Práctica 7:

CURSO:
BIOQUÍMICA
GENERAL

ENZIMAS DE OXIDOREDUCCIÓN
- DETERMINACIÓN DE LA RESPIRACIÓN
CELULAR MEDIANTE EL MÉTODO
MANOMÉTRICO

Mg. P. Woll, Dr. J. Solis, Mg. E. Rodríguez y Mg. C. Pantigoso

Curso: Bioquímica General 2021-1 Práctica 7: Enzimas de Oxidorreducción. Determinación de la
respiración celular mediante el método manométrico.

I. MARCO TEÓRICO
Las enzimas oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir,
transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción
general:

Oxidación de un metabolito catalizada por una

oxidasa (A) formando H2O, (B) formando H2O2.

Ejemplos de enzimas DE ÓXIDO

REDUCCIÓN son: La Succinato
deshidrogenasa y La Citocromo oxidasa
https://youtu.be/xdupto7ZyFY
(duración: 5.20 min)
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respiración celular mediante el método manométrico.

1.1.ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA

La Succinato deshidrogenasa
denominada también Succinato:
quinona oxidoreductasa (SQR) o
Complejo II.
Es un complejo enzimático unido a
la membrana mitocondrial interna.
Es la única enzima que participa
tanto en el ciclo del ácido cítrico
(ciclo de Krebs) como en la cadena
transportadora de electrones.
En el 8vo.paso del ciclo del ácido
cítrico, la enzima cataliza la
oxidación de succinato a fumarato
con la reducción de ubiquinona (Q)
a ubiquinol (QH2).
Estas reacciones acopladas suceden
en la matriz mitocondrial y en la
membrana mitocondrial interna.
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1.2. ENZIMA CITOCROMO OXIDASA

La citocromo c oxidasa o complejo
IV, es el eslabón final de la cadena
transportadora de electrones en la
membrana mitocondrial interna,
que recibe electrones del citocromo
c reducido (4 citcred) y los transfiere
al oxígeno molecular (O2), aceptor
electrónico final, que se reduce
formando agua. La reacción
catalizada por la citocromo c
oxidasa es como sigue:
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FUNDAMENTO
El complejo IV (Citrocromo Oxidasa,
COX) , está formado por varias
subunidades proteicas que contienen
los grupos prostéticos que intervienen
en el transporte de electrones: dos
grupos hemo (llamados citocromos a y
a3) y 2 núcleos que contienen iones
Cu2+ (centros CuA y CuB). Los
electrones se transportan de uno en
uno hasta acumular 4e-, en el último
centro redox (formado por cit a3, centro
CuB y un residuo de tirosina); entonces
pueden cederse a una molécula de
oxígeno.
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INHIBIDORES DE LAS ENZIMAS SUCCINATO DH Y DE LA CITOC.OXIDASA

La Succinato deshidrogenasa es una enzima que conforma el Complejo II, y
es inhibida por Malonato, este es un inhibidor competitivo de la reacción de la
SDH y bloquea la transformación del Succinato a Fumarato. Este inhibidor
bloquea el flujo de metabolitos a través del ciclo deteniendo en forma total la
oxidación del piruvato .
La Citocromo oxidasa es sensible a la presencia de aceptores electrónicos
más fuertes como el cianuro, azida y monóxido de carbono, entre otros, los
cuales inhiben irreversiblemente este complejo enzimático y se interrumpe el
transporte de electrones produciéndose una cianosis celular.
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respiración celular mediante el método manométrico.

1.3. EVALUACIÓN DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS

A. ¿CÓMO DEMOSTRAMOS LA ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO-DH?

AH A + e- + H+
Reducida Oxidada

FAD+ FADH2

Gana: 2e-, 2 H+

Azul de Metileno Oxidado (Azul) Azul de Metileno Reducido

(Incoloro)

El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un

colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado
redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa.
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REACCION DE OXIDO REDUCCION DE AZUL DE METILENO: es reversible

Reducción

Reversible

Oxidacion (+O2)
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B. ¿CÓMO DEMOSTRAMOS LA ACTIVIDAD DE CITOCROMO OXIDASA

IN VITRO: La actividad de la enzima puede demostrarse mediante la oxidación de
sustancias como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de
citocromos. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente
originando mezclas de pigmentos oscuros.

CIANURO : inhibe el
complejo citocromo c
oxidasa, bloqueando la cadena
transportadora de electrones,
sistema central del proceso
de respiración celular

2H+

pFDH2 p-fenilendiimina
(beige) (café oscuro)
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respiración celular mediante el método manométrico

1.4. DETERMINACIÓN DE LA RESPIRACIÓN CELULAR MEDIANTE EL MÉTODO

MANOMÉTRICO
La respiración puede ser definida como el intercambio gaseoso entre la célula o un
organismo multicelular y el medio que lo rodea.
Lavoisier (1780): Compara la respiración con una “combustión lenta”
Bert (1870): Prueba que las oxidaciones respiratorias se desarrollaban en los tejidos
y no en los pulmones, al observar en un manómetro que el diseñó, la absorción de
oxígeno y la eliminación de dióxido de carbono en un fragmento de músculo vivo
colocado en contacto con el aire.
Actualmente: Concepto de oxidación respiratoria: No es una oxidación simple y
directa, esta consiste de una serie de reacciones complejas que se realizan en las
membranas de las mitocondrias y cuyo resultante es la oxidación.
Actualmente se miden los intercambios gaseosos en los tejidos o en los
homogenizados de tejido y el aire en el aparato de Warburg, que se basa en un
recipiente donde se coloca el tejido o el homogenizado que tiene una copita donde se
coloca el hidróxido de potasio, que atrapa el CO2 liberado por las células. El recipiente
está conectado a un manómetro de aire libre, relleno con líquido que permite medir el
consumo de oxígeno.
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respiración celular mediante el método manométrico

FUNDAMENTO DEL RESPIRÓMETRO DE WARBURG

El Erlenmeyer está conectado

a un manómetro de aire libre,
relleno con un líquido
coloreado que permite medir
el consumo de oxígeno basado
en la distancia desplazada por
el líquido en el tiempo.

Este desplazamiento del

líquido coloreado es causado
por la diferencia de presiones
entre el interior del frasco y la
atmósfera . En el interior del
Erlenmeyer disminuye la
presión del oxígeno.
 PARTE EXPERIMENTAL
1.5. OBJETIVOS

1.5.1. Demostrar la actividad de la enzima de óxido reducción

succinato deshidrogenasa mediante el uso de un aceptor artificial
de electrones.

1.5.2. Evidenciar la actividad de la enzima de óxido reducción

citocromo c oxidasa empleando un donante artificial de
electrones.

1.5.3. Evaluar la respiración celular realizada por las mitocondrias

en las células de hígado de pollo midiendo el consumo de oxígeno en
un respirómetro.
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respiración celular mediante el método manométrico

EXPERIENCIA 1: El azul de metileno como aceptor de electrones.

Reacción Redox con Azul de Metileno y Glucosa

EXPERIMENTO DE LA BOTELLA AZUL (1.40 min)

https://www.youtube.com/watch?v=zfUDsxD4ZhY
Observe:
La superficie se mantiene azul por que se
mantiene en contacto con el oxígeno del aire
(estado oxidado).
Cuando se remueve o quita el oxígeno del aire la
superficie se queda totalmente incolora, en un
estado reducido.

¿Y que pasa cuando se adiciona CO2 para

desplazar el aire?:
https://www.youtube.com/watch?v=zfUDsxD4ZhY
(2.00-3.18 min)
El CO2 pesa más que el aire y se debe sacar por
soplido para ver cambios de redox con azul de
metileno.
VIDEO 2:
Reacción Redox con los cambios REDOX Azul de Metileno
EXPERIMENTO DE LA BOTELLA AZUL y AZUCARES (5.09min)
https://www.youtube.com/watch?v=xEgDFrf-Pho
 ¿Qué sucede en la botella azul?
a) Qué se forma en la primera etapa?
b) Cómo se llega hasta la reducción del azul de metileno?

- Se sabe que en la primera etapa se forma enolato a partir de la

glucosa.
- La glucosa se oxida hasta ácido glucónico, y como se encuentra
en solución alcalina se forma gluconato de sodio.
- Entonces el azul de metileno queda reducido hasta azul de
leucometileno que es incoloro.
EXPERIENCIA 2:
ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

EXPERIMENTO 2a: Determinación de reacción Redox

MATERIALES

• Dos tubos de ensayos

• Baño María a 50°C
• Pipetas de 5ml

REACTIVOS

- NaOH 10%
- Acido Succínico 3% neutralizado con NaOH 10% hasta pH 7.4
- Azul de metileno 0,1%
- Fenol 90%
- Aceite mineral
- Hígado de pollo
HOMOGENIZADO DE HIGADO ( al 10% en Buffer fosfato 0,1M pH 7.4 )

HOMOGENIZADO
PARA TRABAJAR
EXPERIMENTO 2a: ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA
• Procedimiento

2 1 1 2
Fenol (1ml)
AM (2 gotas) AM(2 gotas)
2 Aceite Aceite
(0.5ml) (0.5ml)

10 minutos a 50°C
EXPERIMENTO : ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA
• Reactivos:
• Azul de metileno.- Tiene la función de ser el aceptor de electrones del complejo
succinato-FADH2
• Ácido Succinico.- Tiene la función de agente reductor , es decir cede electrones
al azul de metileno, que pasa a estado oxidado.
• Aceite mineral- Tiene la función de aislar el tubo del aire del ambiente y así
prevenir la oxidación temprana del FADH2.
• Fenol.- Inhibe la actividad de las enzimas ya que desnaturaliza las proteínas.
• Hígado : Contiene las enzimas, como la muestra objetivo.

Conclusiones
• En la práctica, se utilizó tejido hepático debido a la gran cantidad de
enzimas que contiene proporcionando una alta actividad metabólica .
(El Azul de metileno es el aceptor artificial de los electrones por lo que se
reduce y pierde su color, infiriendo por ello la actividad de la enzima
deshidrogenasa succinica).
EXPERIMENTO 2b:
ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

Preparar 4 tubos de
acuerdo al siguiente Succinato
Buffer Malonato
esquema:
de
pH 7.4 sodio Agua
potasio

Tubo
Soluciones 1 2 3 4
mL Succinato de potasio 0.1 M 0.9 0.9 0.9 0.9
mL Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 1.0 1.0 1.0 1.0
mL Azul de metileno 1mg % 0.5 0.5 0.5 0.5
mL Malonato de sodio 0.3 M --- --- --- 0.15
mL Agua destilada 1.6 1.1 1.1 0.95

Agitar los tubos suavemente

 1 2 3 4

Tubo

Soluciones 1 2 3 4
mL Succinato de potasio 0.1 M 0.9 0.9 0.9 0.9
mL Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 1.0 1.0 1.0 1.0
mL Azul de metileno 1mg % 0.5 0.5 0.5 0.5
mL Malonato de sodio 0.3 M --- --- --- 0.15
mL Agua destilada 1.6 1.1 1.1 0.95

Agitar todos los tubos suavemente

mL homogenizado de hígado al 10% --- 0.5 0.5 0.5

Aceite mineral (5 gotas ) ----- ----- si si

Dejar a temperatura ambiente y anotar cada 5 minutos por 20 minutos los cambios
que se producen. Después de ese tiempo solamente agitar el tubo 2.
3 4 3 4
La temperatura y el tiempo juegan un papel importante para saber la
velocidad con la que ocurre la reacción .

Según la cantidad de enzimas que se encuentre en el tejido será

la reacción
Resultados

TUBO 1 2 3 4
Inicial ++++ ++++ ++++ ++++
5min ++++ +++ +++ ++++
10min ++++ +++ ++ +++
15min ++++ ++ + +++
20min ++++ + + +++
AGITACION
+++
Tubo 1 “blanco” tiene un
color azul que no varia ,( ?)

https://www.youtube.com/watch?v=QZYO-4uRrgg
(desde el minuto: 23:52 hasta elminuto: 33.48)
RESULTADOS

Tubo 2 Tiene todo para evidenciar la actividad de la enzima, el tubo se decolorará es

decir el aceptor artificial de electrones ( AM) se reduce por que gana electrones
provenientes del FADH2 a pesar que hay oxigeno en el medio. pero si agitamos el
tubo vuelve a retomar el color azul, es decir se reoxida el AM.

Tubo 3 El tubo se decolora, eso implica actividad de la enzima que lleva a que el
indicador de oxido reducción ( AM) se reduzca y pase a estado de leucometileno

Tubo 4 . NO hay reducción de AM, debido a que la enzima esta inhibida por la
presencia del malonato.
El 2,6 dicloro indofenol es un indicador redox que es incoloro en forma reducida y
azul en su forma oxidada. Por lo tanto, en presencia de vitamina C (ácido ascórbico) se
reduce, decolorándose.
 EXPERIENCIA 3:
ACTIVIDAD DE CITOCROMO OXIDASA
Seguimiento de la actividad de la enzima Citocromo oxidasa:
Se rotulan 4 tubos ( B,1 ,2,3,4), con la finalidad de demostrar que el Cianuro
es un fuerte inhibidor del Complejo IV.
Reactivos B 1 2 3
Buffer fosfato pH4 1.0 1.0 1.0 1.0
Malonato de sodio 0.3M 0.0 0.0 0.0 1.0
Cianuro de potasio 0.05M 0.0 0.0 1.0 0.0
Agua destilada 2.0 1.0 0.0 0.0
Extracto enzimático 1.0 1.0 1.0 1.0
p-fenilendiamino 1% 0.0 1.0 1.0 1.0
 + - +

https://www.youtube.com/watch?v=QZYO-4uRrgg
(desde 1.0 min hasta 10.2 min)
 Experiencia 4: DETERMINACIÓN DE LA RESPIRACIÓN
CELULAR MEDIANTE EL MÉTODO MANOMÉTRICO
En esta experiencia, emplearemos dos aparatos de Warburg modificados en los cuales se
colocará:

Materiales Respirómetro
Frasco N.º 1 2
mL. Solución de Potter pH 7.4 3.0 3.0
mL. Succinato de Potasio 0.5 M --- 0.3
mL. Agua destilada 1.0 0.7
mL. homogenizado 0.5 0.5

• Una vez agregado el homogenizado a los frascos, colocar en la mitad del frasco un
tapón de algodón.
• Encima del tapón de algodón colocar de seis a diez granos de KOH granulado.
• Luego se tapan los tubos con un tapón de jebe el cual es atravesado por un
manómetro.
Resultados:
Frasco 1. Desplazamiento de liquido Brodie ( +)

Frasco 2. Desplazamiento líquido de Brodie (++++)

Demostración de la respiración celular mediante experimento

usando un manómetro

https://www.youtube.com/watch?v=R
RRzC1yohHY (video 10.0 min)
CONCLUSIONES :
En la respiración no sólo se consume oxígeno sino que se libera CO2.
El CO2 (gas), es atrapado por el KOH en el interior del tubo
convirtiéndolo en carbonato de potasio (sólido) y así de esta manera se
origina un vacío en el frasco (presión negativa), que es proporcional al
oxígeno usado, este vacío desplaza el líquido del manómetro.
Este desplazamiento nos permite medir el consumo de oxígeno.
Se calcula el consumo de oxígeno en mm3 considerando que el diámetro
interno del tubo del manómetro mide 1 mm.
 Preguntas ??

Muchísimas gracias…….

REFERENCIAS:
− CHANCE, B. Techniques for the assay of respiratory enzymes. En “Methods in Enzymology” Volumen 4 (Editado
por S.P. Collowick y N.O. Kaplan). Academic Press; pp. 273-329 New York 1957.
− HARPER. 2012. Bioquímica ilustrada. Editor: Murray R. y colaboradores. Edit. McGraw Hill. 29a Edic.
− HOLLOSZY, J. Biochemical adaptations in muscle. Effects in Mitochondrial Oxigen Uptake and Respiratory
Enzyme Activity in Skeletal Muscle. JBC, Vol. 242, Nº 9, pp. 2278- 2282, 1987.
− VINCENT, P. El cuerpo humano. Editorial Reverté, pp. 243-245,1981.