METODOS PARA APLICACIN DE COLORANTES Y REACTIVOS A

CELULAS VIVAS
En Microbiologa las tinciones se realizan a partir de suspensiones de
microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La
fijacin, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede
llevar a cabo con los diferentes tratamientos: fijacin por calor o fijacin
qumica. La fijacin por calor es la ms utilizada para la observacin de
bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la
suspensin bacteriana extendida y seca, a travs de una llama de un mechero.
La fijacin por calor preserva la morfologa externa de los microorganismos
pero no las estructuras internas. La fijacin qumica con gentes como etanol,
folmaldehido y cido actico entre otros muchos, se utiliza para preservar las
estructuras celulares.
Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tincin positiva es la ms
frecuente, en ella un colorante se une a ciertas estructuras microbianas. Todos
los colorantes utilizados en microbiologa tienen en comn la presencia de
grupos cromforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los
responsables del color mediante la unin a estructuras celulares por enlaces
inicos, covalentes o hidrfobos, los que establecen enlaces inicos son los
ms frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces covalentes
destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tincin de DNA, donde el
colorante se une a la desoxi-ribosa.
Por otra parte, en la tincin negativa se utilizan compuestos que no penetran en
las clulas sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos
parecen refringentes sobre un fondo negro.
OBSERVACIN IN VIVO
Mtodo de la gota pendiente
Este procedimiento es la forma ms sencilla de observacin de organismos
vivos, nos proporciona informacin sobre la morfologa, tamao, color y ovilidad
de las bacterias. Sin embargo, debido a la falta de contraste con el entorno es
una prctica que se utiliza nicamente para la observacin del movimiento.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Escherichia coli y Pseudomonas sp. en medios de
cultivo lquido (caldo triptona soja), vaso lavador, portaobjetos excavado,
cubreobjetos, asa de siembra, pipeta Pasteur, aceite de inmersin.
Procedimiento
Tomar una gota de un cultivo lquido reciente (24 horas) usando un asa de
siembra o una pipeta Pasteur estril.
Colocar en el centro de un cubreobjetos y aadir cuatro pequeas gotas de
aceite en los cuatro extremos.
Colocar el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando que la
gota

quede situada en el centro de la depresin.

Dar la vuelta al portaobjetos .
Colocar una gota de aceite de inmersin y observar con objetivo de
inmersin (100x).
Esta tcnica permite observar el desplazamiento rpido y rectilneo o dando
giros y volteretas en aquellas bacterias que tienen flagelos. Las bacterias
inmviles presentan un movimiento vibratorio denominado movimiento
browniano, debido al choque de las molculas en una solucin lquida.
OTROS METODOS
Mtodo de observacin directa en contraste de fases o interferencia
diferencial
En este caso la suspensin de microorganismos se observa con un
microscopio de contraste de fases o interferencia diferencial (DIC) que permiten
el aumento del contraste. El microscopio de contraste de fases utiliza un
condensador con un diafragma anular opaco con un anillo transparente que
provocan variacin de la longitud de onda dependientes de la densidad y el
ndice de refraccin de la muestra, se observan las clulas ms brillantes sobre
un fondo oscuro. El microscopio de interferencia diferencial permite la
observacin tridimensional de la muestra por la incorporacin de prismas que
generan haces de luz polarizada que se cruzan, incrementando las diferencias
entre los componentes celulares por lo que es muy til para la observacin de
esporas, inclusiones, filamentos septados o vainas entre otros.
Material necesario
Cultivos bacterianos en medio lquido, portaobjetos y cubreobjetos, pipetas
Pasteur, aceite de inmersin.
Procedimiento
Se deposita una gota de la muestra sobre un cubreobjetos y se coloca encima
un portaobjetos excavado. La preparacin se observa directamente al
microscopio de contraste de fases o de DIC.
TINCIONES
Tincin negativa
No se trata de una tincin propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes
con cromforos, ni se lleva a cabo ninguna reaccin entre estructuras celulares
los colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solucin de
nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que
formarn una pelcula opaca a la luz. En este tipo de tincin se prescinde de la
fijacin por calor, se deja secar la preparacin y se observan los
microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro
TINCIN SIMPLE

La mayora de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son

colorantes derivados de las anilinas, sales orgnicas intensamente
pigmentadas que proceden del alquitrn.
Se denominan colorantes bsicos si el cromforo (porcin coloreada) de la
molcula est cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta (Fig. 5) y azul
de metileno son colorantes bsicos. Otros colorantes de esta categora
utilizados con frecuencia en bacteriologa son safranina, fuchina bsica y verde
malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los
procariotas tienen un pH interno prximo a la neutralidad (pH 7.0) y una
superficie celular cargada negativamente, as los colorantes bsicos son los
ms eficaces. Colorantes cidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y
fuchina cida tiene un cromforo cargado negativamente y son utilizados para
teir positivamente ciertos componentes como las protenas.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus, frasco
lavador, cristalizador, soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de
siembra, aceite de inmersin.
Procedimiento
Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea alcuota de
un cultivo bacteriano con el asa de siembra estril.
Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con
el asa de siembra. Dejar secar.
Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el
portaobjetos.
Cubrir con una pelcula de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1
minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Aadir una gota de aceite de inmersin.
Observar con objetivo de inmersin (100 x).
La tincin simple nos proporciona exclusivamente informacin acerca de la
forma, tamao y tipo de agrupacin de los microorganismos. Sin embargo tiene
la ventaja de ser un mtodo muy sencillo y rpido.
TINCIN DIFERENCIAL
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiologa; consisten
en la aplicacin de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un
paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos
distintos o entre determinadas clulas dentro de una poblacin. La

diferenciacin puede ser provocada por un agente qumico o fsico, permitiendo

observar dos tipos de respuestas diferentes a la tincin en una misma muestra.
Las dos tinciones diferenciales mas utilizadas en bacteriologa son la tincin de
gram y la tincin de cido-alcohol resistencia.
TINCION DE GRAM
Material necesario:
Cultivo de bacterias, levaduras, vino agriado.
Antibiticos.
Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 cc de agua destilada).
Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potsico en 100 cc de agua destilada).
Fucsina bsica (1 g de fucsina bsica en 100 cc de agua destilada).
Aceite de inmersin.
Microscopio
Portaobjetos, asas de cultivo, mechero, cpsulas de Petri, tubos de ensayo.
Papel secante.
Mtodo
En un porta objetivo bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se
coloca una gota de agua destilada a la que. con el asa de siembra,
previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequea cantidad de
suspensin de bacterias o, en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la
extensin por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta
que se seque.
Procedimiento para Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95 (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina bsica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro

Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una gota muy pequea
de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
Observaciones
Se coloca una gota de aceite de cedro sobre la preparacin. Se enfoca,
preferentemente, con el micromtrico.
Despus de utilizar el objetivo de inmersin debe limpiarse con xilol
COLORANTES PARA MUESTRAS VIVAS
Azul de metileno, el cristal violeta, la safranina el verde Jano.
JUSTIFICACION
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna
afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados
con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan
con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales
como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes
catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se
combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como
muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo
Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de
este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a
menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un
ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Si se desea simplemente
incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los
procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante
simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es
especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras
naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.
Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn
vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un
organismo vivo. Algunos ejemplo, el verde Jano y el azul de metileno.
Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos
vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden.
Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de
clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el
mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del
portaobjetos. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque
habitualmente se realiza con etanol o metanol.
En conclucion se puede decir que las celulas vivas
FUENTES DE CONSULTA

Anonimo. (2015). Tincin hematoxilina-eosina. 12-03-2016, de Wikipedia Sitio

web: https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_hematoxilina-eosina
Anonimo. (2015). Tincin. 12-03-2016, de Wikipedia Sitio
web:https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n
Anonimo. (2014). Tinciones. 12-03-2016, de Instituito de investigacion
Mercedes y Martin Ferrer Sitio web:
http://www.immf.uncor.edu/index.php/es/ser/14-sample-data-articles/142