Deshidrogenasa succínica del hígado

1.
Levi Patterson 1-745-849 2. Tifanny Navarro 4-781-2352
3.
Gabriela Rodríguez 4-799-2349
Bioquímica (Qm.235), Escuela De Tecnología Médica,
Facultad De Ciencias Naturales Y Exactas,
Universidad Autónoma De Chiriquí.
David, Chiriquí, Republica De Panamá.
Email: 1. levipatterson28@gmail.com 2 .tifannydalet@gmail.com
3.
gabyroqui1998@gmail.com

Resumen:
El objetivo de este laboratorio determinar detectar la actividad enzimática de la deshidrogenasa
succínica utilizando el extracto del hígado. para la catálisis del sustrato, se realizaron 6 pruebas por
indicadores los cuales van a cumplir una función de aceptar electrones artificiales como el azul de
metileno. la cantidad de sustrato y agua vario para comprobar la efectividad de la enzima en una
cantidad considerable, cuando no había sustrato, cuando esta fue desnaturalizada y cuando se le
aplicaron los inhibidores artificiales que fueron el malonato de sodio, azida y el cianuro de sodio. al
final se compararon los resultados determinándose a veces la reacción de los inhibidores no
resultan del todo efectivas según la cantidad de sustrato y de la enzima presente para inhibir.
También se determinó que la reacción fue más eficiente la que tenía las cantidades similares de
sustrato, enzima y agua; mientras que los menos eficientes fueron con inhibidores fuertes los cuales
interfirieron con la función de la enzima donde el inhibidor más efectivo fue el malonato de sodio,
con esto logramos entender la importancia de tener un ambiente en las condiciones adecuadas
para que las enzimas realicen de forma efectiva su actividad catalítica en el organismo.
Palabras claves: Redox, Sustrato, Actividad Enzimática, Indicador, Homogenizado, Inhibidor.
Objetivos: sustancias de color azul en su forma oxidada,
que al aceptar átomos de hidrógenos del
 Detectar la actividad enzimática de la
sustrato, originan la forma leuco, la cual es
deshidrogenasa succinica en extractos de
incolora. con este cambio de color del
hígado utilizando indicadores redox como
indicador redox se comprueba que la enzima
aceptores artificiales de electrones está transformando el sustrato.
 Establecer que sustancias pueden actuar
como inhibidores de la deshidrogenasa Materiales y Reactivos:
succínica.
Descripcion capacidad cantidad
Marco teórico: Vasos 100 y 250 ml 3
químicos
La deshidrogenasa succínica es una enzima Licuadora 1
especial de la mitocondria, porque participa en Tubos de - 6
dos procesos metabólicos a la vez, el iclo de ensayo
Krebs y la cadena de transporte electrónico.
El 2,6 diclorofenolindofenol (DICIPIP) y el azul
de metileno resultan ser indicadores redox
apropiados para funcionar como aceptores
artificiales de electrones y establecer la
actividad de la deshidrogenasa succínica en
los homogenizados de los tejidos. Se trata de
Nom Form Prop. físicas Toxicidad Metodología
bre ula y quimicas
cortar trozos pequeños del
higado y proceder a licuarlos
Fosfa (NaH2 Sólido, polvo Irritaciones en con 100 ml de agua hasta
to PO4) cristalino son la nariz en la obtener el extracto
mono olor. p.e: piel
básic 200°C. pF
o de 100°C
sodio
Hidro NaOH Masa Puede causar luego se toman 40 ml del
xido molar: 39.997 daños graves, homogenizado y se diluyen
de g/mol permanentes hasta 200 ml con agua
destilada
sodio Densidad: 2.1 al sistema
3 g/cm³ gastrointestinal.
S0líquido, 1 Irritación con
bar: 75.91 pequeñas
J·mol-1·K-1 exposiciones se agita la mezcla
vigorosamente y la preparacion
Azul C16H18 Densidad: 1.75 resultante se emplea en las
de ClN3S 7 g/cm³ diferentes pruebas
metil Punto de
eno fusión: 100 °C
Punto de al homogenizado del tubo 3 se
ebullición: Se calentara previamente a una
descompone temperatura de 52 °C, por espacio
de 15 minutos
Malo C7H12 Masa Irritante en altas
nato O4 molar: 160.17 concr¿entracio
de g/mol nes
sodio Densidad: 1.0 se agitan todos los tubos y se
colocan en baño maria a una
5 g/cm³
teperatura de 37 °C por un tiempo
Punto de de 30 minutos.
ebullición: 19
9 °C
Solubilidad
en
observar en que tiempo
agua: despre desaparece el color de los tubos ,
ciable centrifugar y decantar el liquido y
observar los cambios en cada tubo
Resultados Cuadro # 2 Orden de agregado de reactivos a
cada uno de los tubos
Cuadro #1 Preparación de soluciones
Solución Fosfato monobásico de sodio Solución Tubos
Amortiguadora 0.1M Se disuelve 1.38g Orden de 1 2 3 4 5 6
100ml de H2O y se ajustó el Rect
𝑝𝐻 A 7.4 mediante la adición A ml de 0.5 0.5 0. 0. 0. 0.5
de hidróxido de sodio 0.1N. amortig 5 5 5
uador
Solución De Previamente preparado
Azul De B ml de 0.0 0.5 0. 0. 0. 0.5
Metileno Al sustrato 5 5 5
0.02%

Solución De 𝑔 C ml de 1.0 0.5 0. 0. 0. 0.0

𝑔
Malonato De = 0.1𝑀 𝑋 0.025𝐿 𝑋 160.17𝑚𝑜𝑙 agua 5 0 0
Sodio 0.1M = 0.4004g que hay que pesar destilad
para preparar malonato de a
sodio 0.1M en un volumen de D ml de 1.0 1.0 1. 1. 1. 1.0
25ml. homoge 0 0 0
𝑔
Solución De g=0.1𝑀 𝑋 0.025𝐿 𝑋 160.17𝑚𝑜𝑙 nizado
Succinato De de
Sodio hígado
Solución de 𝑔 E Azul de 1.0 1.0 1. 1. 1. 1.0
𝑔
azida de sodio = 0.1𝑀 𝑋 0.025𝐿 𝑋 160.17𝑚𝑜𝑙 metilen 0 0 0
0 .1M o
Solución de 𝑔 Indicad
𝑔
cianuro de = 0.1𝑀 𝑋 0.025𝐿 𝑋 160.17𝑚𝑜𝑙 or
sodio 0.1M F ml - - - 0. - -
Homogenizado malonat 5
de hígado o de
sodio
G ml de - - - - 0. -
azida 5
H ml de - - - - - 0.5
cianuro
Cuadro #3 Contraste De Resultados
Procesos Observacione Cuadro #4 Tubo control #1
s
Agregados todos
los reactivos
previo al
calentamiento en
el tubo #1 se
observa 2 fases
Tubo #2 de igual
manera se
observan dos
fases
Tubo# 3 se Antes de Luego de Luego de
realizó aparte por calentar calentar centrifugar
requerimientos
especiales
Tubos luego de Cuadro #5 Tubo #2
calentados por
30 minutos
En el tubo #1 no
hubo cambio
cambio de
coloración en el
tubo #2 después
de 7 minutos se
observó un
cambio de color y
se formó un
sobrenadante en
#3, #6 no se Antes de Luego de Luego de
observó ningún calentar calentar centrifugar
cambio de
coloración y en
el #4 y #5 se Cuadro #6 tubo 3
observa
claramente un
sobrenadante en
el fondo.

Tubo #1 y #6 sin
formación de
precipitado
Tubo #2
2 3 4 precipitado Antes de Luego de Luego de
5 6
Tubo #3 agregar la añadir la centrifugar
precipitado color enzima enzima
oscuro calentada sometida a
Tubo #4 gran temperatura
precipitado elevada
Tubo #5 gran
cantidad de
precipitado
 Cuadro #8 tubo #5 Agregado Azida
Cuadro #7 tubo #4 Agregado malonato

Antes de Luego de Luego de

calentar calentar centrifugar
Antes de Luego de Luego de
calentar calentar centrifugar
Cuadro #9 tubo #6 Agregado cianuro de sodio

Antes de calentar Luego de Luego de

calentar centrifugar
Cuadro#10 efectividad después del
calentamiento

Inhibidor Tub Efectividad Observaciones

o
Malonat 4 Efectivo Azul oscuro
o
Ilustración 1 Como actúa el inhibidor de Azida 5 Parcialmen Azul
malonato te efectivo
cianuro 6 No efectivo No hubo
cambio de
color

Ilustración 2 Mecanismo Del Succinato

Deshidrogenasa

Ilustración 3 color del precipitado luego de

calentar diferencia y efectividad del inhibidor
Cuadro#11 observaciones de precipitado luego
de centrifugar
Inhibido T Efectivida Observaciones
r u d resultado donde podemos ver el contraste de
b las reacciones a medida que pasa el tiempo y
o que va realizando su función de inhibición. Lo
Malonat 4 Efectivo
o
Azul oscuro
Azida 5 Parcialme
nte
efectivo
Azul claro
cianuro 6 No No hubo cambio de
efectivo color
Discusión
Durante esta experiencia pusimos aprueba la
reacción de deshidrogenasa ante la presencia
o ausencia de diferentes efectores que
puedan alterar su función catalítica y por ende
la fisiológica que realizan para mantener
nuestro organismo en equilibrio. Iniciamos
preparando en el tubo #1 que podemos
observar en el cuadro de resultados #4
agregamos lo indicado en el cuadro #2 donde
se presenta las indicaciones a realizar con el
fin de que este primer tubo nos sirva de control
y comparación con los demás a los cuales les
variamos los diferentes efectores que pueden
afectar el funcionamiento óptimo de nuestra
enzima en estudio. Por lo que en este tubo no
se observó reacción ya que no contenía
sustrato por lo que no hubo inhibición. De esta
forma no pudo realizar su conversión de
succinato a fumarato. Por otro lado en el tubo
# 2 pudimos observar posterior al haber
mantenido una temperatura de 37° la cual es
la temperatura óptima para su funcionamiento
pasados 7 minutos se observó un
sobrenadante en el fondo del tubo con una de
coloración lo que nos confirma que si se dio la
catálisis enzimática efectivamente como se
puede apreciar en el cuadro #5 de los
que quiere decir que succinato
deshidrogenada pudo realizar la
conversión de succinato a fumarato según sus
funciones habituales en nuestro organismo
Según (Walla, 2000), esto se logra
removiendo 2H+ y 2 electrones del succinato
para formar fumarato y la coenzima reducida
(FADH2), en este caso la enzima
deshidrogenada succínica reduce al azul de
metileno, ya que este actúa como aceptor y el
azul de metileno reducido es
incoloro. Continuamos nuestra experiencia
esta vez con el efector que naturalmente
afecta las enzimas por su origen proteico es la
temperatura por ende durante esta prueba
sometimos a la enzima a una temperatura por
encima de la que puede soportar por lo cual
se va a desnaturalizar por consiguiente pierde
su actividad catalítica y como se pudo
observar la reacción no se dio por efectos de
la temperatura
a temperatura de 55 °C por lo que podemos
confirmar que un aumento de la temperatura
provoca la desnaturalización de la
enzima deshidrogenasa la cual trabaja
óptimamente a 37 °C. Se utiliza azul de
metileno
porque es un indicador redox apropiado para
estas funcione. Se trata de una sustancia de
color azul en su forma oxidada, que al
aparecer
átomos de hidrógenos del sustrato originan la
forma leuco, la cual es incolora (Vázquez M.
2002). Posteriormente probamos con otros
efectores esta vez inhibidores químicos. “El
Malonato es una Molécula con estructura
similar a la del succinato que se emplea para
inhibir de forma competitiva la enzima
succinato deshidrogenasa” según (Miranda
K. 2018). Por lo que En el tubo 4 agregamos
0.5 de malonato se pudo observar la
formación de un precipitado por lo nos
confirma que el malonato es un inhibidor
competitivo del succinato. En la reacción de
fosforilación oxidativa, el malonato es un
inhibidor del complejo II que, nuevamente,
contiene succinato deshidrogenasa. El
malonato es un inhibidor competitivo de la
deshidrogenasa succínica, de tal manera que
la presencia de malonato detiene el ciclo de
Krebs. La reacción que cataliza la enzima es
la de deshidrogenar al succinato para producir
fumarato y FADH2. Detener el ciclo de Krebs
implica parar la cadena respiratoria y por lo
tanto la maquinaria de producción de ATP.
Cuando
ocurre la
inhibición
de una
enzima
que se
Ilustración 4 El malonato es una
encuentra
sustancia análoga con el ácido succínica
dentro de
una
determinada vía metabólica, el sustrato de la
enzima tiende a acumularse, ya que no puede
ser transformado en un producto,
(Gonzales,R. 2011). Mientras que en el tubo
5 una formación de precipitado nos confirma
una inhibición por. La azida esta sustancia
química afecta a la cadena respiratoria. Son
substancias que se enlazan a alguno de los
componentes de la cadena de transporte de
electrones bloqueando su capacidad para
cambiar de una forma reversible desde la
forma oxidada a la forma reducida y viceversa.
Esta inhibición resulta en una acumulación de
los componentes en sus formas reducidas
antes del punto de inhibición, y la presencia de
las formas oxidadas de los componentes de la
Cadena de Transporte de Electrones después
del punto de inhibición. Y por último en el tubo
6 se observó que no hubo una decoloración
por lo tanto no hubo actividad inhibidora en el
tiempo estipulado. Sin embargo el cianuro es
un inhibidor más efectivo según (Miranda K.
2018). Se puede deducir que no hubo una
actividad inhibidora debido a que no se le dejo
reaccionar por más tiempo. La función del
cianuro como inhibidor es actuar sobre el
Hemo de la citocromooxidasa impidiendo su
interacción con el oxígeno.
Conclusiones:
 Logramos observar mediante diferentes
pruebas la actividad enzimática en la
deshidrogenasa succínica.
 Reafirmamos que las enzimas por ser de
origen proteico al enfrentar condiciones
fuera de lo habitual como el cambio brusco
de temperatura interfiere de forma directa
con la actividad catalítica que realiza y que
en presencia de presencia de sustancias
inhibidoras como el malonato, azida y
cianuro de sodio. También su actividad
enzimática se ve perjudicada.
 Pudimos apreciar cómo se da la velocidad
de reacción en una enzima en condiciones
óptimas vs una sometida a cambios o en
presencia de inhibidores competitivos
como lo es el malonato el cual fue
evidenciada observando la reacción de
oxidación del azul de metileno y la
deshidrogenasa succínica.
Bibliografía
 Alvarado, S. (2013). Bioquímica II.
Recuperado
el 7 de noviembre de 2017 de
http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.co
m.mx/
media/users/10/523320/files/51871/Ma.
 Gonzales.R. (2011). Clasificación de las
enzimas. Recuperado el 7 de noviembre
de básicos/indicador-redox.
 Vázquez M. 2002).
Collen S. & Lieberman, M.
BIOQUIMICA BASICA. Un enfoque clínico.
España: Mcgraw-hills. Interamericana.
 Sierra, K. (2013). Actividad enzimática.
Recuperado el 7 de noviembre de 2017 de
http://www.medicina.uat.edu.mx/bioquimic
a/enzimas/Enzimas_y_coenzimas2.html
 (Miranda K. 2018). Bioquímica. México:
Ed. Reverté.-Walla, M. Marchuk, D.
Activated enzymatic: Identificacion de alfa-
amilasa salival.2aed. España: Lancet