FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

TALLER No 1
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS EMPLEADOS EN MICOLOGIA
CUESTIONARIO

1. ¿Qué ventajas proporciona la implementación de un estricto control de calidad de medios

de cultivos y reactivos en el laboratorio de micología?

Ventajas control de calidad de medios de cultivo

- Mejoramiento de aislamiento del hongo

- Aseguramiento de la preparación correcta del medio, sin sobrecalentamiento,
esterilizados así evitando la contaminación de estos, control de su función y asegurar
el crecimiento del hongo
- Permite la obtención de cultivos mas puros
- Se obtiene un diagnostico confiable y eficaz
- Se observan mejor las estructuras

Ventajas control de calidad de los reactivos

- Permite la comprobación del correcto funcionamiento para la identificación de hongos

- Comprobar si estos están o no contaminados para evitar falsos positivos y falsos
negativos
- Se aumentan los casos negativos cuando el Koh 10% este precipitado

2. ¿Cómo se realiza el control de calidad interno de las diferentes tinciones que se utilizan
para el examen directo de muestras sospechosas para investigación de hongos?

¿Qué debemos garantizar al momento de preparar el cultivo?

Lugar de preparación estéril, seguir indicaciones de la casa comercial, material estéril, y
comprobar la esterilidad del medio tomando el 1% del lote, dejar el medio a temperatura
ambiente y revisar que no presente crecimiento de ningún agente etiológico
 Los reactivos deben cambiarse mínimo una vez al año y siempre que se observe
contaminación o cambios en su aspecto o son funcionalidad
- Examen en fresco con clarificación por Koh: al momento de prepararlo se evalúa su
capacidad al comprobar que puede disolver un poco de muestra de esputo; y en el uso
diario, hay que observar que no tenga contaminación y precipitados
- Se utiliza el esputo como control de calidad en Koh ya que el esputo contiene muchos
componentes proteicos y la función del Koh en digerir el material proteico, debe ser
capaz de diluir el esputo

- Tinción de blanco de calcofluor: el control debe realizarse siempre que se prepare un

nuevo lote y siempre que se realice tinción; se usa cándida albicans en suspensión
acuosa para el control positivo y escherichia coli suspendida en solución salina para el
negativo

- Tinción de cinta China para la observación de la captura policía calidad de

cryptococcus spp: siempre que se realice la atención comprobar la esterilidad del
reactivo y añadir control positivo de cryptococcus albidus suspendido

- Tinción con azul de lactofenol: debe comprobarse la esterilidad del reactivo siempre
que se realice la tinción. No es necesario utilizar controles positivos y negativos, sino
que simplemente de teñirse la estructura de color azul

3. ¿Diga tres condiciones que se deban cumplir para contar con un medio de cultivo de
calidad adecuada?

1) CONTROL DE ESTERILIDAD: temperatura de 120 °C por 15-20 min. Se

toma una muestra de 5ml que se incuba en un tubo adecuado durante 7
días.
Incubación 15-37° C depende del agente etiológico

2) CONTROL DE PH: debe oscilar entre 5 – 6 , se debe hacer cada vez que se
prepara medio
3) CONTROL DE CRECIMIENTO: se realiza cada vez que se prepara el medio.
se preparan dos filas o 24 pocillos de una placa de microdilución con 100
ul en cada pocillo del medio de cultivo. Se prepara inoculos de C.
parapsilosis y C. kruseri y se inoculan 100 ul en una fila y en la otra se
inocula la otra levadura.
4. Las condiciones ambientales requeridas para desarrollar los ensayos relacionados con la
Micología Médica son similares a las de cualquier laboratorio de Microbiología. Sin
embargo, existen ciertas peculiaridades que deben considerarse a la hora de realizar la
manipulación de muestras clínicas y de hongos patógenos. ¿Qué consideraciones de
bioseguridad y de limpieza deben tenerse en cuenta en el laboratorio de micología?

Para hongos NO patógenos se puede realizar en un nivel de seguridad 1 y2 a menos que el

hongo sea patógeno se debe contar con un nivel 3

Todo laboratorio debe tener un nivel 3 de bioseguridad si se realiza la isla miento de

nuestras clínicas e identificación al nivel de especie de cepas provenientes de pacientes
sospechosos de padecer una infección causada por un hongo patógeno nivel 3 de
peligrosidad. Se debe manejar los hongos filamentosos dentro de una cabina de
bioseguridad para evitar contaminaciones cruzadas.

-la limpieza en las zonas de cultivo se realiza con etanol al 70%

-las estufas con Halacid al 1%
-bencilbenzoato al 20% o con formalina sí está permitido

en el laboratorio se debe hacer revisión y mantenimiento periódico del equipo

electromecánico motores centrífugas y agitadores
- tener fuera del laboratorio un área de almacenamiento de reactivos medios de cultivo
se materiales diversos
- manipular los productos químicos con guantes resistentes
- usar pipetas automatizadas
- tener dentro del laboratorio un esterilizador
5. Revise la información acerca de los medios de cultivo, reactivos y coloraciones empleados
en micología y agrúpelos con base en su uso y/o características afines.

MEDIOS DE CULTIVOS PARA HONGOS NO EXIGENTES

1. Agar sabouraud dextrosa: hongos patógenos y saprofitos

2. Gel de agar: micosis profunda

MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS PATÓGENOS

1. Sabouraud modificado: mycosel, dermacel, micobiotic

2. Cicloheximina: actidiona

MEDIOS DE CULTIVO PARA ESPORULACIÓN (FORMAS ASEXUALES)

1. Agar harina de maíz: mohos negros

2. Medio de arroz: dermatofitos
3. Medio de kamiski modificado: dermatomicosis y micosis intermedias
4. Medio de borelli: hongos ambientales (dermafitos, hongo hialinos)
5. Medio de papa y zanahoria: pincimidas
6. Agar ascospras: formas sexuadas de levadura
7. Extracto de levadura agar
8. Extracto de suelos agar (histoplasma)

AGARES DIFERENCIALES
1. Medio modificado de wickerham: especies de candida,
2. Azucares al 1%: diferentes especies de levadura
3. Chrom agar candida
4. Agar leche descremada: actinomicetos
 AGARES SELECTIVOS

1. CHROM agar candida

2. Gelatina liquida: nocardia
3. Komada: fosarum
4. Xantina hipoxantina agar: actinomicetos, nocardia
5. Gelatina al 12%: nocardia
6. Medio de tiamina para dermatofitos
7. Medio con vitaminas: dermatofitos

MEDIOS SELECTIVOS PARA CLAMIDOSPORAS

1. Medio de leche: cándida
2. Agar harina de maíz: twin 80, levaduras
3. Medio para clamidosporas

MEDIOS PARA ACTINOMICETOS

1. Medio de leche desnatada: actinomietos, nocardia

2. Agar sangre: nocardia, actinomices, cryptococcus
3. Urea de christensen: cryptococcus
4. Agar tirosina
5. Agar xantina

MOHO NEGROS

1. Harina de maíz
2. Ceapeck almidón agar : esporulación de mohos negros
3. Gelatina al 12%
DERMATOFITOS

1. DTM agar (dermatophyte test médium)

2. Harina de maiz agar
3. Tiamina
4. Agar trichophyton
5. Agar dextrosa leche
6. Medio de platano
7. Medio de arroz

Reactivos y coloraciones

o Capsula: tinta china, nigrasina, azul de alcian

o Estructura micotica: KOH mas azul de Evans, negro de clorazol E
 o Histoplasma y malassezia: Wright, Giemsa, Dif quick
o Examen directo: KOH 10%, rojo congo, liquido de berlesse visualización de
estructuras micóticas (elementos fúngicos )
o Histoquímica: hematoxilina-eosina, metelamina de plata, azul de toluidina,
fontanamazon, ácido peryodico
o Blastoconideas y psudohifas: hematoxilina-eosina, gram
o Nocardia: Zielh-neelsen, kinyou, gram
o Tinción simple: plata- metenamina de gomori, azul de toluidina, azul de lactofenol
o Tinción diferencial: KOH con azul Evans, ácido peryodico de schiff
o Histopatológica: hematoxilina de eosina, azul de ancial

Todos los hongos son gran positivos en la coloración de Gram

6. ¿Cuál es el pH óptimo de los medios de cultivo para hongos? ¿Qué efecto adicional
positivo tiene este pH en el aislamiento de los hongos?

El pH debe oscilar entre 5 y 6 el efecto adicional positivo se da a la adicional sustancia

inhibidoras del recibimiento bacteriano o acidificación ligeramente del pH con ácido
clorhídrico permitiendo la inhibición del crecimiento bacteriano. en levaduras y hongos se
requiere una temperatura de 37º centígrados

7. ¿Diga en el diagnóstico de qué tipo de infecciones micóticas son útiles los medios
cromogénicos?

Son medios selectivos diferenciales usados para el aislamiento de levaduras

fundamentalmente del género cándida, es posible utilizarla como medio primario a partir
de diferentes muestras clínicas con una buena recuperación lo que facilita y agiliza la
detención de infecciones.
Los medios cromogénicos identifican presuntivamente a las levaduras más que todo a las
cándidas (como cándidas albicans, c. krusei, c. tropicalis, c. kefyr, c. lusitaniae, c. glabrata
y c. parapsilosis), la morfología y el color característico dependerá de la marca comercial.
Las cepas no identificables presentan un color variable entre rosado, violeta, blanco,
marrón y crema. también se le pueden añadir fluconazol u otro antibiótico para la
detección de algunas cepas resistentes y además también nos ayuda en la detección de
otros hongos como lo son c. neoformans, trichosporon spp., rhodotorula spp. ya que estos
pueden crecer en el medio, pero deben ser subcultivos en medio no selectivos para una
identificación definitiva
 8. ¿En el diagnóstico de las micosis, diga cuál es el aporte de los hemocultivos automatizados
por el método de lisis centrifugación?

(micosis invasoras)Fungemias: el método de elección es el de lisis-centrifugación

que recupera levaduras y hongos dismórficos. Consiste en un tubo de lisis
cuyo contenido es:

o polianetol sulfonato de sodio como anticoagulante

o saponina como agente lítico de eritrocitos, leucocitos y macrófagos
o Polipropilenglicol como antiespumante
o Un fluoroquímico inerte de alta densidad.

Luego se somete a la muestra a una centrifugación a alta velocidad que

permite la concentración de microorganismos en el sedimento que se siembra
en medios de cultivo específicos. En general, este método permite mejorar en
un 25 a 50% la detección de hongos levaduriformes y filamentosos

9. Cómo haría el control de calidad del medio Agar Sabouraud dextros-SDA

Control de calidad: medio de cultivo de color ámbar, transparente, sólido y sin

precipitado.
con un pH de 5-6.
para el control de crecimiento e inhibición se utilizan los siguientes microorganismos:

MICROORGANISMOS RESULTADO ESPERADO

Saccharomyces cerevisiae Crecimiento
Candida albicans WDCM 00054 Crecimiento
Aspergillus brasiliensis WDCM 00053 Crecimiento
Trichophyton mentagrophytes WDCM 00191 Crecimiento
Staphylococcus aureus WDCM 00034 Inhibición parcial o total con adición de
antimicrobianos
Scherichia coli WDCM 00013 Inhibición parcial o total con adición de
antimicrobianos

10. ¿Por qué el medio SDA (saburod dextroxa ) modificado debe utilizarse simultáneamente
con otros medios?

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento y diferenciación de hongos patógenos

como los dermatofitos, hongos dimorficos y hongos resistentes a la cicloheximida a partir
de muestra contaminada con bacterias y hongos saprófitos de rápido crecimiento. Este
 medio inhibe el crecimiento de algunos hongos de importancia clínica razón por la que es
importante integrarlo en el aislamiento primario con otros medios sin sustancias electivas.

11. Al momento de realizar un cultivo, ¿cómo aprovecharía las diferencias existentes en la

composición del Sabouraud simple y el Sabouraud modificado?

Aprovecharía las diferencias de estos, dependiendo el tipo de hongo que quiero aislar al
realizar el cultivo, ya que el Agar Sabouraud simple es más eficiente a la hora de aislar
hongos oportunistas y ambientales, mientras tanto el Agar Sabouraud modificado es
mejor para realizar el aislamiento de hongos patógenos.

12. Mencione la utilidad de los componentes de la tinción de azul algodón de lactofenol

¿Cuánto tiempo se puede conservar?

Los bordes de la laminilla le adicionamos esmalte y así la laminilla dura años

- El fenol elimina la flora acompañante

- El ácido láctico es un agente aclarante que preserva la estructura del hongo
- la glicerina previene la desecación y favorece la humedad
-El azul de algodón colorea la quitina y celulosa del hongo.
- El fenol tiene la capacidad de inactivar la flora acompañante las enzimas además no
permiten estallar la célula

13. Al procesar el examen directo y cultivo para estudio micológico de una muestra clínica,
qué diferenciación haría usted en el uso del KOH al 10% y el azul de lactofenol?

KOH al 10% es el método más utilizado en las diferentes muestras clínicas y éste disuelve
la queratina y digiere parcialmente los componentes proteicos, facilitando así la
 visualización de los elementos fúngicos. Permite observar los elementos fúngicos
presentes en tejidos queratinizados y los esclerotes ubicado entre los tejidos

Nota: esta capacidad digestiva se puede mejorar cuando se somete a calentamiento

suave.

El azul de lactofenol es otra tinción especial que se realiza a partir de cultivos, en el cual
el fenol destruye la flora acompañante, el ácido láctico conserva las estructuras fúngicas y
el azul algodón tiñe la quitina de la pared del hongo para ayudar en su identificación. Se
utiliza para preparar plagas de cultivo y clasificación taxonómica

14. Revise el fundamento de las siguientes coloraciones: Ácido peryodico de Schiff (PAS),
calcofluor blanco, plata- metenamina de Gomori (GROCOTT)

Ácido peryodico de schiff: en esta coloración las paredes celulares de los hongos se oxidan
en presencia del ácido peryodico y se forman aldehídos que luego reaccionan con la
fuscina de schiff y colorean los carbohidratos de la pared celular de color magenta o
rosado brillante.
este método es bastante utilizado ya que la mayoría de los hongos de muestras clínicas
toman la tinción, sin embargo, el procedimiento es bastante complicado y requieren
diferentes reactivos y etapas lo cual consume bastante tiempo.

Blanco Calcofluor blanco: Es un fluorocromo que se ve como un polisacárido con enlaces

Beta 1-3 y Beta 1-4 presente en polímeros tales como la celulosa y la gelatina el colorante
fluorescente cuando se une a una fuente ultravioleta de longitud de alta sensibilidad para
definir claramente los elementos micóticos en muestras clínicas requiere un microscopio
de fluorescencia fijan el colorante blanco
A que componentes de la pared celular se une el calcofluor para fluorecer
Se une a los polisacáridos que están presentes en la celulosa y en la quitina

Plata-metenamina de Gomori (GROCOTT): Esta se basa en que, en presencia de ácido

crómico los grupos hidroxilo de los polisacáridos de la pared celular de los hongos son
oxidados a aldehídos; estos, a su vez reducen el complejo nitrato-plata metenamina
produciendo la coloración café a negro con un fondo de color verde azuloso, debido al
depósito de la plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos. Ofrece
información sobre el grado del daño del tejido

 ¿Qué tienen en común y en que difieren?

 Se oxidan los mucopolisacáridos que se encuentran en las paredes de los hongos
en caso de shift se oxidan en presencia de ácido periódico y en el caso de
GROCOTT se oxidan en presencia de ácido crómico estos se oxidan a aldehídos
  la coloración de los aldehídos en grocott se reduce el complejo plata-metanamina
y se ve de color café o rojo y en caso de schiff fijan la fucsina se produce un color
rojo

15. Diga el fundamento y uso del medio CHROMagar Cándida

Fundamento: El CHROMagar Cándida es un medio de cultivo selectivo y diferencial para el

aislamiento diferenciación de levaduras patógenas y saprofitas en muestras de origen
clínico.
La peptona es La fuente de nitrógeno en el medio, la glucosa es la fuente de energía.
La diferenciación entre las especies del género Cándida se logra a través de los sustratos
cromogénicos contenidos en el medio de cultivo, sobre los que actuarán las enzimas
hexosaminidasa, glucosidasa y fosfatasa alcalina. Estas reacciones enzimáticas provocan la
generación de pigmentos coloreados que permiten la identificación presuntiva de estas
levaduras. El cloranfenicol inhibe la mayoría de los contaminantes bacterianos.

Usos: Diferenciar de forma rápida y confiable las especies más comunes de cándida. Con la
inclusión de sustratos cromógenos en el medio, las colonias de C. albicans, C. tropicalis y C.
krusei producen colores diferentes, lo que permite la detección directa de estas especies
de levaduras en la placa de aislamiento.
- Las colonias de C. albicans presentan un color de verde claro a mediano,
- las colonias de C. tropicalis, de azul verdoso a azul metálico
- las colonias de C. krusei, rosado claro con borde blancuzco.
Es posible que otras especies de levaduras producen su color natural (crema) o presenten
un color rosado o malva declaro a oscuro (por ejemplo, Cándida [Torulopsis] glabrata y
otras especies).

16. ¿Cuál es la función del tween80 en los medios de cultivo para hongos?

En los medios de cultivos para hongos el Tween 80 (o polisorbato 80) es agregado

estimular la formación de Clamidoconidias, esto gracias a la presencia de ácidos oleicos.
Contribuye a la esporulación de los hongos de clamidoconidias
17. Cuál es la sensibilidad del KOH al 10% para la identificación de hongos en los exámenes
directos?

La sensibilidad del KOH al 10% es bastante variable dependiendo del hongo que se esté
diagnosticando. Puede tener alta sensibilidad, como en el diagnóstico de Onicomicosis,
 cuya sensibilidad es de un 61%,o en el diagnóstico de Pitiriasis Versicolor, que la
sensibilidad es de 78%. Mientras que es muy baja en diagnóstico de la Histoplasmosis y la
Neumocistocis

Histoplasma