PRACTICA 9

TRANSPORTE DE ELECTRONES: ESTUDIO DE LA ACCION ENZIMATICA

DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA

OBJETIVO

1. Poner de manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo intermediario

y la acción de las enzimas de oxido-reducción, haciendo uso de un aceptor de electrones
como el azul de metileno.

2. Verificar la acción inhibitoria del malonato sobre la succinato deshidrogenasa y del cianuro
a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.

FUNDAMENTO

Las transformaciones biológicas de sustratos comprenden procesos de óxido-reducción y

transferencia de electrones a través de una serie de sistemas enzimáticos.

En las oxido-reducciones se produce transferencia de electrones a partir de un dador hasta un

aceptor. Algunas veces el transporte de electrones es realizado mediante la transferencia de
átomos de hidrógeno o bien átomos de hidrógeno y un electrón. las enzimas que realizan este
tipo de reaccione son las deshidrogenasas pudiendo ser piridin (NAD, NADH) o flavina (FAD)
dependientes; además existen los citocromos que son de naturaleza ferroporfirínica y se
encuentran ordenados de acuerdo a su potencial de óxido reducción constituyendo la llamada
"Cadena de Transporte Mitocondrial".

Algunos compuestos orgánicos coloreados, al aceptar hidrógenos se convierten en leuco

derivados. Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de óxido-reducción es +0.01 y el
2,6-diclorofenolindofenol cuyo potencial de óxido-reducción es +0.22.

La succinato deshidrogenasa (SHD) es una flavoproteína unida a hierro no hémico. El metal tiene
como finalidad actuar como enlace para conservación de energía y desacoplar los dos
equivalentes reductores del ion hidrogeno aceptado por la flavina y, finalmente estabilizar la
forma semiquinoide de la flavina.
Diversas sustancias pueden actuar inhibiendo los sistemas biológicos de oxidoreducción. Por
ejemplo, el malonato actúa específicamente inhibiendo a succinato deshidrogenasa por un
mecanismo competitivo; por lo tanto, la prueba experimental con azul de metileno será
negativa, es decir no se decolora por no haber movilización de electrones. El cianuro, actúa
impidiendo la reoxidación de los citocromos, pues se combina específicamente con el Fe ++ del
citocromo oxidasa; por ello los citocromos permanecen reducidos e incapaces de seguir
actuando y se bloquea la respiración.

MATERIAL

 Sucrosa 0.25 M
 Succinato de sodio 0.1 M
 Malonato de sodio 0.5 M
 Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M
 Azul de metileno 0.05%
 Aceite mineral
 Tubos de ensayo
 Pipetas
 Morteros
 Centrífuga

METODO DE TRABAJO

A) Preparación del homogenizado. Colocar un mortero sobre hielo picado, luego pesar 10.0 g.
de hígado, corazón y músculo de rata o de conejo; picarlo y colocarlo sobre el mortero.
Añadir 90.0 ml de sucrosa 0.25 M la cual debe estar fría, homogenizar y luego filtrar con
gasa. El filtrado es guardado en frío hasta su uso (Figura 1)
MUSCULO

 Para el tubo 1 (control) se observa un color azul claro.

 Para el tubo 2 se observa un color claro indicando que la prueba es positiva.

 Para el tubo 3 se observa un color azul claro indicando que la prueba es negativa.

 Para el tubo 4 se observa un color azul claro indicando que la prueba es negativa.
CORAZÓN
CORAZÓN

 Para el tubo 1 (control) se observa un color azul oscuro.

 Para el tubo 2 se observa un color claro indicando que la prueba es positiva.

 Para el tubo 3 se observa un color azul oscuro indicando que la prueba es negativa.

 Para el tubo 4 se observa un color azul oscuro indicando que la prueba es negativa.

HÍGADO

 Para el tubo 1 (control) se observa un color azul claro en la parte superior y rosada en la
inferior.

 Para el tubo 2 se observa un color rosado indicando que la prueba es positiva.

 Para el tubo 3 se observa un color azul en la parte superior y rosada en la inferior indicando
que la prueba es parcialmente negativa.

 Para el tubo 4 se observa un color rosado indicando que la prueba es positiva.

DISCUSIÓN

MUSCULO

Se puede denotar una clara diferencia entre el tubo 2 y tubo 3 respectivamente y esto se debe a la
presencia de un inhibidor que actúa sobre el succinato. También se logra apreciar un azul en el tubo
4 debido a la acción del cianuro que impide la acción del citocromo y bloquea la respiración
impidiendo el transporte de electrones.
 CORAZÓN

Se puede denotar una clara diferencia entre el tubo 2 y tubo 3 respectivamente y esto se debe a la
presencia de un inhibidor que actúa sobre el succinato. También se logra apreciar un azul oscuro en
el tubo 4 debido a la acción del cianuro que impide la acción del citocromo y bloquea la respiración
impidiendo en transporte de electrones.

HÍGADO

El hígado posee una alta cantidad de enzimas y succinato que poseen su propio sustrato, la
inhibición se ve de manera parcial en el tubo 3 debido a la presencia de estas el malonato no puede
inhibir en su totalidad al succinato. En cuanto a la acción del cianuro también se ve afectado por las
altas concentraciones de enzimas no puede inhibir a los citocromos permitiendo en transporte de
electrones.

CONCLUSIÓN

 Se logró Poner de manifiesto describir y observar una de las etapas del metabolismo
intermediario y la acción de las enzimas de óxido-reducción, siendo en las muestras de
musculo y corazón las más notables en estos procesos.

 Se logró verificar la acción inhibitoria del malonato de sodio y el cianuro de potasio sobre el
succinato de sodio, en la muestra de hígado se comprobó que un alto número de
mitocondrias pueden llegar a contrarrestar esta acción inhibidora dando resultados
parcialmente negativos.
 CUESTIONARIO

1. Haga un esquema de la oxidación del succinato por acción de la succinato deshidrogenasa,

además acople la cadena respiratoria para indicar el destino final del hidrógeno y de los
electrones del succinato.

COMPLEJO II

Espacio intermembrana

Membrana mitocondrial
interna

Matriz

SUCCINATO FUMARATO

El FADH2 del succinato deshidrogenasa, al no poder desprenderse del enzima, debe oxidarse
nuevamente in situ. El FADH2 cede sus dos hidrógenos a la ubiquinona (coenzima Q) que se
reduce a ubiquinol (QH2) y abandona el enzima, difundiendo en la bicapa lipídica hasta alcanzar
el siguiente complejo enzimático de la cadena respiratoria.

La molécula de FAD del enzima es el aceptor de electrones de la reacción. En general la función

bioquímica del FAD es oxidar los alcanos a alquenos, mientras que el NAD+ oxida los alcoholes
a aldehídos o cetonas. Esto es debido a que la oxidación de un alcano (como el succinato) a un
alqueno (como el fumarato) es suficientemente exergónica como para reducir el FAD a FADH2,
pero no para reducir el NAD+ a NADH. Es poco usual hallar una unión covalente entre el FAD y
una proteína; en la mayoría de los casos, el FAD se encuentra asociado a los enzimas de forma
no covalente.

El succinato deshidrogenasa actúa separando dos átomos de hidrógeno que entre sí se hallan
en posición trans de los átomos de carbono metilénicos del succinato.

Esta enzima posee algunas características de una enzima alostérica: es activada por el succinato,
el fosfato, el ATP y la coenzima Q reducido, y es inhibido por el malonato, un análogo estructural
del succinato.

Por otro lado, esta enzima se constituye como una de las dianas moleculares en la intoxicación
por cianuro, compuesto que inhibe su acción y así bloquea la producción de ATP, induciendo a
hipoxia celular.

2. Cuál es el efecto de cada uno de los siguientes inhibidores sobre el transporte de electrones
y la formación de ATP en la cadena respiratoria.

a) Azida: es capaz de inhibir a la enzima citocromo c oxidasa formando un enlace

irreversible con el cofactor hemo, en un proceso similar al realizado por el monóxido de
carbono.

b) Atractilósido: Actúan en el complejo enzimático (ATPsintasa) que cataliza la síntesis de

ATP, bloquean el paso en el cual el ADP se une al fosfato impidiendo que la energía del
potencial electroquímico llegue al sistema fosforilante. Inhibe el transportador que
introduce ADP a la mitocondria.

c) Rotenona: Sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando la transferencia de electrones

entre la flavina y la ubiquinona. (Inhibidores del sitio I)

d) Monóxido de carbono: Actúan sobre el Hemo a3 de la citocromooxidasa impidiendo su

interacción con el oxígeno (inhibidores de sitio IV)

e) Antimicina A: Actúa bloqueando la transferencia de electrones entre el citocromo b y el

citocromo c1. (inhibidores de sitio III)

3. Asumiendo que las concentraciones mitocondriales de succinato y fumarato son

respectivamente de 0.0002 M y 0.00003 M, estimar el potencial redox en estas condiciones.
Considere que el proceso se estudia a pH 7.0 y a 25°C.
4. Cuando el citrato es descompuesto para dar acetato y oxalacetato, el  G°' es de -680
cal/mol. Para la reacción catalizada por el citrato sinteasa la constante de equilibrio es de
0.000032. Estime con estos datos la constante de equilibrio para la reacción de hidrólisis del
acetil CoA y el G°'.

5. La reacción de hidrólisis de la lactato deshidrogenasa tiene un  G°' de -3.8 Kcal/mol.

Encontrar la constante de equilibrio para dicha reacción que se realiza en condiciones
estándar.