EPD-TEMA-3-Identificacion-de-pro...

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Análisis Biómico

3º Grado en Biotecnología

Facultad de Ciencias Experimentales

Universidad Pablo de Olavide

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 TEMA 3 EPD: IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS (espectometría de masas)
1. FLUJO DE TRABAJO EN PROTEÓMICA

En el TEMA 2 vimos las dos primeras partes que siempre hay en flujo de trabajo de proteómica. Ahora
vamos a ver la identificación de proteínas, que es mediante espectrometría de masas.

Esto es para saber qué proteínas tenemos en nuestra muestra. Buscamos averiguar el nombre de las
proteínas de la muestra (identificar), que no es lo mismo que secuenciar. Para identificar las proteínas se
usa una base de datos.

2. IDENTIFICAR UNA PROTEÍNA

La enzima más utilizada es la Tripsina:

- Acepta un amplio rango de pH y tª para el corte
- Rotura muy específica y consistente
- El número de veces que suele cortar proporciona un patrón de péptidos útiles para el análisis
- La enzima es muy barata
- Corta en los extremos carboxi de Lisinas y Argininas

La tripsina es la proteasa que más se usa. Cuando cortas con ella una proteína obtienes un patrón
determinado de masas. Corta siempre extremos carboxi de lisisnas y argininas, una proteína que no tenga
lisinas y argininas no será cortada (pero es casi imposible que una proteína no tenga ni una). Esta es barata
y se equivoca poco.

Los péptidos trípticos se analizan mediante espectrometría de masas (relacion carga-masa, cuando
he hablado de carga y masa anteriormente):

Hay que saber cómo se analizan esas masas obtenidas en la digestión por espectrometría de masas. En la
asignatura TAI se va a ver mucho. Aquí nos interesa saber que una fuente de iones hace que la muestra se
ionice y pueda entrar en el espectrómetro de masas en sí (el analizador, separador). Es importante ionizar

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 porque tienes un montón de péptidos, para que entren en el analizador los ionizo y dentro del analizador se
van a separar en función de su carga y masa. una vez separados se han ordenado, entran dentro del detector
y este nos da la relación de cargas y masa de esos péptidos iones que hemos metido. entonces se separa
por carga y masa unos iones y se detecta en el detector.

3. IDENTIFICAR UNA PROTEÍNA. ANALIZADORES

De una proteína entera la digiero y obtengo el patrón de masas. Ese pull de péptidos lo hemos metido en el
espectrómetro de masas, se ordenan en función de su relación carga-masa cual electroforesis y obtenemos
en una pantalla del ordenador unos picos que dicen que ahí ha incidido una masa y en el eje x se ve el dato
de su relación carga-masa. Al final en una huella peptídica tengo unos números que referencian la relación
carga-masa. Estos nº se meten en el algoritmo matemático y nos devuelve el resultado de qué proteína con
mayor probabilidad es la que se estaba analizando con esa huella peptídica.

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 SE SUELE APLICAR EL ALGORITMO DE MASCOT.

Meto el conjunto de masas que he obtenido y le dices a que base de datos quieres que se refiera. Lanza el
pull digerido de contenido contra el algoritmo (he metido en qué organismo estoy trabajando y tal), y nos
devuelve posibilidades de proteínas que puedan ser con ese conjunto de ansas que he metido.

Tenemos que ir al de probabilidad más alta y también mirar la estadística, cómo de fiable es eso que nos ha
dado. En este ejemplo de una proteína solo obtenemos valores, un proteín score, que en este caso nos dice
que todo lo que tenga un score por encima de 50 (EN ESTA BUSCQUEDA) será significativo con un pi valor
de 0,05. Tenemos también un histograma con las que podrían ser: en verde tenemos la zona no significativa,
y solo tenemos una que supera el umbral de significancia. El score es especifico de esa búsqueda y depende
de muchos parámetros.

Lo que hemos metido es el fichero que hemos obtenido de la espectrometría de masas. Esta búsqueda es
con un pull de masas de haber digerido una proteína

La digestión en este caso es de una proteína, luego vamos a pasar a la espectrometría de masas a gran
escala.

Habiendo digerido solo una proteína, al desplegar la lista, con cada proteína identificada nos dice qué masas
hemos obtenido en esa espectrometría de masas, y te da las masas de esos trozos si de verdad fuese esa
proteína. Te da la lista de posibles péptidos que su masa teórica coincide con la que hemos obtenido. Te
dice la masa que has puesto y la que el algoritmo piensa que es. Hay una parte del pull con el que no se
encuentran coincidencias, sobran. En la diapositiva de antes vimos que aparte de los picos altos había unos
pequeños, esto es porque el cronograma tiene ruido, es imposible no tener señales más pequeñas que
puedan estar interfiriendo. Entonces el algoritmo coge todo, te dice cuando obtiene mayor nº de matchs, une
las masas observadas con las esperadas comparando con todas las de la base de datos, y hay algunas que
no encuentra nada porque es ruidos.

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 La tripsina se detectaría, pero nosotros decimos al algoritmo que hemos digerido don tripsina, entonces tiene
en cuenta todo esto

En una práctica nos va a dar hojas de haber identificado proteínas y tendremos que decir que proteína nos
ha dado, si nos lo creemos y tal.

Abajo te da la secuencia del péptido que probablemente esté asociado a esa parte de masa que hemos
metido en el pull.

Se dio el salto a poder identificar proteomas, muchas proteínas, esto fue con un paso más alla. En vez de
quedarnos solo con la probabilidad de que una masa sea un trozo de un péptido y ya está y quedarnos con
probabilidades, se pasó a confirmar que realmente la masa que yo creo que es realmente es (con
espectrofotometría de masas).

Del results List dices que se quede solo con una masa en concreto, y ahora estudiamos solo ese
péptido, ese trozo (a continuación).

FRAGMENTACIÓN PEPTÍDICA

Si la proteína me dice que un péptido es ese, hago otra espectrometría de masas solo con esa parte, se
rompe en todos sus aminoácidos aa y vamos a obtener de nuevo un diagrama de masas donde cada masa
va a corresponder a posibles fragmentos de haber rompido al azar el péptido (fragmentos de largura aleatoria
de esa secuencia de aa). Eso lo separo en una carrera de espectrometría de masas y obtengo ordenados
esos fragmentos. en este caso la diferencia entre trozos es el aa que falta. Se intenta aplicar la energía para
que solo se corte una vez en todo el péptido, luego ordenamos por tamaño y la diferencia entre un aa y el
siguiente y es la diferencia entre los trozos. Así, el algoritmo construye y valida que realmente la secuencia
sospechosa es de verdad la secuencia del péptido.

Se filtra por tamaño, un solo aa es muy pequeño y masas de un solo aa no las vamos a ver, entonces como
cortas con poca energía y la ventana de tamaño solo te permite ver péptidos que tengan mínimo 2,3 aa. de
hecho cuando haces esa fragmentación no logras identificar todos los fragmentos obtenidos, sino que tienes
que aplicar algoritmos de nuevo para ver si es significativo o no.

Es una fragmentación al azar de un péptido para confirmar la identificación de la proteína.

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 MS/MS significa doble ronda de espectometría de masas.

Importante, se ordenan las masas del péptido fragmentado, la tabla muestra las posibles masas que
podríamos haber visto, en negro las que no hemos visto y en rojo las que sí hemos obtenido de haber
fragmentado ese péptido. entonces obtenemos si hay suficientes masas para saber que es inequívocamente
ese péptido o no.

En negro tenemos todas las posibles masas que podrian haber salido de haber fragmentado lo rojo. Lo negro
son las posibles masas que se podían haber obtenido si esa secuencia azul vertical se hubiera digerido.

PEPTIDE MASS FINGERPRINTING

Es el flujo de trabajo de la EPD 2. obtener un gel 2D para separar la muestra previamente, cortamos una de
las proteínas que nos interese, digerimos con trispina, obtenemos el pull de péptidos, si queremos solo masa
vemos la base de datos, si queremos confirmar que es lo que ha salido se digiere un fragmento y se hace
la ms/ms para confirmar que uno de los péptidos obtenidos era realmente ese

Esto es solo para una. Pero se puede meter miles de proteínas con sus millones de péptidos, la maquina
los separa ordena y analiza, aplica algoritmos de identificación, filtra por su puntuación y da el listado de las
miles de proteínas, sus datos, sus probabilidades, de cada proteína.

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 Con tener un solo péptido nos podemos asegurar de que la proteína es la que se ha supuesto. En realidad,
se puede incluso con una seria de aa. Se hace con un péptido muy exclusivo de esa proteína.
Cuando el algoritmo empieza a procesar sabe si es una masa única (marca como péptido exclusivo de esa
proteína) o no. Luego digieres los exclusivos. puedes indicar a la máquina que digiera automáticamente los
más abundantes o puedes decir qué masa quieres realmente estudiar.

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