BIOLOGÍA CELULAR.

Guía de Práctica de
Laboratorio
ESCUELA DE MEDICINA.

Alumno: Silva Zapata Marycielo Soledad.

Semestre: 2022 - 0 Ciclo: 1

Grupo: A1P3 Turno: 10:20 - 12:00

Docente: MsC. DAVID GARCIA CEDRON

Trujillo – Perú

2022
 PRÁCTICA N° 06

Temática: Mitocondria y respiración celular.

Sesión: 09 Tiempo estimado de desarrollo: 03 horas. Fecha:

Capacidad:
Reconoce la mitocondria en observaciones de preparados histológicos, e identifica el proceso de fosforilación oxidativa, haciendo uso de las
TICs, ejerciendo un pensamiento crítico y reflexivo.

I. INTRODUCCIÓN.

Las mitocondrias son orgánulos que aparecen en prácticamente todas las células eucariotas. La morfología
de las mitocondrias es muy cambiante y puede variar desde largas estructuras ramificadas a pequeños
elipsoides. Se podría decir que no existen mitocondrias individuales sino una red muy dinámica de la cual se
pueden desgajar porciones. En red o aisladas, las mitocondrias están formadas por una membrana externa,
una membrana interna, un espacio intermembranoso y un espacio interno delimitado por la membrana
interna denominada matriz mitocondrial. La membrana mitocondrial externa es altamente permeable y
contiene muchas copias de una proteína denominada porina, la cual forma canales acuosos a través de la
bicapa lipídica.

En las mitocondrias se produce la mayor parte del ATP de las células eucariotas no fotosintéticas.
Metabolizan el acetil coenzima A mediante el ciclo enzimático del ácido cítrico, dando como productos al
CO2 y al NADH. Es el NADH el que cede electrones a una cadena de transportadores de electrones que se
encuentra en la membrana interna. Estos electrones pasan de un transportador a otro llegando como último
paso al O2, resultando H2O. Este transporte de electrones se acopla al transporte de protones desde la
matriz hasta el espacio intermembranoso. Es este gradiente de protones el que permite la síntesis de ATP
gracias a la ATP sintasa. Por unir fosfato al ADP y por usar el oxígeno como aceptor final de electrones, a
este proceso se le llama fosforilación oxidativa.

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 II. CONOCIMIENTOS PREVIOS.
- Medidas de bioseguridad.
- Mitocondria
- Fosforilación oxidativa
- Cadena de transporte de electrones.

III. MATERIALES.
- Mandil.
- Imagen de corte histológico de túbulos renales
- Video de la fosforilación oxidativa.
- Ordenador PC.
- Proyector multimedia.
- Guía de prácticas.

IV. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

4.1. PROCEDIMIENTO:

Reconocimiento de mitocondrias.

- Observar la imagen del corte histológico y reconocer las mitocondrias.

- Explicar las características de lo que se observa.

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 Imagen 1.

Imagen 1. Corte histológico de riñón.

Tinción: BENSLEY CAIN.

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 Las mitocondrias son acidófilas debido a sus proteínas a nivel de membrana y matriz. Por lo tanto, se van a teñir
de entre rojo a rosa, la intensidad del color dependerá también del mordiente aplicado.

LAS OBSERVACIONES DE ESTA IMAGEN SERÁN EXPLICADAS DETALLADAMENTE EN LA

INTERPRETACIÓN

Proceso de respiración celular.

- Reproducir la ANIMACIÓN:
- https://www.youtube.com/watch?v=RxhQJfgbHEQ
- RECONOCER LOS PROCESOS QUE SE OBSERVAN EN LA ANIMACIÓN.
- Glucólisis: Proceso realizado para la producción de energía a través de enzimas.

- Oxidación del Piruvato: Degradación de moléculas e intercambio de electrones.

- Ciclo del Ácido Cítrico: Interacción entre el compuesto oxalacetato con ayuda de reacciones redox-enzimáticas.

- Respiración Aeróbica: Interacción de la cadena transportadora de electrones, intervención de ATP sintasa para

el intercambio de moléculas e iones que a su vez hace posible la formación de ATP.

DICHOS PROCESOS SE EXPLICARÁN MÁS DETALLADAMENTE EN LA

INTERPRETACIÓN

- IDENTIFICAR LOS ELEMENTOS MOLECULARES QUE INTERVIENEN.

- Oxígeno

- Iones de Hidrogeno

- ATP

- ADP

- Piruvato

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 - Oxalacetato (4 moléculas de carbono).

- Moléculas de Carbono

- NAD +

- NADH

- FAD

- FADH2

- CoA (acetil-coenzima A).

- CO 2 (dióxido de carbono).

- ANALIZAR Y EXPLICAR EL MECANISMO MOLECULAR QUE OBSERVA.

- El proceso de respiración celular se divide en 4 fases las cuales son: la glucólisis, oxidación del piruvato,
ciclo del ácido cítrico y la respiración aeróbica.
- La glicólisis a su vez se subdivide en 2 etapas cuando hace un gasto de energía y generación de energía,
puesto que esta se encarga de disminuir el azúcar; consta de diez pasos en donde intervienen enzimas y
enzimas sistémicas, se inicia con la fase de gasto de energía ya que tenemos 2 moléculas de ATP
transfieren energía a una molécula de glucosa, transformándose en glucosa difosfato. Luego se da paso a
la fase de generación de energía que se desarrolla a partir de la glucosa difosfato que tiene 2 moléculas
compuestas de 3 carbonos respectivamente, para convertirse en piruvato y a se produce de ATP, con la
ayuda de las enzimas obtenemos como resultado de esta fase 2 moléculas netas de ATP, 2 moléculas de
piruvato, y 2 moléculas de NADH.
- Se da inicio a la Oxidación del piruvato con ayuda de las moléculas transportadoras de alta energía
antes ya mencionadas (2 moléculas netas de ATP, 2 moléculas de piruvato, y 2 moléculas de NADH), que
en presencia de oxígeno ingresan a la mitocondria para darse la oxidación del piruvato en el compuesto
CoA (acetil-coenzima A) cada molécula respectivamente, se transfieren electrones al NAD + de modo
que se convierte en NADH y se libera un carbono que a su vez permite la formación de CO 2 (dióxido de
carbono).
- La siguiente fase es el ciclo del ácido cítrico o Krebs, inicia con la molécula oxalacetato (4 moléculas
de carbono) la cual tiene la intervención de enzimas como NADH y FAD que a su vez transformaran la

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 molécula de ácido cítrico y ayudarán en la producción de ATP, que se producen mediante reacciones
redox enzimáticas de las cuales se obtendrá como resultado iones de hidrógeno, carbonos y oxígeno,
además los residuos de este fase son H2O y CO2, a su vez el oxalacetato estará presente tanto al inicio
como al final del bucle.
- La última fase es la respiración aeróbica, aquí se produce el intercambio de electrones dentro de la
cadena transportadores, esto ocurre en la membrana mitocondrial se da la producción de ATP, de iones
de hidrógeno que se intercambian a través de la ATP sintetasa, el factor primordial es el oxígeno puesto
que se va reducir y obtendremos como desecho del proceso una molécula de H2O.
-

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 4.2. Resultados: análisis e interpretación

Reconocimiento de mitocondrias.

Interpretación:

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 Tinción: BENSLEY CAIN.

En este tipo de células del túbulo contorneado proximal, las mitocondrias, por lo general están en la parte
basal (subnuclear) del citoplasma de dichas células.
La zona cortical del riñón que se caracteriza por la presencia de los corpúsculos renales y de túbulos.
A mayor aumento a nivel del tubo proximal, en la parte basal (subnuclear) del citoplasma de las células
tubulares, se observa la presencia de unos “filamentos” transversales de color entre rosado y un ligero color rojo
que corresponde a la presencia de mitocondrias. La gran cantidad de mitocondrias hace que su citoplasma sea
acidófilo.
Otros posibles colorantes para teñir mitocondrias:
· Fucsina ácida de Altmann, que puede existir tanto como fucsina ácida y como fucsina básica. Ambas poseen
color magenta. La fucsina ácida se emplea en la coloración del colágeno y del tejido muscular liso. También sirve
para teñir mitocondrias.
· Hematoxilina férrica de Regaud: Destaca una buena tinción nuclear y estructuras citoplasmáticas como
mitocondrias, citoesqueleto (células musculares) y otros orgánulos.
· Verde de Janus: Para evidenciar mitocondrias es utilizado Verde Jano al 0,01%. Este producto al reducirse vira
del azul al verde brillante. Es un marcador específico porque al colocarlo en presencia de mitocondrias, emplea
en su reducción los electrones de la cadena respiratoria que se encuentra emplazada en la membrana
mitocondrial interna y las colorea de verde brillante.

Inmunohistoquímica:
La inmunohistoquímica es un procedimiento histopatológico que se basa en la utilización de anticuerpos que
mediante reacciones antígeno-anticuerpo, posteriormente reveladas enzimáticamente, permiten identificar
marcadores antigénicos en los tejidos embebidos en parafina y que luego se observan en el microscopio óptico.

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 Proceso de respiración celular.

El proceso de Respiración Celular tiene 4 etapas en las cuales podemos observar como la molécula de
glucosa se convierte finalmente en ATP, energía que puede ser utilizada por las células de nuestro
cuerpo para realizar diversas reacciones químicas elementales para la vida.
En la 1° Etapa se da en el glucólisis a la molécula de glucosa que entra a la célula, siendo este proceso
llevado a cabo en el citoplasma, convirtiéndose en 2 moléculas de piruvato Co2 ATP y 2 NADH.
En la 2° Etapa estas moléculas de Piruvato entran a la mitocondria con ayuda del Oxígeno, oxidándose y
convirtiéndose en Acetil CoA, produciéndose conjuntamente 2 NADH y liberándose un Carbono que
pasaría a ser parte luego del CO2.
Seguidamente en la 3°Etapa el Acetil CoA se une al Oxalacetato o Ácido Oxalacético, produciéndose
Ácido Cítrico y así sucesivamente por medio de varias reacciones Redox Enzimáticas, queda el
Oxalacetato como compuesto final del proceso, liberándose en todo este ciclo H, C y O que se
convertirán en agua y CO2 que serán eliminados luego; resaltamos que en medio de la 2° y 3° Etapa se
producen 8 NADH, 2 FADH2, 2 ATP y 6 CO2.
En la 4° Etapa observamos la cadena transportadora de electrones compuesta por complejos de
proteínas adheridas a la membrana interna de las mitocondrias por las cuales, a través de un bombeo

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 constante de electrones H+ al medio intermembranoso se crea un gradiente de electrones entre esta y
la matriz. Los electrones vuelven a entrar a la membrana yendo a favor de su gradiente, pero esta vez
ingresan por el complejo ATP sintetasa, medio por el cual pasan a convertirse en ATP al llegar a la
matriz de la mitocondria. De esta forma se producen de entre 32 a 36 ATP netos en todo este proceso

V. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD.
1) Ingresar al laboratorio con su guardapolvo. Esta ropa protectora deberá sacarse inmediatamente antes de
abandonar el laboratorio.
2) Es obligatorio la utilización de guardapolvo que cubra brazos, piernas y torso; deben portar además guantes
de látex y mascarilla.
3) Está prohibido el uso de sandalias, pantalones y faldas cortas, gorras, bufandas y otros accesorios en el
laboratorio. La persona inapropiadamente vestida para trabajar en el laboratorio no podrá ingresar.
4) Toda persona con cabello largo, deberán sujetarlo y recogerlo.

VI. CONCLUSIONES.
En la imagen 1 del corte histológico de riñón, se utilizó una tinción por BENSLEY CAÍN, esto se explica debido a
que, el tipo de células en dicho tejido (células del túbulo contorneado proximal) presenta una gran cantidad de
mitocondrias las cuales por las proteínas que contienen serán acidófilas, pintándose de un color entre rojo y rosa.
Proceso de respiración celular:
A diario consumimos alimentos los cuales pueden ser grasas, proteínas o carbohidratos que ingresa a
nuestro organismo mediante la ingestión sin embargo debe pasar por alteraciones químicas para degradar
su composición y así con ayuda de enzimas convertirse en reserva energética que requerimos en nuestra
dieta diaria.
Además, la respiración celular consta de 4 fases como ya se mencionó, y es debido a la ubicación de donde se produce dichas
fases para, ver la intervención de cada enzima y como ayuda a la descomposición de compuestos o moléculas, en energía como
lo es ATP y que requiere el organismo a diario para realizar las funciones comunes

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VII. BIBLIOGRAFÍA
1) Pasos de la respiración celular [Internet]. Khan Academy. [cited 2022 Feb 19]. Available from:
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/cellular-energetics/cellular-respiration-a
p/a/steps-of-cellular-respiration
2) Kierszenbaum AL. Histología y Biología Celular. Misuri, Estado Unidos: Elsevier Mosby; 2008.
3) Robertis E. Fundamentos de Biología Celular y Molecular de DE ROBERTIS. Buenos Aires,
Argentina: El Ateneo; 2004.
4) Ross. Pawlina. Histología Texto y Atlas color con Biología Celular y Molecular. Bogota DC,
Colombia: Panamericana Editorial Ltda; 2007.
5) SANKINIZATE. Respiración Celular - Animacion en 3D [Internet]. YouTube; 2016. Disponible
en: https://www.youtube.com/watch?v=RxhQJfgbHEQ
6) Iker PSR. La Mitocondria [Internet]. La Mitocondria. 2016 [citado el 28 de mayo de 2021].
Disponible en: http://mitocondriacientifica.blogspot.com/2016/08/hora-de-tenir.html
7) Megías M, Molist P, Pombal MÁ. La célula. 6. Mitocondrias. Atlas de Histología Vegetal y
Animal [Internet]. LA CÉLULA. 2021 [citado el 28 de mayo de 2021]. Disponible en:
https://mmegias.webs.uvigo.es/5-celulas/6-mitocondrias.php
8) Cheriyedath S. Biosíntesis del ATP [Internet]. News-medical.net. 2016 [citado el 28 de mayo
de 2021]. Disponible en: https://www.news-medical.net/life-sciences/ATP-
Biosynthesis-(Spanish).aspx
9) Fosforilación oxidativa (artículo) [Internet]. Khanacademy.org. [citado el 28 de mayo de
2021]. Disponible en: https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/cellular-
energetics/cellular-respiration-ap/a/oxidative-phosphorylation-etc
10) 4.-Fosforilacion oxidativa [Internet]. Ffis.es. [citado el 28 de mayo de 2021]. Disponible en:
http://www.ffis.es/volviendoalobasico/4fosforilacion_oxidativa.html
11) ATP Sintetasa [Internet]. Ecured.cu. [citado el 28 de mayo de 2021]. Disponible en:
https://www.ecured.cu/ATP_Sintetasa

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 12) Robert T. La ATP sintasa: un motor molecular [Internet]. Usal.es. 2018 [citado el 28 de mayo
de 2021]. Disponible en:
http://proteinasestructurafuncion.usal.es/moleculas/atpsintasa/index.html
13) Lab S. ATP synthase: Structure and Function [Internet]. Estados Unidos: YouTube; 2016.
Disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=b_cp8MsnZFA
14) Tricas L. Coenzima A: función bioquímica - info-farmacia [Internet]. Google.com. 2011 [citado
el 28 de mayo de 2021]. Disponible en: https://sites.google.com/a/info-
farmacia.com/info-farmacia/bioquimica/coenzima-a-funcion-b

VIII. ANEXOS

PREGUNTAS DE APLICACIÓN

1) ¿Qué procesos ocurren en la matriz mitocondrial?

● Ciclo de Krebs. Tiene lugar en la matriz mitocondrial.

● En la matriz mitocondrial se realizan diferentes rutas metabólicas importantes para la vida, como el Ciclo de
Krebs, en el cual se metabolizan los nutrientes que sirven para que las mitocondrias generan energía, y el
desarrollo de la cadena de transporte de electrones

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 El objetivo final del ciclo de Krebs es promover la descomposición de los productos finales del metabolismo de los
carbohidratos, lípidos y algunos aminoácidos. Todas estas sustancias que son ingeridas al organismo a través de los
alimentos se convierten en Acetil- CoA con la liberación de CO2 y H2O y síntesis de ATP.

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 En el ciclo de Krebs se encuentran algunas reacciones químicas principalmente oxidativas. Todas estas reacciones
necesitan de oxígeno para llevarse a cabo. Cada reacción química cuenta con la participación de algunas enzimas
que se encuentran en las mitocondrias. Estas enzimas son las responsables de catalizar las reacciones.

2) ¿Cuáles son los mecanismos moleculares en la cadena de transporte de electrones?

LOS MECANISMOS MOLECULARES EN LA cadena de transporte de electrones es una serie de transportadores

de electrones que se encuentran en la membrana interna de bacterias, en la membrana interna mitocondrial o en
las membranas tilacoidales, que mediante reacciones bioquímicas producen trifosfato de adenosina (ATP), que
es el compuesto energético que utilizan los seres vivos. Solo dos fuentes de energía son utilizadas por los
organismos vivos: reacciones de reducción-oxidación y la luz solar (fotosíntesis). Los organismos que utilizan
las reacciones redox para producir ATP se les conoce con el nombre de quimioautótrofos, mientras que los que
utilizan la luz solar para tal evento se les conoce por el nombre de fotoautótrofos. Ambos tipos de organismos
utilizan sus cadenas de transporte de electrones para convertir la energía en ATP.

➔Entrega de electrones por NADH y FADH2.

➔ Transferencia de electrones y bombeo de protones.
➔Separación de oxígeno molecular para formar agua.

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 ➔ Síntesis de ATP impulsada por un gradiente.

Todos los electrones que entran en la cadena

de transporte provienen de moléculas de NADH
y FADH2 que se producen en fases más
tempranas de la respiración celular: glucólisis,
oxidación del piruvato y el ciclo del ácido
cítrico.
El NADH es muy bueno donando electrones en
reacciones redox (o sea que sus electrones
están en un nivel de energía alto), por lo que puede transferir sus electrones directamente al complejo I y se
transforma otra vez en NAD +.
El FADH2 no es tan bueno para donar electrones como el NADH (o sea que sus electrones se encuentran en un
nivel de energía más bajo), por lo que no puede transferir sus electrones hacia el complejo I. En su lugar,
introduce los electrones a la cadena de transporte a través del complejo II, el cual no bombea protones a través
de la membrana.
La cadena transportadora de electrones tiene dos funciones importantes:
➢ Regenera los acarreadores de electrones.
➢ Forma un gradiente de protones.

3) ¿Cómo funciona la ATP sintasa en la biosíntesis de ATP?

La ATP sintasa (ATPasa o F1/Fo ATPasa o Complejo V) es la enzima encargada de acoplar el transporte de electrones y
la síntesis de ATP o fosforilación oxidativa, en la respiración celular.
La fuerza protón motriz se emplea para acoplar el transporte de electrones con la fosforilación oxidativa: el exceso de
protones pasa a través de la membrana interna de nuevo a la matriz a través de canales de la ATP sintasa, impulsando
la síntesis de ATP.
La concentración de H20 en el centro activo es muy pequeña, y la enzima se une más fuertemente al ATP que al ADP.
Todo ello hace que el equilibrio de la reacción se desplace hacia la formación de ATP.
Por tanto, la síntesis de ATP en el centro activo de la subunidad β catalítica no precisa de un aporte energético. La
energía es necesaria para que se libere el ATP mediante el mecanismo “cambio de unión” y catálisis rotacional.

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 Abierta O: Nula afinidad. Los nucleótidos pueden unirse o liberarse.
Laxa L: Poca afinidad. Los nucleótidos quedan retenidos (Unión y retención de ADP y Pi). Tensa T: Alta afinidad. S
sintetiza el ATP.
La interacción de cada subunidad β con la subunidad γ hace que las tres subunidades β NO sean equivalente
rotación de la subunidad γ, que gira 120º en el sentido contrario a las agujas del reloj (mirando desde la ma
interconvierten la subunidad β entre las tres formas.

En resumen, los protones bombeados al espacio intermembrana (Lado P) durante el transporte electrónico pasa
matriz mitocondrial (Lado N) a través del canal de Fo, acoplándose con la liberación del ATP sintetizado
subunidad F1. Por tanto, la función de la fuerza motriz de protones NO es la síntesis de ATP sino su liberación
sintasa.

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 El flujo continuo de H+, a través de la ATP sintasa, impulsa la rotación de un eje interno y éste, a su vez, activa
secuencialmente los tres sitios activos de la enzima, dando como resultado la síntesis del ATP a partir de
ADP y fosfato inorgánico (Pi)

4) ¿Cómo se forma la Acetil CoA?

El acetil coenzima A - acetil-CoA - es una importante molécula bioquímica en la respiración celular. Se

produce en el segundo paso de la respiración aeróbica después de la glucólisis, y lleva a los átomos de carbono
del grupo acetilo, al ciclo TCA para ser oxidado y producir energía. Se produce por la descarboxilación del
piruvato en la matriz de la mitocondria. El acetil-CoA es también un componente importante en la síntesis
biogénica del neurotransmisor acetilcolina.

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 La importancia del Acetil-CoA radica en que tanto en el ser humano y animales, este actúa esencialmente para el
equilibrio entre el metabolismo de carbohidratos y de grasas en el cuerpo. En circustancias normales, a partir de
Acetil-Coa, el metabolismo de los ácidos grasos alimenta el ciclo del ácido cítrico, contribuyendo así a la célula
de energía.

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