Fraccionamiento

Celular
Informe Nº V

Integrantes: Jeremy Carreño

Pedro Gómez
Valentina Schalchli
Belén Valdenegro
Tecnología Médica
NRC: 1518
 Introducción
Alrededor de 1500 años después de la aparición de células procariontes estas evolucionan
convirtiéndose en células eucariontes, dando pie a nuevos procesos evolutivos.
La estructura morfológica de estas células evoluciona mostrando un sistema mas complejo,
presentando organelos membranosos (Megías et al., 2009)
Entre estos organelos encontramos, siendo el más importante al núcleo, que se encuentra
delimitado por envoltura nuclear, este organelo corresponde al centro de control de la célula
eucarionte y casi todo el ARN que se encuentra dentro de él. (Vásquez y Muñetón et al.
2006). También, dentro del citosol existen más organelos como; cloroplastos, mitocondrias,
peroxisomas, lisosomas, ribosomas, retículo plasmático, aparato de Golgi y citoesqueleto.
Las macromoléculas y organelos pueden ser separados unos de otros, mediante técnicas
adecuadas para ser estudiados, el fraccionamiento Subcelular es una de las técnicas que más
es usada para ello, para ello se deben llevar a cabo ciertos pasos, para empezar se debe
producir una rotura de la membrana plasmática ya sea por medios químicos o físicos, para
liberar sus componentes de la célula generando un lisado celular también llamado
homogenizado (Lodish et al, 2005) Luego, se centrifuga para fraccionar el homogenizado.
La centrifugación corresponde a una técnica que consiste en poner el lisado celular que se
encuentra en tubos de ensayo dentro de una centrifuga rotando a altas velocidades. Al
momento que se termina cada proceso de centrifugación se lograran identificar dos fases,
una corresponde al precipitado o pellet, que contiene componentes mas grandes y densos el
otro corresponde al sobrenadante, el cual corresponde a componentes mas pequeños y
menos densos (Alberts y Bray, et al 2006). Dentro del fraccionamiento Subcelular existen
diferentes etapas, siendo la primera la fracción nuclear que corresponde a un centrifugado a
baja velocidad, después, el sobrenadante de este fraccionamiento pasa a la centrifuga dando
origen a la fracción mitocondrial, que se obtiene a mayor velocidad en la centrifuga, se
repite este proceso varias veces, aumentando periódicamente la velocidad, y así obteniendo
diversos componentes celulares, que son, la fracción microsomal, ribosomal y citosólica
( Lodish, et al 2005).
Existen moléculas y enzimas que están exclusivamente en cada organelo, estando presentes
solo en los organelos correspondientes, estos reciben el nombre de marcadores moleculares,
permitiendo la identificación especifica, son usados para aislar y localizar genes que son de
interés (Alcántara, et al 2007). La presencia de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH)
es usada como indicador de presencia de mitocondrias, esta enzima cataliza la
deshidrogenasa del succinato a fumarato (Rúelos, et al, 1985).
 Objetivos

• Entender la base de la técnica del fraccionamiento celular generando un

homogenizado celular y a través del campo gravitacional que genera la centrifuga y
así producir el fraccionamiento de los organelos membranosos.

• Identificar las dos fases que son producidas luego realizar cada proceso en la
centrifuga.

• Observar en el microscopio las distintas fracciones celulares obtenidas en la

centrifugación y ver los organelos encontrados en cada una de ellas.

• Comprender el concepto de marcador molecular y aplicarlo en la identificación de

organelos.

• Asociar la enzima succinato deshidrogenasa como marcador molecular para

detección de mitocondrias, a la vez comprender la reacción y cómo funciona.
 Materiales y métodos

A) Homogenización de hígado de pollo: Un hígado de pollo se lleva a lavar 3 veces

con suero fisiológico frio para así eliminar todo resto de sangre. Luego se corta en
pequeños trozos y se le adiciona 100 ml de suero y se homogeniza utilizando la
ULTRA-TURRAX, así obteniendo un homogenizado total (HT). Se procede a
filtrar el HT a través de un embudo de vidrio y una gasa sobre el, dejando el
contenido filtrado en un vaso precipitado de 200 ml y manteniéndolo en hielo, así
obteniendo el Homogenizado Crudo (HC).
B) Fraccionamiento Subcelular: Se reparten 10 ml de HC a cada grupo y se reserva
1 ml de HC en un tubo de ensayo el cual se deja en hielo, los 9 ml restantes de HC
se llevan a centrifugar a 1000 RPM por 5 minutos a 4ºC, al terminar se obtendrá el
sobrenadante 1 y el pellet (fraccionamiento nuclear). Se transfiere el sobrenadante a
un tubo de ensayo para centrifugar a 6000 RPM por 20 mins así obteniendo el
sobrenadante 2 y el pellet 2 (fraccionamiento mitocondrial). Se guarda el pellet 2 y
se centrifuga el sobrenadante 2 a 6000RPM por 20 mins, pasado este tiempo se
obtiene el sobrenadante 3 (fraccionamiento microsomal) y se botaría el pellet.
C) Evaluación microscopia de fraccionamiento nuclear (FN): Utilizando el
fraccionamiento nuclear obtenido anteriormente, se preparan 2 portaobjetos. Al
primero se le agrega 1 gota de FN y una gota de suero fisiológico antes de colocar el
cubre objetos. Este se pasara por un microscopio óptico para ser observado con un
aumento de 40X los núcleos.
Al segundo se le agrega 1 gota de FN y una gota de azul de tripan antes de colocar
el cubre objetos, al igual que en el anterior, este será pasado por un microscopio
óptico para ser observado con un aumento de 40X los núcleos, esta vez se observan
los núcleos teñidos.
D) Detección de mitocondrias a través de reacción de SDH en las fracciones: Se
separan 5 tubos con las diferentes muestras preparadas a lo largo del laboratorio
(HC, FN, FM, FMit, FMit y Blanco), a cada uno de los tubos de ensayo se le agrega
1ml de agua estilada, 1ml de azul de metileno y 1ml de succinato 0,1. Los 5 tubos
de ensayo son agitados y sellados con 200uL de aceite vegetal o vaselina liquida sin
agitar, para luego ser llevados a un baño termorregulador a 37ºC por 5-10 min
pasado este tiempo se observa si ocurre algún tipo de decoloración (presencia de
mitocondria) o no (sin presencia de mitocondria)
 Resultados
Actividad 1: Fraccionamiento Subcelular

Dibujo N°: 1
Nombre: Pellet de fracción nuclear (FN)
Tipo de muestra: Temporal
Tinción: Azul de tripan
Aumento del objetivo: 40X
Aumento Total: 400X

Observaciones:
1) Se observan grupos de núcleos
2) Se observan núcleos de color morado mas
intenso
3) Se pueden diferenciar estructuras y células

Dibujo N°: 2
Nombre: Pellet de fracción nuclear (FN)
Tipo de muestra: Temporal
Tinción: Sin tinción
Aumento del objetivo: 40X
Aumento Total: 400 X

Observaciones:
1)Se observan estructuras y células pero NO
diferenciables.
2) Se observa un fondo de color café claro en
toda la muestra
3) Se logran observar círculos pequeños por
toda la muestra.
 ACTIVIDAD 2:Detección de mitocondrias a través de reacción SDH en las fracciones.
Tabla Nº2
TUBO Muestra Color de la Color de la Indique si la reacción es negativa
muestra antes muestra después o positiva y anote sus
de someterla a de someterla a observaciones
calor calor
1 blanco Azul Azul - El resultado es negativo ya que al
someterla al baño de agua caliente
este sigue manteniendo su color
original.
- Al no haber reacción de la enzima
SDH esto nos indicaría que no
están presentes las mitocondrias en
la célula.
2 Homogenizado Café Rojizo - La reacción es positiva ya que
crudo (HC) presenta un cambio de color.
- Esto indicaría la presencia de la
enzima SDH, Debido a esto se
puede decir que en la muestra se
encuentra la presencia de
mitocondrias.
3 Fracción Celeste Verdoso Celeste Verdoso - El resultado es negativo ya que el
Nuclear (FN) precipitado solo presenta núcleos,
Así que no presenta ningún
cambio.
- No hay presencia de mitocondrias
en la muestra.
4 Fracción Verde musgo Café claro - La reacción es positiva ya que
Mitocondrial presenta un cambio de color.
(FMit) - Esto indicaría la presencia de la
enzima SDH, Debido a esto se
puede decir que en la muestra se
encuentra la presencia de
mitocondrias.
5 Fracción Verde Verde - El resultado es negativo ya que al
Microsomal transparente transparente someterlo al baño termorregulador
(FMic) (agua) (agua) este sigue manteniendo su color
original.
- Al no haber reacción de la enzima
SDH, Esto indica que no hay
presencia de mitocondrias en la
muestra.
 Discusión:
1) La importancia biológica de la separación de componentes celulares:
El fraccionamiento celular nos permite aislar los componentes celulares de manera
precisa, este fraccionamiento da como resultado los distintos organelos separados
para luego ser estudiados cada uno de manera especifica. (Neil A. Biología. 2009).
En el laboratorio logramos separar los componentes celulares mediante el uso de
una centrifugadora la cual por medio de las densidades logra separar los
componentes de la célula, entrega el pellet el cual corresponde a una sedimentación
que ser deposita en el fondo del tubo y un sobrenadante que es menos denso se
encuentra sobre el pellet

2) Detección de nucleó con azul de tripan:

Por medio de la tinción se puede teñir microorganismos mediante distintos
colorantes que destaquen ciertas estructuras. (Introducción a al microbiologia.2007).
en nuestro caso, usamos azul de tripan que es usado para la marcación de núcleos,
este se une a ella cuando se encuentra ionizada y permite el reconociendo de
núcleos

3) Acción del azul de metileno en la acción del succinato:

El succinato de deshidrogenasa (SDH) es un complejo enzimático que es
participante en el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Esta enzima se acopla con
la oxidación del SDH a fumarte a la reducción de una molécula de ubiquinona, sin
la translocación a la matriz mitocondrial ( Joseph-Horne et al; 2001). Gracias a esta
enzima que se encuentra en la membrana interna de la mitocondria, se puede
identificar la presencia de mitocondrias en nuestras diferentes muestras resultantes
del fraccionamiento, estas toman una coloración gracias a la coloración del azul de
metileno.

4) Fracción nuclear con mitocondrias

La fracción nuclear debe estar compuesta por núcleos (Jeremy Mark Berg.
Bioquímica. 2007). En nuestra muestra podemos confirmar que en efecto solo hay
presencia de estos mismos organelos.
 Conclusión:
o La homogenización de la muestra se debe realizar en una perfecta medida o casi
perfecta de suero y de muestra, ya que al pasar por la ULTRA-TURRAX existe la
posibilidad de que no se homogenice por completo la muestra.

o La centrifugación permite obtener un fraccionamiento que consta de sobrenadante,

el cual seria mas ligero y de pellet, que seria la porción mas pesada.

o Si al momento de la homogenización no se rompen todos los núcleos, no se teñirán

por todos al añadir azul de tripan.

o La reacción del succinato en contacto con la enzima succinato deshidrogenasa

permite identificar la presencia de mitocondrias en las muestras ya que esta vuelve
incolora al azul de metileno, así la muestra vuelve a su color normal mostrando si es
positiva (presencia de mitocondria) o negativa (sin presencia de mitocondrias) en
los distintos casos.
 Bibliografía
• Alberts, B., & Bray, D. (2006). Introducción a la biología celular. Ed. Médica
Panamericana.
Alcántara, M. R. (2007). Breve revisión de los marcadores moleculares. Ecología
molecular. pp 541-566.
• Lodish, H. (2005). Biología celular y molecular. Ed. Médica Panamericana.
Megías, M et al. (2019). Atlas de histología vegetal y animal. La célula. Recuperado
el 3 de
mayo de 2022
• Ruelos, C. (1985). Actividad de succinato deshidrogenasa mitocondrial (CE 1.3.
99, 1) en hígado de ratas sometidos a la acción de hormonas sexuales. In Actividad
de succinato deshidrogenasa mitocondrial (CE 1.3. 99, 1) en hígado de ratas
sometidos a la acción de hormonas sexuales. pp 55.
• Vásquez, G., & Muñetón, C. M. (2006). El núcleo celular. Universidad de
Antioquia.
Neil A. Campbell, jane B. Reece, Biología.(2007). Editorial Médica Panamericana
S.A.
Séptima edición. Página 87.
• Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. Introducción a la
microbiología.(2007). Ed. Médica Panamericana. Novena edición. Página 68.
• Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko. Bioquímica.(2007.Editorial
Reverté . Sexta edición. Página 68