UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA II

Nombre: Karen Silva NRC: 3545 Fecha: 2019-11-27

MÉTODOS DE RECUENTO BACTERIANO APLICADOS A ANÁLISIS DE

ALIMENTOS Y AGUA

Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este

número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede
usarse como índice de su presencia. No debe considerarse un indicador de las
características higiénicas generales del alimento. Dependiendo de las características del
medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no
láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos,
psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes.
En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes
(anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío),
puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales (Rodríguez, 2014).

- Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.

1. Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del

alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el
método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características
del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie,
aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicótropa.
Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal
o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones
progresivamente más diluidas de la muestra (Martín, 2006).

2. Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros

con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se
coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber
sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la
epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los
ácidos nucleicos) (Biomérieux, 2018).

3. Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en inglés de Direct Epifluorescence

Filter Technique (técnica de epifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las
bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se
trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir las células
bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir
las células somáticas). La detección de los microorganismos ha de hacerse mediante
microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la
epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que
son más fácilmente detectables (UNAM, 2017).

4. Contaje de micro-colonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agar-

cultivo a un porta y se incuba para seguir la formación de micro-colonias al microscopio
(Anmat, 2014).
5. Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan
gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el
crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubación (Sánchez, 2017).

6. Films secos (Petrifilm): Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales

o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la
incubación se hace el recuento (Martín, 2006).

7. Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo

estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer
con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco exacto (Anmat, 2014).

8. Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul de metileno o

resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto
es medible. Usado en medios líquidos (lácteos) (Sánchez, 2017).

9. Tubos rodantes: son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se
forma una fina capa de agua. Útiles para recuento de anaerobios (UNAM, 2017).

10. Contaje microscópico directo: Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen

determinado y se recuentan las bacterias (Rodríguez, 2014).

RECUENTO EN PLACA

Permite la determinación de los microorganismos presentes en una muestra en base a

que se desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se
determinan por este método sólo las células microbianas VIABLES en las condiciones
de trabajo (nutrientes, atmósfera, temperatura). Como las colonias pueden originarse
tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: UNIDADES
FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Además, a los efectos de que todas las células
que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los
errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas de conteo se
dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias o menos según sea el caso (Biomérieux,
2018).

Siembra en superficie:
Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL
de cada dilución. Se realiza duplicado para cada dilución. Se emplea la misma pipeta
para todas las diluciones y se comienza por la más diluida. Luego de realizada la
descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas,
usando rastrillo estéril, en el mismo orden que la siembra (o sea de la más diluida a la
más concentrada) (Biomérieux, 2018).
Siembra incorporada:
Se procede de la dilución mayor a la menor, y se deposita 1 mL de cada dilución en
placas estériles, vacías, por duplicado. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20
mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45°C en
baño o estufa. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con
movimiento circular, horario (4 veces o más para polvos insolubles) y antihorario (4
veces) y movimiento hacia arriba y hacia abajo (siempre sin levantar la placa de la
mesa) (Biomérieux, 2018).

NÚMERO MÁS PROBABLE o MÉTODO DE LOS TUBOS MÚLTIPLES

Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de

microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción
en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Se analizan en forma paralela
por triplicado o quintuplicado porciones de la muestra cada vez menores que se dejan
crecer en medio líquido.
Según el tipo de microorganismo que se desea contar se utilizan medios de
enriquecimiento selectivo, o medios de propagación.
En función de esto se pude considerar como positivos aquellos tubos en los que:

a) Hubo crecimiento
b) Hubo crecimiento y se produjo gas que se ve en campana invertida (Durham)
c) Hubo crecimiento y se produjo viraje de indicador
d) Hubo crecimiento y se produjo pigmento

Cada tubo positivo, significa que en la cantidad de muestra en él sembrada había por lo
menos 1 microorganismo de los que se está contando.
La interpretación de los resultados, se hace en base a una distribución de tipo Poisson, y
en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se
siembra en cada serie de tubos (Martín, 2006).

FILTRACION POR MEMBRANA

Este método consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra líquida, o

solución en agua o en solvente apropiado (miristato de isopropilo) a través de un filtro
de membrana estéril (diámetro 50 mm, poro 0.45mm), colocado en un equipo de
filtración. Luego de enjuagar con soluciones estériles apropiadas se retira el filtro, y se
lo coloca sobre la superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo a utilizar e
incuba. Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiología se emplean de
nitrato o acetato de celulosa generalmente, y pueden tener bordes hidrofóbicos, que
minimizan la adsorción de conservadores y antimicrobianos. Luego de transcurrido el
tiempo de incubación, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se considera
que las condiciones óptimas del método se dan cuando desarrollan entre 20 y 200
colonias en el filtro (UNAM, 2017). Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para
el conteo:
 
1) Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retículo, o menos, se cuentan todas.
2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia,
multiplicando por 100 para obtener el número de colonias en el filtro (se multiplica por
100 porque el área del cuadrado representa la centésima parte del área total del filtro).
3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por
100.
4) Si hay más de 20 se considera >2000 por filtro

RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO

Este método permite determinar el número de células microbianas, por observación a
través del microscopio. La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en
medio líquido), o puede prepararse una dilución tal como se realiza para otros métodos
de recuento. Se basa en contar microorganismos en una cantidad conocida de muestra
utilizando frotis coloreados, cámaras del tipo de las de contar glóbulos, o las
especialmente diseñadas para contar hongos en alimentos como la cámara de Howard.
Se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES).
Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados
metabólicos de las células. Por ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de
levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las células VIABLES (no absorben
el colorante, se verán transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se
verán azules).
 
Recuento sobre frotis coloreado

Se marca sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 1 cm de lado.

Sobre la superficie opuesta del portaobjetos, se deposita en el centro 0.01 mL de
muestra ya sea con ansa calibrada o con pipeta. Se extiende por todo el cuadrado con
ansa. Se deja secar en posición horizontal. Se fija y colorea, ya sea por Gram o con azul
de metileno 1 minuto (método de Breed para leche). Se observa por inmersión,
contando los microorganismos en cada uno de varios campos. El número de campos a
contar depende del número de microorganismos por campo y del factor del
microscopio. Se transcribe la tabla que se propone para el recuento directo en leche
(Standard Methods for the Examination of Dairy Products APHA) (Anmat, 2014).

Recuento en cámara de Neubauer

Es una cámara que se utiliza para contar glóbulos y está diseñada de manera de contener
una cantidad fija de líquido. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en
25 cuadraditos. Cada uno de ellos está, a su vez, dividido en 16 cuadrados.

Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros

laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de
0.1 mm entre el cubreobjetos y la cámara. Esto determina que el líquido quede
contenido en un volumen de 0.1 mm3 (Rodríguez, 2014).
 

CODEX ALIMENTARIUS

Codex Alimentarius significa "Código de alimentación" y es la compilación de todas

las normas, Códigos de Comportamientos, Directrices y Recomendaciones de la
Comisión del Codex Alimentarius. La Comisión del Codex Alimentarius es el más alto
organismo internacional en materia de normas de alimentación. La Comisión es un
organismo subsidiario de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y
la Alimentación (FAO) y de la Organización Mundial de la Salud (OMS).

El Código se creó para proteger la salud de los consumidores, garantizar

comportamientos correctos en el mercado internacional de los alimentos y coordinar
todos los trabajos internacionales sobre normas alimentarias. El mercado internacional
de la alimentación se estima anualmente en más de 400 billones de dólares. Las normas
de alimentación uniformadas universalmente tienen la ventaja de proteger a los
consumidores de los alimentos no seguros y de permitir a los productores,
manufactureros y comerciantes el acceso a los mercados eliminando obstáculos
artificiales para el comercio que no están basados en las tarifas. Las normas del código
se basan en sólidos presupuestos científicos y están aceptadas como puntos de
referencia en base a las cuales se evalúan medidas y reglamentos nacionales en el
ámbito de los Acuerdos de mercado de la Ronda de Uruguay (FAO, 1999).

Referencias:

Anmat. (Noviembre de 2014). Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y

Tecnología Médica. Obtenido de
http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_aliment
os_Vol_III.pdf
Biomérieux. (2018). bioMérieux. Obtenido de Microbiología Industrial:
https://www.biomerieux.es/microbiologia-industrial/medios-de-cultivo-para-el-
analisis-de-agua
FAO. (1999). FAO - El codex alimentarius. Obtenido de
http://www.fao.org/noticias/1999/codex-s.htm
Martín, R. (2006). Métodos rápidos y automatizados aplicados al análisis
microbiológico de los alimentos. En Microbiología de Alimentos . Madrid:
Universidad Complutense de Madrid.
Rodríguez, E. (16 de Julio de 2014). Academia. Obtenido de Microbiología de
Alimentos y Agua:
https://www.academia.edu/5397941/MICROBIOLOGIA_DE_ALIMENTOS
Sánchez, É. (12 de Marzo de 2017). Recibe. Obtenido de Simulación y conteo de
unidades formadoras de colonias en alimentos y aguas:
https://www.redalyc.org/jatsRepo/5122/512253717006/html/index.html
UNAM. (19 de Enero de 2017). Enumeración de microorganismos. Obtenido de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/P7_EnumeracionMicroorganismos_
19616.pdf