TOXICOLOGIA-veneno de animales

LBEZ: laboratorio de biología estructural y zooquimica.

QUE ES LA TOXINOLOGIA?--> estudio de las toxinas producidas x

animales,plantas,MO. Siendo su objetivo principal el desarrollo de fármacos, como
sueros, drogas.

PQ LA TOXINOLOGIA ES TAN IMPORTANTE?--> para entender

moléculas//Cumplir nuevas necesidades terapéuticas. Ya q hay cambio en patrones de
muchas enfermedades, es decir un fármaco q hoy funciona bien quizás al próximo año
ya no sea tan eficaz teniendo un menor grado de actividad (resistencia antimicrobiana).
Por ende el objetivo es claro, cumplir nuevas necesidades terapéuticas.
Para esto es necesario:
 desarrollo de técnicas mas sensibles (espectometros de masas, antes estos
necesitaban cantidad de material muy grande, x ende se extraía mucha
cantidad de veneno** SENSIBILIDAD**),
 investigación interdisciplinaria (test biológicos con molecula. Estudio completo.
Actividad, preparacion)
 programas de bioprospeccion para la explotación sostenible de la
biodiversidad. (para investigar venenos a veces se mata animal lo cual no nos
sirve ya que se explota estos animales por ende ahora se utilizan una cantidad
menor de moléculas para luego crearlas (sintéticas). ESTO DE DEBIA A LA
SENSIBILIDAD DE LOS EQUIPOS?.).
*** la sensibilidad es la cantidad de muestra necesaria para que yo pueda visualizar
dentro de una técnica. Ej: tngo una toxina X. yo necesito 1 microgramo de esta toxina
para visualizar en un spectometro de masas q tiene una buena sensibilidad. Si voy en un
espectometro de masa mas antiguo q no tiene tanta sensibilidad, en este caso tendría q
colocar mas microgramos de toxina. En cambio en los mas nuevos se necesita
Sensibilidad : cuan sensible es un equipo//cuanta muestra debo colocar para visualizar.

***REsolucion capacidad de distinción de 2 moleculas que tengan masas similares.

Ej: los espectometros antiwos podían distinguir masas con diferencia de 0,5. Hoy los
actuales tienen una resolución que es capaz de distinguir (capacidad de distinción)
masas con diferencia de 0,0001.
Es importante preguntar sensibilidad de equipo (cantidad para analizar) y la resolucion
(capacidad de distinción de masas distintas pero q están cercas).

***Elección de técnica analítica va a depender de la toxina que queramos analizar***

Resolucion y sensibilidad dependen del tamaño de la toxina. Pq si son muy grandes

(proteínas enormes, toxinas grandes) tenemos problemas al momento de ionización
(fuerza de ionización para esa proteína es muy grande, x ende ionización lenta),
entonces necesitamos una cantidad de moléculas mayor. Diferente es con moléculas
pequeñas ya que su ionización es rápida, x ende se necesita una cantidad menor.

Tengo q saber resolución y sensibilidad del equipo para masa especifica (x ej, masa de
molecula de 1000gr). Estándares ya establecidos en estos procesos
Q SON LAS TOXINAS?--> instrumentos de gran utilidad para investigación
fisiopatológica. Pq?¿ya q tienen la capacidad de interactuar específicamente con
receptores y enzimas
** veneno conjunto de toxinas ** .Cuando aislamos vemos sus cualidades particulares.
Q se logra con la aislación de toxinas?¿?--> menos efectos secundarios
Presencia de regiones estructuradas con una alta concentración de residuos cargados
positivamente: tiene q ver con la especificidad q tienen algunas toxinas x si solas.

Cual es el interés científico en las toxinas?¿?

Comprensión del modo de acción de las toxinas para esto tenemos como herramientas
 Crecimiento celular
 Migración celular
 Contracción muscular
 Actividad nerviosa
 Control de la presión arterial
 Problemas vasculares
 Proceso inflamatorios
 Mecanismo de dolor
 Procesos alérgicos
Rango de posibles actividades de toxinas, se puede predecir con técnicas de
quimiometria, machinglerning, PCA. Q sono capaces de predecir la actividad de una
toxina aislada.

Toxina aislada puede actuar como no veneno, sin embargo con otra toxina puede haber
sinergia y tener mayor actividad antimicrobiana. Ej.

TECNICAS Q SE UTILIZAN PARA EXTRACCION DE TOXINAS

** depende del animal **x ej veneo de serpiente se hace con una anestesia en la
serpiente con gas.
 Extracción manual= venenos de insectos (tmbn hay automáticas). En serpientes
igual se puede pero es mas arriesgado
Reservatorio de veneno= al momento de picar en algún objetivo, este musculo se
contrae liberando todo el veneno.
 Extracción eléctrica= en abejas x ejemplo se colocn gradillas con energía en la
puerta de la colmena. Al momento de entrar con shock eléctrico hacia q abeja
liberara el contenido del reservatorio de veneno. En este proceso animal no
muere, sin embargo el veneno rápidamente se degrada x las proteasas. (para
inhiir esto se coloca extractor y se retira rápidamente)
Scorpion tambn se puede extraer de esta forma (shock en la cola)

*** hay q esperar un tiempo dsp de alguna extracción de veneno para q el animal vuelva
a tener (cada 15 dias aprox). Pasa x un proceso de maduración//activación ***

venenos de animales utilizado puede ser diferente al q se encuentre tiempo dsp en el

reservorio del animal o ¿planta?

COMPOSICION DE LOS VENENOS

 MOCO (lípido, carbohidratos, etc. No so toxinas principales)
 MASA BAJA (compuestos pequeño, muy utilizados)
  PEPTIDOS (proteínas pequeñas con estructuras no tan complejas como
proteínas)
 PROTEINAS (principales toxinas estudiadas fueron estas, debido a q antes no
existían equipos con buena sensibilidad, x lo cual se estudiaban solo toxinas q
estuvieran en gran cantidad. Con el tiempo y la cracion de equipos mas
sensibles se dieron cuenta de la complejidad de las toxinas ya q aparecieron
moléculas pequeñas y en menor cantidad q tenían mejor actividad q las mismas
proteinas)
** no es la cantidad, es la afinidad **

QUE HACE Q UNA MOLECULA SEA EFECTIVA¿?¿ SUS CARGAS

PRINCIPALMENTE. Su composición (estructura) hace q una molecula este mas o
menos cargada, ¿?¿entre mas cargada mas activa?¿?

COMO SABEMOS CUAL ES LA CARGA DE UNA MOLECULA?¿? con la

constitución de la molecula. Proteina esta formada x AA cargados positiva (acidos) o
negativamente (básicos). Cuando tenemos una estructura con AA acidos mayor , es xq
esta cargada positivamente. X ende para saber carga de una TOXINA hay q saber su
constitución (SECUENCIA, NO ESTRUCTURA) de AA.

Proteínas y péptidos eran los responsables de los dolores, edemas, reacciones alérgicas y
sistémicas.
 Los péptidos mas simples no tienen puentes de disulfuros, estos mismo pueden
funcionas como hemolíticos, antibióticos, BPPS
 Y las moléculas mayores tienen capacidades únicas de actuar con canales
ionicos (sodio,potasio,calcio,cloro) capacidades distintas.
Utilización de mezclas de estas molecula (toxinas), hacen q veneno sea eficaz para
distintos organismos.

PQ antibióticos dentro del veneno?¿?¿ para proteger al animal

Los péptidos tienen otra capacidad= ser anfipaticos (polo hidrofilico y otro
hidrofóbico), significa q estos péptidos puedan servir como fármacos en distintas
membranas (absorción).
 Antimalaricos, inmunosupresores, anticancerígenos, antibióticos, control de
arritmia y presión, anticonvulsivo, insecticidas.
**Selectivos en su actividad pero pueden trabajar en lugares distintos**

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES de TOXINAS

Q ES?¿?  adicción de grupos químicos (fosfatos,acetato,carbohidratos o lípidos),
dentro de una proteína cambiando totalmente la actividad
Para q sirve¿?¿ para diversificar las actividades proteicas. Aumenta: diversidad y
complejidad del proteoma.
**SUPER IMPORTANTE**
PTMs mas comúnmente estudiados ubiquitinacion, glicosilacion, hidroxilacion,
fosforilacion

PRINCIPALES PASOS EN LA ELABORACIO DE UN NUEVO FARMACO A

PARTIR DE TOXINAS NATURALES
  Como aislar una molecula?--> estrategia instrumental, depende del tipo de
muestra q se este trabajando. Antes de elegir mi estrategia instrumental tengo
q pensar mi objetivo// q hare con mi molecula. Ej. estas puede ser una mezcla
compleja o quizás no, o si la quiero utilizar para aislar y hacer actividad, o para
hacer estructura y no para actividad.
**No hay una estrategia que sea universal, todo va a depender de la muestra**
Cromatografía y electroforesis no son técnicas destructivas, entonces si se
pueed recuperar la toxina//muestra.
Espectometria es una técnica destructiva, acaba con la muestra.

Ej. Tomamos veneno, hacemos electroforesis lsks, tomamos c/u toxinas de

forma aislada, hacemos digestión y hacemos una identificación x
espectrometría de masas (x dar un tipo de estrategia instrumental).

Puntos negros no se sabe q proteína es. Esto pasa xq concentracio de toxina

en veneno es muy baja para ser detectada.

 Inmunodeteccion por western blotting (otra estrategia) utilizamos el veneno.

Para identificar toxinas en pacientes alérgicos (toxinas alergénicas).

 Estrategia cromatografica
Espectrometría de masas sirve para obtención de masa molecular de compuesto
(toxino en este caso), demás en ppt.
¿Como funciona un espectrómetro de masas?--> SISTEMA DE IONIZACION. esi y
maldi mas utilizados para toxinas. MALDI para moléculas mayores y esi para
moléculas no tan grandes.
Luego viene separación q no viene de un espectrómetro de masa
Luego detección y finalmente revisar q wea.

MALDI utiliza una matrix q va junta a la muestra. Matrix tiene capacidad de recibir
energía muy alta (ionizar), para luego pasar energía a muestra de interés

IONIZACIOn TIPO ELETROSPRAY muestra en solución. Solo pasan partículas

disolvatadas (q no tengas muchas moléculas de agua)
Factor de la q dependerá la elección del equipo es la configuración del equipo y tipo de
muestra.

UNA vez se tenga la molecula aisalada se puede hacer un screening?¿

Luego se puede detectar el mecanismo de acción de la toxina.

PRACTICO TOXICOLOGIA:

** obejitov: como es, cual es el equipo y para q sirve. En MALDI se hara un

experimento en vivo para la identificación de una proteína.
Los 2 equipos sirven para identificar toxinas, pero la diferencia es q el HPLC masa
como esta acoplada a HPLC tenemos una separación de los compuestos (liquido) y
después análisis en el espectometro de masa q es un electrospray.

TENEMOS UN GENERADOR DE NITROGENO ya q equipos de tipo electrospray

ncesita un gas para generar spray.
Tenemos un HPLC llamado UFLC= cromotografia liquida de alto rendimiento?¿?
Coomo funciona un HPLC?¿ tenemos un autosample (d vamos a coloca nuestra
muestra, la cual debe ser liquida SI O SI).
Muestra se coloca en el “recipiente” y dentro hay un inyector automatico (tambien
puede ser inyección directa si no quiero separar compuestos) q va a pinchar la muestra y
pasarla para otras partes del HPLC (solo es un autosample, contiene la muestra).
Cuando quiero separar los compuesto antes de entrar en el equipo tengo q pasar por
comatografo.
Tenemos una bomba A y bomba B. cada uno trabaja con su disolvente ( Hay una pate
del equipo q va a hacer la mezcla de los disolventes.
Por ende vamos a tener q la muestra va asalir x autosample va entrar x el flujo q va a
tener la mezcla de los 2 reactivos y luego con la muestra en ese flujo tenemos el horno
dd va a estar la columna (va en adaptador)
Pq tenemos un horno?¿ xq la temperatura en la separación de los compuestos es muy
importante. Siempre deben ser a la misma Tº

Flujo del liquido sigue hacia arriba x manguera y luego tenemos el detector UV y x
ultimo un comunicador (va a ser el control de todo el equipo). Xq si yo solo quiero
separar compuestos//toxina en una mezcla, antes de analizarlos puedo pasar x
cromotografia, sin embargo no nos sirve separar compuesto si no q tenemos q
idetificarlos.
ESTE EQUIPO HPLC TIENE ACOPLAdo a un eSPECTOMETRO DE MASA del
tipo ELECTROSPRAY (tipo de ionización). Se utiliza para compuestos con masa mas
baja, y el MALDI para compuestos con masa mayores. Pero se puede utilizar igual y ver
si se ioniza bn. Lo importante de estas herramientas (espectometro de masa)es q la
muestra q esta en la maezzcla se ionize bn. Ionizar es tener cargas suficientes para q
equipo pueda leer estas masas.
Muestra luego sale del cromatograma y entra a probi . Este es la parte del espectrómetro
de masa (ionización) (hara el spray) en donde el liquido q viene del HPLC se convierte
en spray (en probi junto a calentadores) para poder entrar al equipo (moléculas
volatilizan).
dentro de este equipo los compuestos son detectados según sus masas moleculares.
Q SE OCUPA PARA CONVERTIR LIQUIDO EN SPRAY TONCE¿¿?--> Gas (N),
alta energía y alta temperatura.

Cromatograma es todo lo q viene del cromatógrafo liquido (separación de compuestos x

detección UV) y tenemos un espectro (espctometro de masas)

Cuando muestra es muy compleja tenemos q hacer separación x algún método

cromatografico.
Si tengo un veveno prácticamente desconocido se debe tomar uno x uno los compuestos
y hacer la fragmentación de las masas de interés.
Se pueden hacer en los 2 intrumentos nombrados anteriormente solo va a depender de la
forma de entrada de la muestra al espectometro de masa. (forma de ionizar)

MALDI: sistema de ionización MALDI que es una matriz asistida x laser. Y dsp 2
analizadores secuenciales del tipo TOF.

Es importante saber el tipo de muestra q puedo utilizar en cada tipo de espectometro.

Maldi deben estar en forma solida (debe cristalizar con matriz). En HPLC muestra debe
estar liquida. (espectometro de masa=muestra spray¿?). muestrapuede ser veneno,
extracto, etc.
EJ. Muetras de bacterias y hongos, era distintas para comparar perfil entre ellas y buscar
toxinas.

** placa del maldi es propia para recibir una potencia de laser, este va a incidir en la
muestra junto con un compuesto va a ionizar dentro del equipo.
 Muestra se coloca en cada uno de los pocillos de la placa MALDI (No puedo
contaminar una muestra con otra.)
Luego de poner las muestras se utiliza matriz (compuesto q tiene una potencia de
ionización muy grande), cuando laser incide en matriz esta recibe energía muy alta y se
carga. Cuando matriz esta cristalizada con muestra, el laser incidirá en muestra y matriz
pero como la matriz tiene mayor poder de recibir energía, ella va a pasar las cargas para
las muestras y es asi como se ionizan las muestras o mas bien volatilizan dentro del
analizador MALDI.

En equipo q hablamos anteriormente, la parte del PRODI, es donde se forma la

ionización de muestra (muestra pasa de estado liquido a gas y están cargadas ya q Prodi
tiene alta energía, gas y alta temperatura )

El sistema de ionización en MALDI es el laser y la matriz y placa para apoyo de la

muestra.
Va a hacer la disolución de la muestra para dentro del equipo.
Ya cristalizada la muestra y matriz, se coloca placa de MALDI en la parte inferior.

Ambos equipos trabajan con vacio (equipo es cerrado, x 2 motivos= partes del equipo
son muy sensibles por lo cual no pueden estar expuestas. Con el tiempo el masas se
daña.
**EN pantalla de MALDI (q se utiliza para adquisiciones de espectro)**
Lo primero q tgo q hacer es un screening para ver q hay en la muestra. Para eso debo
elegir rango de masas q quiero trabajar. Si busco una toxina pequeña ocupo rango de
masa pequeño, si quiero grandes, trabajo con rangos de masa grandes.

Tambien puedo configurar potencia de laser

Fradimentacion o telifting? **solo con la masa no puedo sbaer q compuesto es ya q

muchos compuestos pueden tener la misma masa.
Molecula pueden tener varios picks llamado endelope isotópico: q es¿? Moléculas de la
misma constitución pero con carbonos distintos.
FRAGMENTACION ES IMPORTANTE para ver la intensidad de el compuesto en
especifico.
Para hacer fradimentacion de moleculo, elegiré el pick con mayor intensidad, cambio a
fradimento y pincho en start, el laser comienza a incidir en la muesta matriz.
¿Cómo s efragmenta una proteína en el equipo¿ se fragmenta en los puentes de
hidrógenos. Dando como resultaos varios fragmentos con masas distintas pero no mayor
a la masa del compuesto fradimentado(de una molecula)

Escuchas min 45 nacho explica lw en 2 segundos. (detectar masa y fragmentar)

Elegimos la zona, elegimos pick mas grande, hacemos fragmentación y todos ls
fragmentos son el resultado de el pick inicial.`+`+`

Como hacemos para saber q toxina es esa?

Para saber la constitucion amonoacidica de compuesto debo hacer subdistracciones
entre los picks y encontrar masas moleculares (q hay en una tabla)……. Habran
diferentes tipos de fragmentaciones pero la que me interesan son las q rompen enlaces
peptídicos y separan AA.
ya q los otros son fragmentos de una molecula principal.
Diferencia entre peso de un AA y otro, si es negativo es xq hay perdida de agua x l cual
no seria un aminoácido

Software peaks (interpretación de espectros)

A partir de una masa molecular puedo fradimentar e interpretar la secuancia de cada una
de las moléculas. Con esto puedo buscar en bancos de datos isi ya fue depositada
(conocida) o puede ser nueva.
Ahora q es lo q se le hace a esa toxina?¿? es sintetizarla ya q perdi la muestra debido al
espectrómetro de masa. (distinto a la cromatografía)

** Sistema de ionización MALDI-TOF:

Y sistema electrospray: en sistema de electrospray la muestra puede ser inyectada
directamente (en caso de no separar compuestos) o pasar por un proceso de
cromatografía liquida si la molecula es muy compleja (necesita separarse).
En caso de utilizar proceso de cromatografía, la muestra se coloca en un autosample y
gracias a un inyector automatico esta muestra (liquida) va a pasar por distintas partes del
cromatógrafo hasta llegar al eSPECTOMETRO DE MASA del tipo ELECTROSPRAY
el cual esta acoplado al HPLC. Antes de entrar al espectometro de masa de tipo
electrospray, la muestra gracias al probi y sus calentadores van a convertir la muestra
liquida en spray x Gas (N), alta energía y alta temperatura, provocando que esta muestra
se ionize

Cuáles son los principales sistemas de ionización en espectrometria de masas y

para qué se utiliza la herramienta de fragmentación del espectrómetro de masas?
Sistema MALDI-TOF= se utilizan muestras solidas. ionizacion ocurre gracias a el laser, la matriz y
placa para apoyo de la muestra.
Sistema de electrospray= utiliza muestra liquida, la cual puede pasar previamente por equipo
cromatografico (en caso de querer separar moléculas) o se puede agregar a un inyector directo hacia
sistema de electrospray. ionizacion ocurre gracias a PROBI junto a calentadores
La fragmentación básicamente se utiliza puesto que los venenos de animales están compuestos por
mas de una toxina puedan, gracias a esta herramienta obtener pedazos mas pequeños de la muestra
con el fin de poder determinar la masa molecular exacta de cada fragmento y secuencia de peptidos.

Describa 3 aplicaciones prácticas relacionadas con las técnicas de espectrometría

de masas y toxinologia.
existen diversas aplicaciones como por ej.
se puede utilizar en la identificación de compuestos desconocidos y su cuantificación, brinda la
oportunidad de obtener información sobre masas moleculares simples para las secuencias de
péptidos de muestra, también para ionizar distintas moléculas grandes no volátiles de importancia
biológica de la proteomica del veneno de serpiente para el desarrollo de nuevas herramientas de
investigación, el descubrimiento de fármacos y el diagnóstico clínico.

Describa es la importancia de las toxinas de origen animal para los estudios de

farmacología
La importancia de la toxinas en el estudio de farmacologías es clara, cumplir nuevas necesidades
terapéuticas. Debido a que hay cambio en patrones de muchas enfermedades, es decir un fármaco
que hoy funciona bien quizás al próximo año ya no sea tan eficaz teniendo un menor grado de
actividad (como x ej. resistencia antimicrobiana).

¿Qué tipo de moléculas forman parte de los principales componentes de los

venenos animales?
MOCO (lípido, carbohidratos, etc. No son toxinas principales)
MASA BAJA (compuestos pequeño, muy utilizados)
PEPTIDOS (proteínas pequeñas con estructuras no tan complejas como proteínas)
PROTEINAS (principales toxinas, estas eran muy estudiadas debido a que antes no existían equipos
con buena sensibilidad, por lo cual se estudiaban solo toxinas que estuvieran en gran cantidad).