Wuolah Free Tema 5. Acoplamientos de Tecnicas Cromatograficas A Espectrometria de Masas

TEMA-5.-ACOPLAMIENTOS-DE-TECNICA...
Luuuxx_494597
Química Analítica III
3º Grado en Química
Facultad de Ciencias Químicas

Universidad Complutense de Madrid
Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
TEMA 5. ACOPLAMIENTOS DE TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS A ESPECTROMETRÍA DE MASAS
¿POR QUÉ ACOPLAR LA CROMATOGRAFÍA A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS?
En la combinación de la cromatografía como técnica de separación con las masas se va a poder explotar al
extremo el mejor sistema de detección que existe hoy en día que es la espectrometría de masas.
Si hay algún que buscarle algún pero a la espectrometría de masas sería que llega un momento en el que la
separación se hace imposible como en proteómica, metabolómica… donde el espectro de masas sería muy
complejo. Por mucho que se pueda separar con una buena resolución de m/z, no se llega a obtener una
separación clara. Por eso se acopla a un sistema de separación de gases o líquidos en función de si son o no
volátiles.
Una vez que tenemos las sustancias puras separadas por la cromatografía, se introducen en la
espectrometría de masas donde se caracteriza el compuesto de una forma inequívoca y con alta sensibilidad.
La espectrometría de masas es una técnica universal que sirve para todo y por ello es probablemente la
técnica con más interés hoy en día. Es muy cara, compleja y sofisticada, por lo que no se usa siempre si no se
tiene necesidad de tener tanta sensibilidad. Es decir, a veces no es necesaria tanta calidad en las medidas.
Cualquier desarrollo analítico sencillo que se haga, tiene que estar luego validado con una técnica de
confirmación por ejemplo la cromatografía acoplada a masas se emplea en legislación para el control de la
calidad alimentaria.
En la cromatografía de líquidos incidiremos en las dificultades de acoplar una técnica que se basa en un
líquido para convertirla en un sistema gaseoso con no demasiada presión con un sistema que no está en
vacío para adaptarlo al EM. Pasamos de líquido a temperatura ambiente y presión alta a vacío a altas
temperaturas en un medio gaseoso para la EM. Estas interfases son importantes.
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La espectrometría de masas permite separar iones en función de su relación masa/carga. Tendremos nuestra
muestra (nos olvidamos de su concentración y de su peso molecular) con los analitos que han sido ionizados
para poder separarlos en función de su relación m/z.
Una vez separados se pueden detectar cualitativamente viendo su relación m/z, y estudiando los fragmentos
producidos en el proceso de ionización, y cuantitativamente estudiando la abundancia pues se puede ir
acumulando información durante un tiempo.
Si ponemos un tope, cuanto antes lleguemos a un número de cuentas hechas que se consideren adecuadas
para la relación señal/ruido, podremos alcanzar un nivel, que se correlaciona con la concentración de la
sustancia que se está analizando.
Proporciona información acerca de:
- Estructura de las moléculas orgánicas, inorgánicas y biológicas.

- Composición elemental de las muestras.
- Estructura y composición de superficies sólidas.
- Relaciones isotópicas de los átomos.
- Composición cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas
Sirve para moléculas orgánicas, inorgánicas y biológicas. Proporciona información estructural sobre las
mismas y además permite conocer los isótopos que hay en las muestras y relacionarlos.
Esto es útil para el uso de patrones internos porque los patrones internos deben ser lo más parecidos posibles
a los analitos. Lo que se hace es utilizar como patrón interno la misma molécula estructuralmente a la que
queremos determinar pero que se diferencia por ejemplo en el isótopo de carbono.
a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-8811796
Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Funcionamiento.
Tenemos al principio del espectrómetro de masas una entrada de muestra que si es acoplado a un
cromatógrafo sería la salida de muestra de la columna. La muestra llega a una cámara donde se generan los
iones gaseosos.
Los iones gaseosos se pueden generar de muchas formas, la más común es emplear un flujo de electrones
que choquen con la muestra. Esto suele arrancar un electrón de la molécula de forma que queda el ion
molecular (generalmente un catión) al cual le falta un electrón por el choque con un electrón que arranca
otro generando 2 electrones y el ion molecular.
Además, la energía del haz de electrones es muy alta por lo que se pueden producir fragmentaciones que
van a permitir conocer su estructura inicial.
En definitiva vamos a tener iones cargados que están ionizados. Estos iones moleculares viajan y primero se
enfocan con unas placas o electrodos que los aceleran hacia el interior del imán y enfocarlos hacia el
analizador.
Este imán es una trampa iónica o triple cuadrupolo que permite separar los iones en función de la relación
m/z. En la imagen lo que ocurre es que en función de la relación m/z cambia la trayectoria; los iones más
ligeros tendrán una trayectoria más desplazada y los más pesados tienen una curvatura menor.
EJEMPLO. Es un espectro de masas de una molécula: 2 – fenoxietanol.

Tenemos un ion molecular en verde, en naranja el ion mayoritario que
es el de la ruptura por el grupo de oxígeno y en azul distintos iones
fragmentos que han surgido por otras fracturas.
si lees esto me debes un besito

Química Analítica III
Banco de apuntes de la
Porqué acoplar la cromatografía y la espectrometría de masas.
Se pensó que el hecho de poder introducir en la espectrometría de masas los compuestos separados de una
forma más pura en una cromatografía, permitiría generar respuestas con mejores prestaciones de lo que
sería la espectrometría de masas.
Aunque la espectrometría de masas es una técnica de uso cotidiano y una poderosa herramienta para la
identificación de compuestos puros, es insuficiente para el análisis de mezclas, ya que la interpretación de
los espectros de masas obtenidos sería muy complejo o incluso imposible debido al elevado número de iones
formados.
Es por esto que se han desarrollado métodos en los que el espectrómetro de masas se acopla a un sistema
de separación eficaz, dando lugar a los denominados métodos acoplados.
ACOPLAMIENTOS MÁS COMUNES A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS
TIPOS DE ACOPLAMIENTOS MÁS COMUNES A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS.
Hay 3 tipos de técnicas acopladas; nosotros veremos las 3 primeras:
• Cromatografía de gases – espectrometría de masas. GC – MS

• Cromatografía de líquidos – espectrometría de masas. LC – MS
• Espectrometría de masas en tándem. MS -MS
CARACTERÍSTICAS DE LAS TÉCNICAS ACOPLADAS.
o La unión de 2 o más técnicas analítica permite obtener una herramienta analítica más eficiente y rápida
porque el proceso que deberíamos tener previo para purificar las muestras, ahora lo eliminamos porque
lo purifica el cromatógrafo.
o La multidimensionalidad de los datos proporciona más información. También dan multidimensionalidad
de datos otros detectores como un detector de absorbancia. Es interesante porque la información que
se obtiene es enriquecedora.
o Surge la necesidad de utilizar interfases.
El acoplamiento de las técnicas cromatográficas a espectrometría de masas nos va a proporcionar

información multidimensional (2-D). Se obtiene un cromatograma característico de la muestra y para cada
pico cromatográfico se obtiene un espectro de masas que permitirá identificar el compuesto de que se trata.
La bidimensionalidad permite por un lado obtener los tiempos de

retención de los compuestos y por otro lado se obtiene el espectro
de masas de los compuestos. Esto nos permite evaluar también la
pureza de los compuestos, si nos salen más picos de los que
deberíamos ver, igual es porque no están puros.
La gente que trabaja con cromatografía acoplada a masas no se

preocupa mucho de que los picos estén separados porque como el
espectrómetro de masas sí es capaz de discernir entre picos que se
coeluyen a la vez, esto no es un problema, porque si está acoplado
a masas se puede ver lo que hay ahí.
Esto se puede hacer desde el punto de vista cualitativo, pero desde el punto de vista cuantitativo es más
complicado, se puede coeluir pero es mejor optimizarlo si se quiere cuantificar.
Puesto que el MS trabaja a alto vacío es necesaria una interfase que permita acoplar la técnica de separación
y la de detección.

REQUISITOS QUE DEBEN CUMPLIR LAS TÉCNICAS PARA ACOPLARSE.
Depende de si es un cromatógrafo de gases o de líquidos, la fase móvil es gaseosa en cromatografía de gases

y líquida en cromatografía de líquidos. La espectrometría de masas trabaja con gases por lo que acoplarla a
la cromatografía de gases no es un problema. En líquidos es más complicado porque no se obtienen gases.
En general lo que tiene que haber es:
➢ Compatibilidad. Nos la dan las interfaces que se pongan entre medias.
➢ Independencia entre los métodos porque pueden surgir situaciones en las que no tiene sentido
acoplarlos.
➢ Ortogonalidad (los métodos acoplados deben basar sus respectivas separaciones en mecanismos de
separación tan distintos como sea posible).
Hay que aprovechar lo que se va a acoplar, porque si existen mecanismos que sean colaborativos o
sinérgicos bien, pero si son antagónicos lo bueno que tiene uno lo tiene de malo el otro y esto provoca que
sea mejor que las variables sean independientes para que si se optimiza algo en masas no afecte a lo
cromatográfico.
➢ Complementariedad para obtener una mejor información analítica y permitir una adquisición de datos
que simplifique su interpretación.
Está relacionado con el anterior, que una técnica nos de información de una cosa; por ejemplo la
cromatografía aporta información sobre la polaridad… y la otra técnica otra información; por ejemplo la
espectrometría de masas aporta información sobre la estructura, tamaño…
En gases y líquidos, no se debe trabajar en condiciones que permitan una ruptura de vacío en masas. Por
ejemplo, no puede haber demasiado líquido para entrar en masas, hay que trabajar a flujos más bajos,
columnas más pequeñas que tengan buena resolución pero requieran menos disolvente.
Requisitos para acoplar cromatografía de gases a espectrometría de masas.
Las posibilidades de acoplamiento van a depender del tipo de columna empleada ya que condiciona el flujo
de gas portador.
- Si se utilizan columnas con diámetros superiores a 0.3 mm hay que recurrir a interfases como divisor
de flujo.
- Si se utilizan columnas capilares se pueden introducir muestras debidamente termostatizadas hasta
la cámara de ionización y un sistema de bombeo del espectrómetro elimina el gas portador.
Se utiliza para moléculas pequeñas volátiles y térmicamente estables.
Requisitos para acoplar cromatografía de líquidos a espectrometría de masas.
La cromatografía de líquidos trabaja a alta presión, temperatura ambiente y con caudal de fase móvil
relativamente alto, mientras que MS opera a alto vacío y temperatura elevada por lo que el acoplamiento se
hace más complicado.
Se ha resuelto con interfases que consiguen una ionización suave de la muestra sin eliminar por completo la
fase móvil.
- Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI)

- Ionización por nebulización térmica (Thermospray ionization, TSP)
- Ionización por electroespray (Electrospray ionization, ESI)
Se suele ofrecer una ionización a presión atmosférica o con electrospray que es la más barata pero la que
menos elucidación estructural y sensibilidad aporta.

TEMA 5A. CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS
<<<<
CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La técnica acoplada de cromatografía de gases y líquidos se empieza a desarrollar en 1952 y los primeros
equipos se comercializan en 1960. Se utiliza para la separación de compuestos orgánicos volátiles y
térmicamente estables. Para analizar compuestos no volátiles es necesaria la derivatización previa.
Permite el análisis de muestras complejas; si tenemos una muestra extremadamente compleja como puede
ser un engrudo de petróleo, el poder separar los compuestos que lo componen permite detectarlo por
espectrometría de masas.
Para la cuantificación se emplea patrón interno. Para mejorar la exactitud se utilizan compuestos marcados
isotópicamente como patrones internos, pero no para todas las muestras existe su compuesto marcado
isotópicamente.
Permite detectar coeluciones cromatográficas e identificar picos sin resolver.
Es una técnica combinada ampliamente implantada en los laboratorios de análisis. El detector suma todas
las masas que llegan por lo que los espectros de masas son aditivos; se acumulan mucho iones que llegan al
detector y que son siempre los mismos. El espectro va aumentando en cuanto a intensidad; es como un
efecto memoria. En general, tener una técnica aditiva va a permitir tener muchísima sensibilidad.
El cromatógrafo de gases separa los compuestos de una muestra y suministra compuestos puros que se
pueden identificar y confirmar mediante espectrometría de masas. Las columnas capilares de GC se pueden
conectar directamente con el espectrómetro de masas ya que sus caudales son compatibles con la capacidad
de las bombas para producir el vacío requerido por el analizador del espectrómetro de masas.
Los picos cromatográficos se eluyen del GC secuencialmente y entran en el MS, que actúa como detector
para el cromatógrafo de gases.
Las 2 formas de convertir nuestro analito (M) en un ion son el impacto electrónico y la ionización química.
Mediante impacto electrónico se forman más fragmentos que en ionización química que es más suave.
En la diapositiva vemos un resumen de cómo sería una detección de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas. Primero separamos los compuestos con el método cromatográfico en unas
condiciones que consideremos afectados. Una vez que se han separado, entran los compuestos en el
espectrómetro de masas.
Los compuestos se ionizan mediante ionización

electrónica, la molécula va chocando con un flujo de
electrones a 90º de forma que se forma el ion molecular
y se pierde un electrón. Además, la molécula puede
fragmentarse también por ese impacto con los electrones
dando lugar a otros cationes y a otros fragmentos que no
se van a detectar porque no estén cargados.
Los fragmentos neutros no se van a analizar porque para

pasar al analizador y el detector de m/z tienen que estar
cargados porque el transporte se hace por diferencias de
potenciales y campos magnéticos.
Una vez que se han detectado los cationes que se generan, se identifican los picos cromatográficos realizando
la comparación con librerías comerciales que se han obtenido en esas mismas condiciones de potencial
estándar de ionización. Esto nos permite conocer con qué compuestos estamos trabajando.
La principal dificultad de acoplar GC a MS es introducir un compuesto a presión atmosférica (que es lo que
tenemos a la salida de la columna) en el sistema de alto vacío al que opera el MS.
Lo habitual es utilizar columnas capilares con caudales muy bajos (sub-mL/min) que prácticamente eliminan
la necesidad de una interfase especial.
A la salida de la fuente de ionización tenemos el imán que permite la separación en función de la relación
masa / carga y luego llega al detector para obtener el espectro.
SISTEMAS DE ACOPLAMIENTO
Sistema de acoplamiento original GC – MS. Se trata de un sistema basado en una cabina o cámara de
ionización donde se aplica una diferencia de potencial para que se ionicen las moléculas. Se emplean
columnas empaquetadas.
Sistema de acoplamiento moderno GC – MS. Hoy en día se utiliza una columna capilar, un equipo normal
como el de prácticas que tiene una interfaz con la cámara de ionización, el analizador es un cuadrupolo que
permite separar los iones en función de m/z. No tiene mucha resolución de m/z, suele ser de una unidad de
resolución, pero por sus características y su precio se utiliza mucho.
CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A MS
(1) INTERFASES.
• Acoplamiento directo (columnas capilares)
Las columnas deben ser lo más estrechas posible para permitir un caudal de trabajo pequeño. las columnas
que se suelen utilizar tienen una longitud de 25 m y un diámetro interno de 50 𝜇m. Los caudales son muy
bajos (1−2 mL/min) que son compatibles con los sistemas de vacío con los que trabaja el espectrómetro de
masas.
La columna debe ser de bajo sangrado. El detector de masas trabaja a altas temperaturas, además, las
columnas de gases nos indican el rango de temperaturas ideal para trabajar en ellas porque sino puede ser
que la fase estacionaria adsorbida se elimine (se vaya). Por eso la columna debe tener una elevada resistencia
a las temperaturas. La interfase se mantiene a una temperatura por encima de la de trabajo del horno en el
proceso cromatográfico.
Cuando se acopla la cromatografía de gases a masas con otra detección como FID o NPD, se observan tiempos
de retención más elevados que cuando se acopla a masas porque los detectores normales trabajan a presión
atmosférica y aquí hay presión y temperatura elevada. Esto es una ventaja siempre y cuando no afecte a la
resolución.
Con respecto a la resolución se afecta ligeramente ya que la columna se introduce parcialmente dentro del
sistema de vacío. Todo lo que sea introducir algo más entre la columna y el detector siempre va a provocar
un ensanchamiento de los picos.

En la imagen vemos un esquema muy simplificado de cómo se puede acoplar la columna capilar de
cromatografía a la fuente de ionización del espectrómetro de masas. El flujo de electrones impacta sobre la
muestra y se transmite al analizador.
Necesariamente hay que cambiar el gas (helio o nitrógeno) porque no queremos la fase móvil, en el
analizador solo queremos nuestros propios iones, no queremos nada más que afecte.
Los gases que son la fase móvil se eliminan. Existen diferentes posibilidades para eliminarlos, una de ella es
poner una fuerza de gas inverso en sentido contrario siendo capaces de desplazar el helio o el nitrógeno que
pesan poco sin arrastrar los gases de nuestros analitos que pesan más.
Tenemos tambien un sistema de vacío que tiene que ser muy eficaz. Las bombas de vacío tienen que ser muy
eficaces para que en poco tiempo hagan un vacío (caída de presión) de forma adecuada.
• Interfase de división de flujo: open Split
Se utiliza cuando se requiere un mayor caudal del gas portador (sensibilidad).
En este caso parte de lo que sale de la columna cromatográfica se elimina para solo meter un poco. Hay que
tener cuidado con esto porque si no se mete suficiente cantidad de lo que sale de la columna se puede perder
sensibilidad.
Entre el cromatógrafo de gases y el espectrómetro de masas se introduce un dispositivo de conexión

intermedia capaz de acoplar la presión del GC (> atm) con la del MS (alto vacío). Se elimina la mayor parte
del gas portador y se evita una mezcla de los componentes separados en el CG. Se evitan pérdidas de
muestras por descomposición o condensación.
Reduce el caudal de gas que penetra en el espectrómetro para asegurar el nivel de vacío (se necesita sistema
de vacío de alta eficiencia

(2) SISTEMAS DE IONIZACIÓN
• Impacto electrónico (EI)
Es el más utilizado, entre otras cosas porque el espectro de masas se puede comparar con otro cromatógrafo
en otro laboratorio que tenga el mismo sistema.
Tenemos una cavidad por donde entra la muestra. A 90º de la entrada de

muestra hay una fuente de generación de electrones que son unos electrodos:
el cátodo está hecho de wolframio (positivo) y el ánodo está hecho de otro
material (negativo).
Entre ambos electrodos se genera una diferencia de potencial de 70 eV que es

un potencial optimizado porque permite un proceso de ionización estable
(siempre se forma lo mismo de lo mismo) y con poca fluctuación. Estas 2
características hacen que la abundancia de los compuestos no influya en la
forma del espectro y permiten una buena precisión.
Los 70 eV dan lugar a un flujo de electrones en perpendicular a la muestra. La

muestra atraviesa la corriente de electrones que se generan entre el cátodo y
el ánodo de forma que los impactos con ellos forman el ion molecular.
Los electrones con los que impactan las moléculas tienen una energía de 70 eV. El electrón una vez que ha
impactado tiene 55 eV y el electrón que pierde la molécula tiene 0,1 eV.
Por ejemplo, la molécula de formaldehído tiene una energía de ionización para perder un electrón tipo sigma
enlazante es de 15.9 eV, la energía de ionización para perder un electrón no enlazante es de 11 eV y la energía
de ionización para perder un electrón tipo pi es 14,1 eV.
Por tanto, con los 70 eV que llevan los electrones de la corriente, hay energía suficiente para arrancar
normalmente el electrón no enlazante. El resto de energía sobrante permite fragmentar la molécula.
En el sistema encontramos también unas placas aceleradoras, o lentes, que son de tipo electródico. Están
ligeramente cargadas, en este caso con una carga negativa, por repulsión pasan a través de ellas con cierta
velocidad los electrones, y tenemos otras placas que hacen que corra y enfocan y reorientan los iones hacia
el analizador de masas.
El tipo de fragmentación es muy sistemática y los espectros son

iguales independientemente del instrumento que se utilice.
Lo que se conoce en este caso en el impacto electrónico es una

ionización dura porque se destruye casi toda la molécula, desde el
punto de vista cualitativo viene muy bien porque la fragmentación,
patrón o huella de la molécula nos permite hacer una comparativa
con espectros ya tabulados para identificar la molécula.
Estos espectros de masas son útiles para la identificación de

compuestos (determinación de grupos funcionales y estructura).
Pero el inconveniente es que la ionización no es muy eficaz y no se
tiene tanta sensibilidad como otras técnicas.

Ventajas y desventajas del impacto electrónico.
La principal desventaja es que la señal del pico de ion molecular es mínima o al menos por debajo del límite
de detección por lo que desaparece.
Como se trabaja a altas temperaturas no solo hay que pensar en que sean térmicamente estables por el
método cromatográfico sino que además tienen que ser estables en el espectrómetro de masas.
• Ionización química (CI)
Se hace cuando lo que impacta con nuestra muestra no es un electrón sino un subproducto que procede de
un impacto electrónico con un gas. Las especies reactivas que se generan cuando el gas impacta con los
electrones son las que luego van a impactar con los analitos ionizándolos.
Un ejemplo muy típico es aquel en el que el gas reactivo es el metano. La ionización se hace por impacto
electrónico pero se aplica una diferencia de potencial de 100 – 200 eV porque se quiere dar una energía a
las moléculas de gas muy grande.
Tenemos una cavidad donde están fluyendo electrones y el gas (metano) choca con los electrones dándose
las siguientes reacciones:
𝐶𝐻4 + 𝑒 − → 𝐶𝐻4 + + 2 𝑒 −
𝐶𝐻4 + + 𝐶𝐻4 → 𝐶𝐻5 + + 𝐶𝐻3
𝐶𝐻4 + → 𝐶𝐻3 + + 𝐻
𝐶𝐻3 + + 𝐶𝐻4 → 𝐶2 𝐻5 + + 𝐻2
Las reacciones son de varios tipos, las principales son en las que se forma el ion molecular del metano. Otra
en la que el ion molecular choca con otra de metano para dar un catión con 5 átomos de hidrógeno. Este es
el más importante de todos.
También tenemos una reacción en que el ion molecular se fragmenta espontáneamente para dar lugar a
otras subespecies. Otra reacción se basa en la reacción de la especie reactiva CH3+ con metano para dar
reacciones bimoleculares y formar una molécula de mayor peso molecular.
La más importante es CH5+ y su característica principal es que es un gran dador de protones de forma que
cuando choca con el compuesto de la muestra y da lugar a CH4 y MH+ que será el ion más abundante. A esto
es a lo que se llama ionización química.
Como el analito (M) gana un protón, en el espectro hay que buscar el peso molecular del compuesto
sumándole 1 del peso molecular del protón.
Esta técnica no es tan agresiva por lo que no se dan tantas fragmentaciones.
• Comparación
(3) ANALIZADORES DE MASAS
Deben poder separar los iones en función de su relación m/z. Los analizadores deben tener una serie se de
características:
o Separar los iones en función de su relación m/z

o Tienen un sistema de vacío que permite que los iones se muevan desde el sistema de ionización hacia el
detector de forma ordenada.
o Alta velocidad de barrido para obtener entre 3 y 5 espectros por pico en el modo de espectro completo.
Hay que tener bien definidos los picos, con bastantes puntos, porque si tenemos menos puntos tenemos
menos sensibilidad y el pico estará mal definido. Se requiere alta velocidad de barrido para tener buena
señal analítica.
o Por el equipo de separación cromatográfico, en el caso de los gases las masas no deben superar los 600
Da. Es un límite que viene definido por el equipo de separación.
o Debe distinguir entre diferencias mínimas de masas (precisión).
o Debe permitir el paso de un número de iones suficiente para producir corrientes iónicas fáciles de medir
(sensibilidad).
• Analizadores de cuadrupolo (más común)
Son 4 barras metálicas opuestas que conforman una especie de tubo a las que se les aplica un campo
oscilante. A cada barra se le aplica una diferencia de potencial primero en modo continuo y luego en modo
alterno. Esas combinación permiten modular el movimiento del ion dentro del cuadrupolo.
En una combinación, los iones más ligeros ondulan y son capaces de llegar al final. Si el cuadrupolo se
combina de otra manera, los iones ligeros chocan con las paredes y se eliminan y son los iones pesados los
que van a pasar.
Es decir, la separación de los iones depende de la combinación

de voltajes que se pongan en las barras del cuadrupolo. La
combinación va cambiando en el tiempo y así se van
separando los iones por diferentes trayectorias en el tiempo.
Se hacen barridos cambiando el voltaje analógico y alterno

con el tiempo para que cada vez pasen diferentes iones y se
consiga un espectro.
10

• Doble enfoque (sector magnético)
Es un sistema basado en un imán eléctrico que está inducido. Se forma un campo magnético y en función
del campo que se forme, los iones cogen una curvatura diferente en función de su relación m/z. En función
de si son más ligeros o pesados se obtienen trayectorias con más curvatura o con menos curvatura.
El enfoque hacia el detector depende del campo magnético aplicado. Su resolución es limitada porque no
todos los iones tienen la misma energía ni velocidad. Esto se mejora con un sector eléctrico que enfoca los
iones en función a su energía cinética.
Tiene alta reproducibilidad, resultados cuantitativos muy fiables, alta resolución (105), sensibilidad y rango
dinámico
• Trampa de iones (trampa iónica)
Se utiliza mucho junto con el cuadrupolo. Los iones quedan confinados en un anillo
durante largos periodos de tiempo por la acción de campos eléctricos y/o
magnéticos.
Es como una caja en donde están confinados los iones y se deja salir a los iones de
la cárcel dependiendo del voltaje que se aplica en modo continuo o alterno. Se
consigue hacer espectros variando con el tiempo el voltaje y la modulación de
corriente alterna y continua.
Se abre la caja y salen unos iones con una relación m/z seleccionada en función del voltaje y corriente
elegidos.
Es decir, los iones con un valor adecuado de m/z circulan en una órbita estable dentro del anillo, salen del
anillo (caja). El resto tienen orbitas inestables y terminan colisionando con las paredes del anillo.
Al existir una alta concentración de iones en el interior de la trampa es relativamente frecuente la existencia
de reacciones bimoleculares entre los iones, lo que puede dar lugar a espectros con esquemas de
fragmentación diferentes a los que se obtienen por otros tipos de analizadores.
Son compactos y alcanzan límites de detección bajos y alta velocidad de barrido.
• Comparativa
La trampa iónica lo que mejor tiene es

la resolución (la que le falta al
cuadrupolo), aunque la sensibilidad
será mejor.
11

CROMATOGRAMAS DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASA
1. CROMATOGRAMAS PARA ANÁLISIS CUANTITATIVO Y CUALITATIVO
Hay 2 tipos de cromatogramas:
Cromatogramas de corriente total de iones (TIC)
En este caso se registran todas las señales de masa/carga de los iones que surgen en el analizador y llegan al
detector. Todas estas señales son como la huella dactilar del pico que vamos a analizar para la formación de
la señal analítica.
A 90º de la señal analítica, observaríamos la abundancia y en el otro eje el espectro de masas que surge de
cada molécula que llega al detector. Es decir, de cada pico del cromatograma que será un compuesto puro,
se hace un espectro en el otro eje de espectrometría de masas.
Habrá numerosos picos en el espectro de masa de cada compuesto puro que ha salido del cromatógrafo. El
perfil del espectro de masas es del tipo m/z. Si no fuese puro, se obtendría una mezcla de m/z.
Cuando hacemos un cromatograma TIC, integramos todas las señales m/z que salen para cada sustancia
(para cada pico cromatográfico). Cada uno de ellos, acondicionamos el detector de masas para que los
registre, y obtenemos el TIC de cada sustancia.
Es decir, el cromatograma TIC se obtiene sumando las

intensidades de todos los iones procedentes de un mismo
barrido a lo largo del tiempo del cromatograma. En cada
pico cromatográfico está contenida toda la información del
espectro de masas correspondiente.
El cromatograma que surge es la corriente total de iones

(TIC) frente al tiempo. Se utiliza para la identificación de
analitos ya que dispone de gran información estructural
(elevado número de iones fragmento en el espectro de
masas). También se puede emplear para análisis
cuantitativo si la concentración es suficiente.
Modo de extracción de iones:
Otra opción de medida que también se utiliza por dar rapidez a la analítica cuando hay alta concentración de
muestra o analito a analizar es el modo de extracción de iones (EIC), que no tiene nada que ver con SIM.
El EIC (modo de extracción de iones) lo que hace es registrar todos los m/z que hay por cada compuesto, e
decir, primero se lleva a cabo un barrido TIC. Una vez hecho este registro y una vez obtenida la gráfica con
todos los iones registrados con su m/z, entonces se representa el cromatograma en función del pico que
más nos guste.
Es como hacer un tratamiento de datos, se selecciona de todos los picos obtenidos, el pico por ejemplo del
ion molecular con el que quiero perfeccionar el cromatograma.
Pero esto no tiene nada que ver con el modo SIM porque en el modo SIM se ponen filtros para que al detector
de m/z no lleguen todos, solo llega el m/z que nos interesa y se obtiene señal exclusivamente de esa señal.
En el EIC llegan todos y luego una vez obtenidos todos, se elige el que más me interesa para obtener el
cromatograma. Se hace un barrido igual que en el modo TIC.
Los problemas que pueden venir asociados al modo TIC es que, aunque suele venir bien hacer un barrido
para conocer un poco la muestra AV
12

Cromatogramas de iones seleccionados (SIM)
En este tipo de cromatogramas no se registran todos los m/z que surgen de la espectrometría de masas de
mi compuesto sino que nos centramos solo en uno de los iones. Se elige el m/z que me viene bien utilizar
para cuantificar ese compuesto. Se coge, de todo el espectro, el m/z más me interesa para luego fabricar el
cromatograma
Es similar a lo que se hacía en absorbancia, pero en absorbancia, el hecho de elegir la longitud de onda donde
se encuentra el máximo permite ganar selectividad pero no se gana tanta selectividad como se consigue en
este caso porque los iones en su relación m/z que obtenemos para cada analito es mucho más selecctivo a
la hora de definir un pico cromatográfico.
Se va a conseguir ver solo un cromatograma con un solo pico, porque solo se está analizando un m/z
solamente. No es lo normal porque este tipo de acoplamientos se utilizan para una muestra compleja y picos
que no sean totalmente puros.
Se fija el analizador para una única señal m/z y después se obtiene el cromatograma. Las ventajas de este
modo es que se tiene una mejor sensibilidad y precisión.
✓ La sensibilidad es mayor en modo SIM, del orden de 100 – 1000 veces porque al centrar todo el esfuerzo
es un pico, se obtienen muchos más puntos para definir el pico cromatográfico y esto se traduce en una
mejor relación señal / ruido.
Cuando hay suficiente concentración no se nota mucho el ruido, pero si la concentración es escasa, el ruido
se hace importante.
✓ Además, se gana precisión que es mayor en SIM que en TIC.

✓ Los límites de detección son más bajos debido al efecto de la integración, ya que se dispone de más
datos para determinar el comienzo y el final de un pico cromatográfico, siendo más adecuado para la
determinación cuantitativa de trazas.
Cuando se mete muestra en el ionizador en modo TIC, se va a ionizar todo lo que llegue; la muestra y la
matriz. La matriz provoca un fondo porque hay un montón de iones que llegan al detector que no aportan
absolutamente nada.
Hay un ruido o background muy difícil de manejar ya que aumentan el límite de detección, dificultan la
cuantificación y disminuye la sensibilidad. Este ruido se puede eliminar si se utiliza el modo SIM porque solo
te quedas con los m/z que te interesan; todos los que pertenecen a la matriz se eliminan.
En la práctica: Normalmente lo que se hace primero es analizar por el modo TIC con un primer barrido para
ver qué iones y picos son los que interesan para cada una de esas sustancias. Esto proporciona información
cualitativa máxima del pico.
Una vez visto cuál es el pico del espectro de masas te interesa, después se hace el modo SIM solo con esa
relación m/z. Esto permite obtener los resultados cuantitativos.
Para cada compuesto se identifican al menos 3 masas: el ion de cuantificación (línea más intensa) y dos o
más iones de confirmación.
13
2. COMPARACIÓN CON CROMATOGRAMAS OBTENIDOS CON OTROS DETECTORES
A la hora de comparar, no es tan fácil hacer una comparativa de cromatogramas en el mismo programa de
temperatura entre un cromatograma en que se usa un detector convencional y un cromatograma en que se
ha utilizado un detector de masas, porque cambian los tiempos de retención que serán menores para masas,
sobre todo en los picos de menor retención.
Esta distorsión es consecuencia de la diferencia de presión entre la columna (presión atmosférica) y el
detector de masas (vacío).
3. SANGRADO DE LA FASE ESTACIONARIA – SANGRADO ENTRE PICOS
En este tipo de purgamientos se observan señales o satélites que pueden venir asociados al propio sangrado
de la columna. El sangrado de la columna suele aparecer entre 2 picos cromatográficos.
Una de las cosas que hay que cuidar cuando se acoplan un cromatógrafo de gases a un espectrómetro de
masas es que la columna aguante temperaturas muy altas, incluso más de las temperaturas que se necesita
para separar porque la columna cromatográfica penetra un poco en el sistema de masas y éste está a
temperaturas muy altas.
Si la columna no aguanta esas temperaturas va a sangrar y van a llegar al detector iones de la fase
estacionaria como parte de la propia muestra.
4. INTERPRETACIÓN DE ESPECTROS
➢ Considerar si el pico está aislado o hay coelución. Para ello se emplea un detector universal que puede
venir acoplado antes de las masas.
➢ Buscar en bases de datos y tener en cuenta la derivatización si se ha realizado.
➢ Considerar si existe el ion molecular.
Existe la posibilidad de acoplar en serie más de un detector de masas. Cuando esto sucede, una de las cosas
que se hace es utilizar el primer masas para obtener un buen ion molecular, con una intensidad adecuada.
Este ion se selecciona y en el segundo masas se fragmenta para hacer una elucidación estructural.
Así, metemos un primer filtro de selección y ya sabemos con bastante seguridad y pureza que lo que
fragmentamos en el segundo masas se debe al ion molecular, que es el único m/z que llega al segundo masas.
➢ Evaluar perfiles isotópicos (permite reconocer la presencia de Cl, Br, S, Si, P, As, I, F). Se utiliza mucho
en proteómica, para el marcaje de proteínas…
➢ Evaluar el patrón de fragmentación. Se utiliza mucho de muchas maneras.
14

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS
1) Comparación de un espectro de masas desconocido con las presentes en las librerías de espectros de
masas
Los programas de ordenador comparan los datos de masas (m/z) e intensidades del espectro del analito a
identificar con los existentes en la librería de espectros de masas estándar o de referencia obtenidos
mediante ionización electrónica a 70 eV.
Esto tiene fines comparativos y de propio análisis. Se analiza todo lo que puede ser por gases con un detector
universal y selectivo como es el de masas.
2) Se aplica tanto a análisis cualitativo como cuantitativo.
En análisis cuantitativo se trabaja con patrón interno, que puede ser una sustancia que no está en la muestra
pero que tiene características semejantes a los analitos o un patrón marcado isotópicamente con deuterio o
con carbono 13. Se utiliza para compuestos volátiles y térmicamente estables.
Con fines cualitativos se utiliza el modo de iones totales, pero para mejorar la sensibilidad en la cuantificación
se usa el modo de iones seleccionados (SIM)
3) Ejemplos de licaciones:
❖ Análisis de alimentos y bebidas
▪ Especies volátiles responsables de aromas y sabores
❖ Análisis de productos derivados del petróleo
▪ Hidrocarburos lineales, ramificados, cíclicos y aromáticos
❖ Análisis de fármacos y drogas
▪ Fármacos y metabolitos en fluidos biológicos
▪ Control de calidad de productos farmacéuticos
❖ Contaminantes en medio ambiente
▪ Pesticidas (organoclorados, organofosforados)
▪ Dioxinas, furanos, compuestos orgánicos volátiles (VOCs), bifenilos policlorados (PCBs),
hidrocarburos poliaromáticos (PAHs)
▪ Derivados del petróleo (BTEX)
▪ Compuestos organometálicos en diversas muestras
15

TEMA 5B. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS
INTRODUCCIÓN
En este caso se acopla un cromatógrafo de líquidos a un espectrómetro de masas. Esto vino después a la
técnica acoplada anterior porque el problema aquí es que la fase móvil de la cromatografía es líquida, por lo
que hay que utilizar interfases diferentes a las de gases; más sofisticadas.
El HPLC se utiliza para analizar especies que no se pueden determinar mediante cromatógrafos de gases
porque no sean volátiles o estables térmicamente o porque el compuesto tenga un elevado peso molecular.
Lo que nos ofrece el acoplamiento líquidos - masas es que es:
✓ Universal
✓ Alta selectividad proporcionada por el espectrómetro de masas.
o Permite una identificación inequívoca del analito
o Confirma como en gases la pureza o no del pico, aunque esto no es determinante para que la
técnica cromatográfica se considere buena o no.
✓ Alta sensibilidad. Requiere menos volumen de muestra, necesitamos menos caudal y el cromatógrafo
de líquidos se ha disminuido. Todo se miniaturiza para poderlo acoplar a masas.
✓ Amplio intervalo lineal (pg – μg).
✓ La muestra se prepara de forma más simple porque siempre será muy simple si utilizamos una técnica
muy sensible, esto es lo ideal, porque si tenemos una técnica sensible, a veces solo con diluir es
suficiente, se diluye la matriz y podemos cuantificar la sustancia de interés porque es detectable
aunque esté diluida.
Siempre que la técnica no es sensible hay mucho más problemas porque son necesarios tratamientos de
muestra más serios como la preconcentración que lo preconcentraría todo y no solo el analito, dando lugar
a problemas con la matriz.
✓ Esta técnica permite determinaciones cuantitativas precisas y exactas.

o RSD < 10% con patrones internos marcados isotópicamente.
Algo que es importante es el hecho de utilizar patrones isotópicamente marcados porque va a ser la misma
molécula marcada con un átomo isotópicamente diferente. El análisis que se haga del patrón va a ser igual
que el analito; si lo que se pierde de patrón es un 20% y se recupera un 80%, de analito también.
Condiciones de operación en cromatografía de líquidos frente a espectrometría de masas:
La fase móvil está a presión atmosférica al salir de la columna aunque haya elevada caída de presión. En
masas se necesita alto vacío.
Las muestras están disueltas en un medio líquido y esto es lo que va a llegar al detector. Al primer
compartimento del detector la muestra llega en estado líquido pero el espectrómetro de masas opera en
fase gaseosa.
La fase móvil puede tener cualquier composición en régimen isocrático o en gradiente. Puede contener alta
cantidad de agua. Además, la fase móvil contiene aditivos volátiles y no volátiles (tampones, formadores de
pares iónicos…). El problema es que el espectrómetro de masas no tolera bien la fase móvil no volátil, y el
agua no lo es.
En espectrometría de masas no puedes introducir fosfato porque no llega al detector por su relación m/z.
Por ello hay que usar complementos como ácido fórmico, tricloroacético… pero no mucho, para tamponar,
sustituir al agua y que en masas no sea un problema.
16

Los caudales de la fase móvil son de 20 nL/min – 1 mL/min. En masas los caudales no pueden ser muy grandes
porque si entra todo en masas, no tiene un rendimiento adecuado, sería difícil ser eficaz en la conversión de
la fase líquida a la fase gaseosa. El volumen que se tiene que convertir en gas no puede ser muy elevado.
La temperatura de separación en la cromatografía es de 20 – 50 ºC mientras que en el espectrómetro de

masas es de 100 – 300 ºC.
En la cromatografía de líquidos no hay límite en el peso molecular de los compuestos, pero en espectrometría
de masas sí que hay una limitación en la relación m/z registrable de los compuestos.
Cromatografía de líquidos Espectrometría de masas

Presión Fase móvil a presión atmosférica Alto vacío
Estado de la Fase líquida Fase gaseosa
muestra
Fase móvil Puede tener alta cantidad de agua y No tolera bien la fase móvil NO volátil
aditivos volátiles o no volátiles
Caudal 20 nL/min – 1 mL/min Requiere caudales más pequeños para
poder volatilizar.
Temperatura 20 – 50 ºC 100 – 300 ºC
Peso molecular Sin limitación en el peso molecular Limitación en la relación m/z que se
puede registrar
INTERFASES
Las interfases son las encargadas de convertir el líquido que sale de las columnas cromatográficas a un estado
gaseoso que es lo que se mide en espectrometría de masas.
También se encargan de aportar la mayor cantidad posible de efluente procedente de la cromatografía de

líquidos al espectrómetro de masas y de enriquecer el analito en la interfase. Esto permite una máxima
sensibilidad.
Problemas a resolver.
Introducir un eluato líquido en un sistema de alto vacío.
- Eliminar previamente la fase móvil.

- Dividir la corriente efluente (pérdida de sensibilidad).
- Utilizar micro/nano columnas de HPLC que utilizan caudales de micro/nano L/min.
- Ampliar la capacidad de bombeo en el sistema MS.
Ionizar compuestos térmicamente lábiles y relativamente no volátiles.
- Las ionizaciones por impacto electrónico y la ionización química nos son aplicables.
- Utilización de sistema de ionización suave a presión atmosférica.
17
TIPOS DE INTERFASES PARA ACOPLAR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS A ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Las interfases son las encargadas de convertir el líquido que sale de las columnas cromatográficas a un estado
gaseoso que es lo que se mide en espectrometría de masas.
Las más utilizadas son:
- Ionización por electrospray o electronebulización (ESI)

- Ionización química a presión atmosférica (APCI)
Otras que también se utilizan son:
- Ionización por termospray (TSP)

- Fotoionización a presión atmosférica (APPI)
1. Ionización por electrospray o electronebulización (ESI)
En este caso lo que se ioniza es una pequeña gotita de fase acuosa en que están incluidos los analitos a
determinar. La gota de fase acuosa se introduce en un capilar metálico muy pequeño y cargado.
Debido a la repulsión de las cargas eléctricas, el líquido sale del capilar formando un aerosol; una nube de
pequeñas gotas altamente cargadas.
De tal manera, que el aumento de la carga superficial que puede ser positiva o negativa se somete a un gas
caliente (nitrógeno) que evapora poco a poco la fase móvil y la repulsión de las cargas positivas de las
moléculas provoca finalmente una explosión culómbica de forma que como resultado se desintegran las
moléculas de disolvente y se libera el analito que se va a analizar con su carga, ya ionizado.
El proceso se repite hasta que el analito está libre de solvente, de modo que no quedan más que iones.
Es una técnica blanda de ionización a presión atmosférica (API) y temperatura ambiente que se aplica a gran
variedad de muestras, en concreto a la caracterización de biomoléculas.
Existen 2 modos de trabajar en ESI, el modo negativo y el modo negativo lo cual depende de aplicar un
voltaje que confiera una deficiencia electrónica o un exceso de electrones. Las 2 técnicas se pueden usar
consecutivamente pero no simultáneamente para tener cromatogramas que vengan como aniones o
cationes.
Nos tienen que decir en qué modo se ha llegado a cabo porque a la hora de elucidar el compuesto para ver
la estructura que tiene hay que valorar si ha ganado un protón (positivo), sino lo tiene… por tanto hay que
saber si se ha trabajado en modo negativo o positivo.
En el modo positivo, los modificadores de la fase móvil son ácidos prácticamente todos, sobre todo si
tenemos sustancias que se separan bien en fases móviles con pH ácido.
En el caso del modo ion negativo se suele utilizar más para analizar sustancias que se separan mejor utilizan
modificadores de la fase móvil básicos.
18

La fragmentación tambien sucede en este caso. En
función del voltaje que se aplique a la molécula habrá
más fragmentos o menos, es decir, en función del chute
los electrones del enlace pueden irse y se disocia la
molécula. Es como una reacción química. Se forman
aductos con sodio si se prepara en materiales de vidrio.
Resumen LC – ESI – MS.
o La ionización por electronebulización es muy suave. Se produce baja o nula fragmentación.

o Se puede trabajar en modo de iones positivos o negativos y se obtienen picos pseudomoleculares.
(M+H)+, (M-H)- , (M+nH)n+ y (M-nH)n- .
o Se pueden producir iones de carga múltiple a relaciones m/z por debajo de 1500. A mayor masa
molecular se produce mayor carga promedio.
o El intervalo de masas debe estar por debajo de 200 kDa.
o Presenta buena sensibilidad para compuestos polares e incluso iónicos. También los compuestos no
polares pueden oxidarse/reducirse en el capilar.
o Se utiliza para biomoléculas, polipéptidos, especies inorgánicas, polímeros sintéticos.
o Se trabaja a caudales reducidos.
o Presenta alta sensibilidad con límites de detección de hasta 10-15 moles (dependiendo del MS).
o Exactitud menor de 0.01% (dependiendo del MS).
o Es necesario utilizar disolventes y tampones volátiles
Problemas en la ionización por electrospray.
Hay diferentes problemas que hay que identificar e intentar solucionar.
Problema 1. Se pueden formar aductos que se forman por el material de vidrio que se utilice para la
separación de la muestra y también de la propia muestra.
Se pueden formar fragmentos moleculares o transiciones del fragmento que se va a analizar y que venga
asociado con alguna carga positiva como el sodio o potasio provocando artefactos.
Los aductos se solucionan añadiendo un ácido que sustituyen el sodio por un protón consiguiendo eliminar
esos artefactos en la señal.
Problema 2. También se pueden formar clusters, por ejemplo la formación de un dímero entre 2 compuestos
ionizados con un protón (M – H – M, donde M es el compuesto).
Se soluciona o eliminan metiendo más energía en el proceso de ionización para evitar la formación. Al meter
más energía, las interacciones intermoleculares se quitan más o menos del todo o se minimizan.
Otro problema asociado a los clusters es que se observan perfiles por duplicado, uno es el perfil del
compuesto único y otro el del compuesto como dímero. Para solucionar este problema tambien se puede
diluir la muestra porque así se disminuye la probabilidad de que 2 moléculas se encuentren y formen el
dímero.
Problema 3. Tambien puede haber problemas con la matriz.
19

2. Ionización química a presión atmosférica (APCI)
Primero se va vaporizando el disolvente antes de la ionización para que cuando llegue a la aguja de descarga
estén los iones en forma gaseosa y con poca cantidad de solvente.
Lo que se va a procurar es evaporar el disolvente. Lo que se hace es aplicar calor a lo que sale del
cromatógrafo para eliminar la fase móvil en gran parte. Una vez que se ha eliminado la mayor parte del
disolvente, con una aguja que provoca descargas eléctricas desde una corona se hace la ionización.
Para terminar de eliminar el disolvente, a la entrada del analizador de masas se pone una corriente seca de
gas que elimina el disolvente y también elimina aquellas sustancias neutras no cargadas que se pueden haber
formado.
Reacciones que suceden.
Es la misma idea que la ionización química de gases, pero a presión atmosférica.
A presión atmosférica lo que primero se hace (o en paralelo) es una transferencia de carga directa de un gas
cargado previamente (nitrógeno o helio) y alojado en el compartimento y directamente se ioniza la muestra.
Si el analito está solvatado, el gas ionizado ioniza al solvato que recubre la muestra (agua por ejemplo) y ya
es el ion H3O+ el que transfiere el protón a la muestra para producir la ionización.
El agua es el disolvente que más capacidad tiene para protonar a los analitos, por lo que tener agua aumenta
la eficacia de la ionización por APCI.
Resumen LC – APCI - MS.
o Los iones del disolvente producen la ionización del analito por ionización química. Es una técnica de
ionización suave y se producen espectros muy sencillos. Dependiendo de la fase móvil y del modo de
ionización podemos tener pseudoiones moleculares o aductos con amonio o acetato: (M+H)+, (M-H)-
(M+NH4)+, (M+CH3COO)-.
Los espectros son muy sencillos porque constan del ion molecular y algunas fragmentaciones muy
previsibles. Existen bases de datos en internet que te predicen o enseñan los iones o fragmentos que se te
pueden crear.
o La información estructural solo es posible con espectrometría de masas en tándem (MS/MS).
Si no se hace una masas en tándem, hay una mezcla de señales porque tienes que asegurarte que al detector
final solo llegue muestra. Por ello primero se hace un espectro de masas que da lugar al ion molecular que
después se fragmenta y llega a un segundo masas donde llegan los fragmentos que inequívocamente
pertenecen a mi molécula.
Si fuéramos capaces de hacer una cromatografía en la que separemos los compuestos perfectamente,
podríamos evitar la segunda masas porque obtendríamos el compuesto puro y estaríamos seguros de
estamos analizando nuestro compuesto y lo podríamos identificar.
o Proporciona buena sensibilidad para compuestos de polaridad baja-moderada (no es adecuado para
compuestos iónicos), adecuada para compuestos termoestables o lábiles y para compuestos volátiles.
o Es útil para masas moleculares por debajo de 2 kDa.
o Se utiliza como técnica complementaria a ESI.
o Presenta mayor tolerancia a tampones y a cambios cromatográficos que ESI.
o Puede trabajar a caudales de hasta 2 mL/min.
20

Problemas en la ionización química a presión atmosférica.
Sobre todo es la formación de aductos con el oxígeno que es difícil de eliminar sobre todo del disolvente y
son difíciles de elucidar.
Se forman muchos iones moleculares de m/z que cuando la muestra no es pura no ayudan a la elucidación
estructural del compuesto.
CONDICIONES DE TRABAJO EN LC-MS
Preparación de muestras.
▪ Extracción y limpieza adecuada (SPE, LLE).

▪ Filtración 0.22 µm (comprobar adsorción inespecífica en filtro) para eliminar las partículas de las
muestras porque si llegan a la cánula la pueden atascar y los análisis no son viables.
▪ Supresión de la ionización debido a la matriz (efecto matriz). Se suele calibrar en matriz ”libre” de
analito (matrix-matched calibration)
Hay supresión de la ionización debido a la matriz. Si se mete el analito en una matriz, por muy diluida que
ésta esté, siempre van a perjudicar a la ionización.
▪ Frecuente irreproducibilidad en la ionización: Necesidad de patrón interno
Fases móviles para LC-MS.
▪ Se utilizan disolventes orgánicos porque son volátiles. Se tiene que evitar que formen aductos. Es
imprescindible que tengan calidad MS para disolventes orgánicos; los disolventes tienen que estar
muy puros. Los reguladores de pH que se van a utilizar son:
o Ácidos: ácido acético, ácido fórmico y TFA (menos indicado)
o Básicos: sales amoniacales (NH4HCOO, NH4CH3COO)
▪ No usar surfactantes ni formadores de pares iónicos.
▪ Concentración recomendada para tampón < 100 mM en APCI y 10 mM en ESI.
SISTEMAS TÁNDEM (MS/MS). TRIPLE CUADRUPOLO (QqQ)
Básicamente lo que permite es hacer elucidación

estructural.
Triple cuadrupolo: modo de operación de iones-producto

(Product ion scan).
En el primer analizador MS1 (Q1), que opera en modo SIM,

se filtran los iones de interés, que luego se dirigen a la
cámara (celda) de colisiones activadas (Q2 o q) donde se
“activan” y se fragmentan, los iones-producto se analizan
en el segundo analizador MS2 (Q3) que puede operar en
modo full scan, haciendo el barrido de masas (m/z)
menores que le del ion-precursor.
APLICACIONES DE LC-MS
Sirve para todo: análisis forenses, medio ambientales, comida y bebida, farmacéuticos, biofarmacéuticos,
industrial…
21

Wuolah Free Tema 5. Acoplamientos de Tecnicas Cromatograficas A Espectrometria de Masas

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Wuolah Free Tema 5. Acoplamientos de Tecnicas Cromatograficas A Espectrometria de Masas

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

TEMA-5.-ACOPLAMIENTOS-DE-TECNICA...

Química Analítica III

Facultad de Ciencias Químicas

Reservados todos los derechos.

¿POR QUÉ ACOPLAR LA CROMATOGRAFÍA A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS?

Proporciona información acerca de:

- Estructura de las moléculas orgánicas, inorgánicas y biológicas.

EJEMPLO. Es un espectro de masas de una molécula: 2 – fenoxietanol.

si lees esto me debes un besito

ACOPLAMIENTOS MÁS COMUNES A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS

TIPOS DE ACOPLAMIENTOS MÁS COMUNES A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

Hay 3 tipos de técnicas acopladas; nosotros veremos las 3 primeras:

• Cromatografía de gases – espectrometría de masas. GC – MS

CARACTERÍSTICAS DE LAS TÉCNICAS ACOPLADAS.

El acoplamiento de las técnicas cromatográficas a espectrometría de masas nos va a proporcionar

La bidimensionalidad permite por un lado obtener los tiempos de

La gente que trabaja con cromatografía acoplada a masas no se

si lees esto me debes un besito

Depende de si es un cromatógrafo de gases o de líquidos, la fase móvil es gaseosa en cromatografía de gases

En general lo que tiene que haber es:

➢ Compatibilidad. Nos la dan las interfaces que se pongan entre medias.

Requisitos para acoplar cromatografía de gases a espectrometría de masas.

Se utiliza para moléculas pequeñas volátiles y térmicamente estables.

Requisitos para acoplar cromatografía de líquidos a espectrometría de masas.

- Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI)

si lees esto me debes un besito

CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Permite detectar coeluciones cromatográficas e identificar picos sin resolver.

Los compuestos se ionizan mediante ionización

Los fragmentos neutros no se van a analizar porque para

CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A MS

si lees esto me debes un besito

• Interfase de división de flujo: open Split

Se utiliza cuando se requiere un mayor caudal del gas portador (sensibilidad).

Entre el cromatógrafo de gases y el espectrómetro de masas se introduce un dispositivo de conexión

si lees esto me debes un besito

• Impacto electrónico (EI)

Tenemos una cavidad por donde entra la muestra. A 90º de la entrada de

Entre ambos electrodos se genera una diferencia de potencial de 70 eV que es

Los 70 eV dan lugar a un flujo de electrones en perpendicular a la muestra. La

El tipo de fragmentación es muy sistemática y los espectros son

Lo que se conoce en este caso en el impacto electrónico es una

Estos espectros de masas son útiles para la identificación de

si lees esto me debes un besito

• Ionización química (CI)

𝐶𝐻4 + + 𝐶𝐻4 → 𝐶𝐻5 + + 𝐶𝐻3

Esta técnica no es tan agresiva por lo que no se dan tantas fragmentaciones.

o Separar los iones en función de su relación m/z

• Analizadores de cuadrupolo (más común)

Es decir, la separación de los iones depende de la combinación

Se hacen barridos cambiando el voltaje analógico y alterno

si lees esto me debes un besito

• Trampa de iones (trampa iónica)

Son compactos y alcanzan límites de detección bajos y alta velocidad de barrido.

La trampa iónica lo que mejor tiene es

si lees esto me debes un besito

1. CROMATOGRAMAS PARA ANÁLISIS CUANTITATIVO Y CUALITATIVO

Hay 2 tipos de cromatogramas:

Cromatogramas de corriente total de iones (TIC)

Es decir, el cromatograma TIC se obtiene sumando las

El cromatograma que surge es la corriente total de iones

Modo de extracción de iones:

si lees esto me debes un besito