Purificación de una proteína en una muestra problema
Armenta Navarrete Valery
Resumen.
Para estudiar detalladamente las propiedades de cualquier
proteína es preciso contar con una muestra homogénea que
sólo contenga moléculas de un tipo. Las técnicas de
separación se concentran en el tamaño, la carga y la
polaridad, que es donde residen las diferencias de las
moléculas. Se aplican muchas técnicas para eliminar
contaminantes y lograr una muestra pura de la proteína de
interés. El porcentaje de recuperación indica cuánto de la
proteína de interés se ha conservado en cada paso (Desmaris,
W. 2002)
En esta purificación se llevarán a cabo dos métodos para
eliminar dos proteínas contaminantes en una mezcla de 3
proteínas, donde la 1, es la que buscamos extraer. En primer
lugar una cromatografía de intercambio iónico, y en segundo
lugar una filtración en gel, ambas técnicas fueron elegidas a
partir de las propiedades que pudieron ser observadas a
detalle en electroforesis en gel de poliacrilamida de la mezcla
inicial en una dimensión. Con este procedimiento, pudo
concluirse que hacer pasos con diferentes métodos para la
eliminación de contaminantes de una muestra problema en la
que buscamos purificar una proteína, va disminuyendo el
rendimiento de la purificación, y también la cantidad de
proteína purificada, mientras más pasos sean necesarios para
lograr purificar la proteína de interés, por lo que el
enriquecimiento aumenta y el costo del procedimiento (tanto
en dinero, como en horas invertidas) aumenta también, por lo
que es necesario conocer las propiedades de la proteína que
se busca purificar, para así poder elegir los métodos
adecuadas para una purificación eficiente, que evite la máxima
pérdida proteína de interés.
Introducción.
La cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas
en función de su carga neta de superficie, a través de
interacciones electrostáticas que ocurren entre las proteínas y
la fase estacionaria cargada. Existen dos tipos de CII: (1)
intercambio aniónico (fase estacionaria cargada positivamente
que une proteínas cargadas positivamente); y (2) de
intercambio catiónico (fase estacionaria cargada positivamente
que une proteínas cargadas negativamente). (Corbett R, 1984)
Luego de cada separación cromatográfica se deben analizar
las fracciones para determinar cuáles de ellas contienen la
proteína de interés, y además la pureza de esas fracciones.
Este análisis es necesario luego de cada paso para decidir
qué fracciones deben ser combinadas para su uso posterior.
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de
sodio (SDS-PAGE, por su sigla en inglés), el cual es un gel
desnaturalizante que separa las proteínas en función de su
tamaño. (Gibson B, 2019)
La actividad de la proteína es una prueba enzimática que
depende de la proteína de interés. Este método para evaluar
la pureza proteica es, a menudo, acoplado a otro método de
determinación de concentración de proteínas para calcular la
actividad en función de la concentración total de proteínas.
Los ensayos de actividad solo son aptos para proteínas con
actividad que puede ser fácilmente determinada utilizando un
ensayo de alta capacidad de procesamiento, tal como las
proteasas. Para algunas proteínas los ensayos de actividad
son un método rápido y confiable para la detección de la
proteína. La medición de actividad es, a menudo, ideal para
enzimas, ya que las proteínas que han perdido actividad
pueden ser excluidas de los pasos siguientes. (Kim Y, 2011)
Objetivos.
Purificar una proteína de una muestra problema.
Hipótesis.
● A partir del conocimiento de las propiedades
fisicoquímicas de una proteína en específico,
podemos purificar esta de una muestra con distintas
técnicas de separación.
● El enriquecimiento y el costo del procedimiento (tanto
en dinero, como en horas invertidas) aumenta
mientras más métodos sean necesarios para obtener
la proteína purificada.
● Disminución del rendimiento y de la cantidad de
proteína de interés mientras más pasos sean
necesarios para obtenerla.
Materiales y métodos.
Con una columna de Q-Sepharose y un Amortiguador : TRIS
20 mM pH 7, PMSF 1 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, en un
gradiente molar de 0-0.5 de NaCl se realiza una cromatografía
de intercambio iónico para separar de la mezcla inicial de 3, la
primera proteína con propiedad diferentes, a partir de eso, se
realiza una filtración en gel, para separar por tamaño de
partícula la proteína 1 de otra con diferente tamaño, e igual
pH, se usa una matriz de Sephadex G-100.
Resultados
Figura 1. Características de estabilidad de la proteína 1 en
una mezcla sencilla de 3 proteínas.
En la Figura 1 tenemos presente una fácil mezcla de 3
proteínas, nos encontramos de primera mano con las
propiedades de estabilidad de la proteína de interés. Con esta
información sabemos qué a nuestra proteína 1, de una mezcla
de 3, hay que mantenerla en hielo y que tenemos un alto
rango de pHs con los que jugar para separarla del resto.
Lo primero que haremos es mirarlo en gel para descubrir un
poco más de sus propiedades, en la Figura 2 se observan
todas proteínas que están en la mezcla, tenemos 3 diferentes,
que a simple vista podemos discernir que las dos en vertical
tienen el mismo pH, y las dos en horizontal el mismo tamaño.
Figura 3. Inmnunoblot proteína de interés (1).
Con esta información sabemos que existe una diferencia en el
pH entre las dos proteínas horizontales, entonces si
imaginamos la separación desde valores mayores a a pH 7,
sabemos que las dos proteínas presentes a un pH de 7.5
están cargadas positivamente, mientras que la proteína que
está a un pH menor de 7, estará cargada negativamente.
Siguiendo ese razonamiento, utilizaremos la cromatografia de
intercambio ionico para separar en base a la carga.

Figura 4. Matriz y gradiente utilizados en una cromatografía

por intercambio iónico.

Teniendo el conocimiento de que la matriz de Q-Sepharose

logra que se peguen proteínas cargadas negativamente,
utilizamos dicha columna (Figura 4), también al saber que al
Figura 2. Electroforesis PAGE en dos dimensiones de la
usar un gradiente de sal para eluir, la sal desplazara la
mezcla inicial de 3 proteínas.
proteína que actúa para enfrentar la sal de la proteína en sí
misma, escogemos un gradiente de sal entre 0-0.5 (Figura 5).
Con un inmunoblot (Figura 3), se usa un anticuerpo para
identificar la proteína 1, la cual es en la que estamos
interesados, en el podemos percibir nuestra proteína tiene un
tamaño de 40 K y un pH de aproximadamente 7.5.
 Figura 7. Actividad enzimática de la proteína de interés
después de cromatografía de intercambio iónico.

Extraemos las fracciones que se encuentren entre 10 y 30

(Figura 8), obteniendo 20 mg de proteína (Figura 9).

Figura 5. Condiciones de cromatografía de intercambio ionico.

Se elige un buffer a ph 7 (Figura 5) ya tenemos conocimiento

de la proteína en la que tenemos interés está cargada
positivamente, por lo que no se va a quedar en la matriz, sino
que va a pasar sin problema por ella. Dejando tras de si lo que Figura 8. Intervalo de extracción de fracciones para el pico de
no es de nuestro interés. la proteína de interés.

Figura 6. Proteína eluida de una columna de Q-Sepharose

con un grado creciente de sal.
Figura 9. Propiedades de la purificación después de la
Podemos observar la gráfica (Figura 6) dos picos, uno detrás primera cromatografía de intercambio iónico.
de la línea rosa (que representa el gradiente de sal) y otra
delante de este gradiente. Si recordamos que nuestra proteína Revisamos el gel y observamos que ahora sólo tenemos dos
está cargada negativamente, podemos intuir que el pico del proteínas (Figura 10), pues la proteína cargada negativamente
espectro que estamos buscando es el primero, confirmamos se quedó en la matriz de la columna de intercambio iónico.
observando la actividad enzimática de nuestra proteína de
interés (Figura 7).
 Figura 12. Actividad enzimática de la proteína de interés
después de filtración en gel.

Extraemos las fracciones desde 50 a 65 (Figura 13),

Figura 10. Electroforesis PAGE en dos dimensiones de la revisamos el gel y observamos a 10 mg (Figura 15) de nuestra
mezcla después de cromatografía por intercambio iónico. proteína de interés purificada (Figura 15 y 16)

Ahora las dos proteínas restantes tienen el mismo ph, lo que

quiere decir que tienen el mismo punto isoeléctrico, entonces
no podemos usar intercambio iónico para separarlas, lo que sí
tienen diferente es el tamaño, por lo que podemos usar una
filtración en gel (Figura 11)

Figura 13. Extracción de fracciones en el intervalo de la

actividad enzimática de la proteína de interés.

Figura 11. Filtración en gel en una matriz de Saphadex G-100.

La filtración en gel separa en base al tamaño, elegimos la

matriz Sephadex G-100, esto funciona pasando la proteína
través de poros en la matriz, las proteínas más grandes tienen
que ir alrededor de los poros para pasar, por lo que tienen
menos volumen por el que pasar, mientras que las proteínas
pequeñas pueden pasar dentro de los poros, por lo que tienen
un mayor volumen por el que pasar, mientras mayor sea el
valor de la fracción, más volumen se está usando, por lo que
sabemos que nuestra proteína va a pasar primero, pues es
más grande que la que no nos interesa, lo confirmamos Figura 14. Propiedades de la purificación después de filtrar en
sacando la actividad enzimática de nuestra proteína (Figura gel.
12).

Figura 15. Electroforesis PAGE en dos dimensiones de la
mezcla después de haber separado las dos proteínas
restantes.
Figura 16. Electroforesis PAGE en una una dimensión.
Fracción extraída. Proteína purificada.
Discusión de resultados
La fase estacionaria utilizada para el primer método (
cromatografía de intercambio iónico) para la purificación de
nuestra mezcla sencilla de tres proteínas, es una matriz inerte,
las matrices a menudo tienen un grupo funcional adjunto para
facilitar la interacción de proteínas, utilizada para separar
proteínas. En este caso Q-Sepharosa es una resina fuerte
intercambiador de aniones. La elección de la fase estacionaria
y el grupo funcional depende tanto del tipo de cromatografía
que se realiza como del método por el cual se llevará a cabo.
El disolvente a utilizar es el buffer ajustado a pH 7.0, pues las
proteínas con mayor pH a ese, están protonadas, mientras
que la que tiene uno menor, está cargada negativamente, lo
cual nos permite saber que las fracciones con la proteína
cargada negativa, se pega en la matriz. Se recogen las
muestras de elución una vez, la paso por la columna.
Alternativamente, el pH del tampón se puede ajustar para que
la proteína de interés no se una a la fase estacionaria de
intercambio iónico mientras que las proteínas contaminantes
sí (en este caso, el pH de 7.0 es suficiente) y la proteína de
interés se recoge en el flujo, mientras que una proteína
contaminantes se elimina al unirse a la fase estacionaria.
Para determinar la cantidad relativa de una proteína específica
(en este caso la proteína 1) a la proteína total en una muestra.
Las fracciones que contienen la proteína de interés deben
determinarse después de cada paso antes de proceder al
siguiente paso en el esquema de purificación.
Una mezcla de ahora dos proteínas de radios hidrodinámicos
variables se carga en una columna de exclusión por tamaño
(Sphadex G-100). La proteínas grande eluye primero, ya que
no puede entrar en los poros de la matriz y tiene un camino
directo a través de la columna, está proteína, es la de interés,
mientras que la proteína más pequeña puede ingresar a los
poros, tener una ruta más enrevesada y, por lo tanto, demorar
más en atravesar la matriz y eluirse de la columna.
Conclusión.
El procedimiento de purificación de una proteína que requiere
menos pasos con diferentes métodos para la eliminación de
contaminantes de una muestra problema obtiene mejor
rendimiento de purificación, así como mayor cantidad de
proteína purificada, pues al ser necesarios más pasos para
lograr purificar una proteína de interés, por lo que el
enriquecimiento aumenta y el costo del procedimiento
también, es de esta forma que conocer las propiedades de la
proteína que se busca purificar, nos permite elegir los métodos
adecuados para una purificación eficiente. En este caso, fue
beneficioso que la muestra era pequeña, lo que facilitó la
separación de las proteínas contaminantes, y evito que se
hiciesen muchos pasos para la purificación.
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