri estériles; agregar
inmediatamente, a cada placa, de 15 a 20 mL de Medio Agar Digerido de Caseína y Soya,
previamente fundido y enfriado a una temperatura aproximada de 45ºC.

6) Cubrir las placas de Petri.

7) Mezclar la muestra, inclinando ligeramente o rotando suavemente las placas sobre una
superficie plana (técnica del ocho) y dejar que el contenido se solidifique a temperatura ambiente.

8) Invertir las placas de Petri e incubar durante 48 a 72 h a una temperatura de 30 a 35oC.

9) Una vez finalizada la incubación, examinar las placas para verificar crecimiento de
microorganismos.

10)Contar el número de colonias y expresar el promedio de las dos placas en términos del número
de microorganismos por g o por mL (UFC/g ó UFC/mL) de muestra.

11)En caso de no recuperarse colonias microbianas de las placas que representan la dilución inicial
(1:10) de la muestra, expresar los resultados como “menor de 10 por g o por mL de muestra.
 PRUEBA DE AUSENCIA DE ESCHERICHIA COLI

La prueba de ausencia de Escherichia coli en muestras de medicamentos no estériles comprende la

inoculación de la muestra en Medio Líquido de Lactosa, en la cual se comprueba el crecimiento de
microorganismos coliformes Gram negativos; de ésta se toman pequeñas porciones con asa para
inocular en Medio Agar McConkey y si presenta el crecimiento de colonias sospechosas, se realiza
una prueba confirmativa de E. coli, la cual consiste en resembrar las colonias sospechosas en
Medio Agar Levine con Eosina-Azul de Metileno

EQUIPO, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVOS

Equipo

a) Pipeta de 1 mL estéril

b) Mortero y pistilo

c) Balanza

d) Asa de inoculación

e) Incubadora

f) Cajas petri

g) Erlenmeyer de 250 mL

Medios de cultivo y reactivos

a) Medio Líquido de Lactosa

b) Medio Agar McConkey.

c) Medio Agar Levine con Eosina-Azul de metileno

d) Polisorbato

PROCEDIMIENTO

1) Preparar una suspensión agregando una cantidad mínima de un agente emulsionante estéril
adecuado (uno de los polisorbatos).

2) Mezclar con un agitador mecánico.

3) Calentar a una temperatura de 45 ºC si fuera necesario.

4) Medir 10 mL de la suspensión de la muestra y adicionar a 90 mL de Medio Líquido de Lactosa

para obtener 100 mL, mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35ºC durante 24 h.

5) Examinar el medio para verificar el crecimiento, el cual no debe de presentar turbidez. Si

presenta turbidez, continuar con la prueba.
6) Mezclar el medio agitando suavemente (conservar el contenido del Medio Liquido de Lactosa)

7) Con la ayuda de un asa de inoculación, realizar estrías con una porción del Medio Líquido de
Lactosa sobre la superficie del Medio Agar McConkey.

8) Cubrir las placas, invertirlas e incubar a una temperatura de 30 a 35 ºC durante 12 a 24 h

9) Examinar las placas. Si no presentan colonias conformes a la descripción dada en la tabla, la

muestra cumple con los requerimientos para la prueba de ausencia de Escherichia coli, de lo
contrario proceder con una identificación adicional.

10)Transferir colonias sospechosas representativas individualmente con un asa de inoculación a la

superficie de Medio Agar Levine con Eosina-Azul de metileno (EMB) colocado en cajas de petri.

NOTA: Si debe transferirse un número grande de colonias, dividir la superficie de cada placa en
cuadrantes y sembrar cada uno de ellos con colonia diferente.

11)Cubrir las placas, invertirlas e incubar a una temperatura de 30 a 35 ºC durante 12 a 24 h.

12)Examinar las placas y ninguna de las colonias debe exhibir un brillo metálico característico bajo
luz reflejada ni presentar una apariencia negro azulada bajo luz transmitida, si lo presentan la
muestra no cumple con la prueba de ausencia de Escherichia coli.

DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO.
Examinar las placas y ninguna de las colonias debe exhibir un brillo metálico característico bajo luz
reflejada ni presentar una apariencia negro azulada bajo luz transmitida, si lo presentan la muestra
no cumple con la prueba de ausencia de Escherichia coli.

Tabla. Características Morfológicas de Escherichia coli en Medio Agar McConkey.

 RECUENTO TOTAL COMBINADO DE HONGOS Y
LEVADURAS

Agente emulsionante: (emulsionante) Sustancia química que permite que la grasa se fraccione en
pequeños glóbulos que quedan en suspensión en un medio acuoso.

Hongo: organismos protistas no fotosintéticos que se proliferan como una masa de filamentos
ramificados entrelazados (hifas), que se conoce como micelio.

Moho: Hongos con formas miceliales (hifas).

Levadura: célula mitótica sencilla oval o redonda, que no forman micelio y forman yemas para
reproducirse.

Los hongos son un grupo de diversos organismos unicelulares que se alimentan mediante la
absorción directa de los nutrientes.

La mayoría de los hongos están constituidos por finas fibras que contienen protoplasma, llamadas
hifas. Los hongos se reproducen por esporas, diminutas partículas de protoplasma rodeado de pared
celular.

Para el recuento se realizará el análisis por medio del método de placa vertida.

EQUIPO, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVOS

Material y Equipo

 Balanza
 Pipeta de 10 mL estéril
 Pipetas de 1 mL estéril
 Cajas petri
 Baño de Maria
 Incubadora
 Cuenta colonias

Medios y Reactivos

 Solución Amortiguadora de Fosfato pH 7.2

 Medio Agar Sabouraud Dextrosa
 Medio Agar Papa Dextrosa

PROCEDIMIENTO

MÉTODO EN PLACA

1) Preparar una suspensión agregando una cantidad mínima de un agente emulsionante

estéril adecuado (uno de los polisorbatos).

2) Mezclar con un agitador mecánico.

 3) Calentar a una temperatura de 45 ºC si fuera necesario.

4) Medir 10 mL de la suspensión de la muestra y disolver en solución amortiguadora de

Fosfato pH 7.2 para obtener 100 mL. Diluir aún más, para que 1 mL permita obtener
entre 30 y 300 colonias.

5) Pipetear 1 mL de la dilución final y transferir a dos placas de petri estériles; agregar

inmediatamente, a cada placa, de 15 a 20 mL de Medio Agar Papa Dextrosa o Medio
Agar Sabouraud, previamente fundido y enfriado a una temperatura aproximada de
45ºC.

6) Cubrir las placas de petri.

7) Mezclar la muestra, inclinando ligeramente o rotando suavemente las placas y dejar que
el contenido se solidifique a temperatura ambiente.

8) Invertir las placas de petri e incubar durante 5-7 días.

9) Una vez finalizada la incubación, examinar las placas para verificar crecimiento de
microorganismos.

10) Contar el número de colonias y expresar el promedio de las dos placas en términos del
número de microorganismos por g ó por mL de muestra.

11) En caso de no recuperarse colonias microbianas de las placas que representan la dilución
inicial (1:10) de la muestra, expresar los resultados como “menor de 10
microorganismos por g o por mL de muestra”.

CÁLCULOS

Contar el número de colonias y expresar el promedio de las dos placas en términos del número de
microorganismos por g ó por mL (UFC/g ó UFC/mL) de muestra.

CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Para el recuento se aceptan las cajas que contengan de 30-300 colonias usando una cuenta colonias
de Québec.

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

1) Todos los utensilios y recipientes necesarios para pesar y preparar las muestras deben
encontrarse completamente estériles para evitar contaminación.

2) La temperatura del Medio Agar Digerido de Caseina y Soya, no debe ser mayor de 45º C
al momento de verterlo.

3) Mezclar las placas varias veces con la técnica del ocho para asegurar la correcta y
completa distribución de la muestra en el medio.

4) No deben de colocarse en columnas las cajas petri cuando se les está vertiendo Agar y
cuando se está solidificando.