Deshidrogenasa succínica del hígado

1.
Levi Patterson 1-745-849 2. Tifanny Navarro 4-781-2352
3.
Gabriela Rodríguez 4-799-2349
Bioquímica (Qm.235), Escuela De Tecnología Médica,
Facultad De Ciencias Naturales Y Exactas,
Universidad Autónoma De Chiriquí.
David, Chiriquí, Republica De Panamá.
Email: 1. levipatterson28@gmail.com 2 .tifannydalet@gmail.com
3.
gabyroqui1998@gmail.com

Resumen:
El objetivo de este laboratorio determinar detectar la actividad enzimática de la deshidrogenasa
succínica utilizando el extracto del hígado. Para la catálisis del sustrato, se realizaron 6 pruebas
por indicadores los cuales van a cumplir una función de aceptar electrones artificiales como el azul
de metileno. la cantidad de sustrato y agua vario para comprobar la efectividad de la enzima en una
cantidad considerable, cuando no había sustrato, cuando esta fue desnaturalizada y cuando se le
aplicaron los inhibidores artificiales que fueron el malonato de sodio, azida y el cianuro de sodio. al
final se compararon los resultados determinándose a veces la reacción de los inhibidores no
resultan del todo efectivas según la cantidad de sustrato y de la enzima presente para inhibir.
También se determinó que la reacción fue más eficiente la que tenía las cantidades similares de
sustrato, enzima y agua; mientras que los menos eficientes fueron con inhibidores fuertes los cuales
interfirieron con la función de la enzima donde el inhibidor más efectivo fue el malonato de sodio,
con esto logramos entender la importancia de tener un ambiente en las condiciones adecuadas
para que las enzimas realicen de forma efectiva su actividad catalítica en el organismo.
Palabras claves: Redox, Sustrato, Actividad Enzimática, Indicador, Homogenizado, Inhibidor.
Objetivos: que al aceptar átomos de hidrógenos del
sustrato, originan la forma leuco, la cual es
 Detectar la actividad enzimática de la
incolora. Con este cambio de color del
deshidrogenasa succinica en extractos de
indicador redox se comprueba que la enzima
hígado utilizando indicadores redox como
está transformando el sustrato. Según
aceptores artificiales de electrones (Vázquez M. 2002).
 Establecer que sustancias pueden actuar
como inhibidores de la deshidrogenasa Materiales y Reactivos:
succínica.
Descripcion capacidad cantidad
Marco teórico: Vasos 100 y 250 ml 3
químicos
La deshidrogenasa succínica es una enzima Licuadora 1
especial de la mitocondria, porque participa en Tubos de - 6
dos procesos metabólicos a la vez, el ciclo de ensayo
Krebs y la cadena de transporte electrónico.
El 2,6 diclorofenolindofenol (DICIPIP) y el azul
de metileno resultan ser indicadores redox
apropiados para funcionar como aceptores
artificiales de electrones y establecer la
actividad de la deshidrogenasa succínica en
los homogenizados de los tejidos. Se trata de
sustancias de color azul en su forma oxidada,
Nom Form Prop. físicas Toxicidad Metodología
bre ula y quimicas
cortar trozos pequeños del
higado y proceder a licuarlos
Fosfa (NaH2 Sólido, polvo Irritaciones en con 100 ml de agua hasta
to PO4) cristalino son la nariz en la obtener el extracto
mono olor. p.e: piel
básic 200°C. pF
o de 100°C
sodio
Hidro NaOH Masa Puede causar luego se toman 40 ml del
xido molar: 39.997 daños graves, homogenizado y se diluyen
de g/mol permanentes hasta 200 ml con agua
destilada
sodio Densidad: 2.1 al sistema
3 g/cm³ gastrointestinal.
S0líquido, 1 Irritación con
bar: 75.91 pequeñas
J·mol-1·K-1 exposiciones se agita la mezcla
vigorosamente y la preparacion
Azul C16H18 Densidad: 1.75 resultante se emplea en las
de ClN3S 7 g/cm³ diferentes pruebas
metil Punto de
eno fusión: 100 °C
Punto de al homogenizado del tubo 3 se
ebullición: Se calentara previamente a una
descompone temperatura de 52 °C, por espacio
de 15 minutos
Malo C7H12 Masa Irritante en altas
nato O4 molar: 160.17 concr¿entracio
de g/mol nes
sodio Densidad: 1.0 se agitan todos los tubos y se
colocan en baño maria a una
5 g/cm³
teperatura de 37 °C por un tiempo
Punto de de 30 minutos.
ebullición: 19
9 °C
Solubilidad
en
observar en que tiempo
agua: despre desaparece el color de los tubos ,
ciable centrifugar y decantar el liquido y
observar los cambios en cada tubo
Resultados Cuadro # 2 Orden de agregado de reactivos a
cada uno de los tubos
Cuadro #1 Preparación de soluciones
Solución Fosfato monobásico de sodio Solución Tubos
Amortiguadora 0.1M Se disuelve 1.38g Orden de 1 2 3 4 5 6
100ml de H2O y se ajustó el Rect
𝑝𝐻 A 7.4 mediante la adición A ml de 0.5 0.5 0. 0. 0. 0.5
de hidróxido de sodio 0.1N. amortig 5 5 5
uador
Solución De Previamente preparado
Azul De B ml de 0.0 0.5 0. 0. 0. 0.5
Metileno Al sustrato 5 5 5
0.02%

Solución De 𝑔 C ml de 1.0 0.5 0. 0. 0. 0.0

𝑔
Malonato De = 0.1𝑀 𝑋 0.025𝐿 𝑋 160.17𝑚𝑜𝑙 agua 5 0 0
Sodio 0.1M = 0.4004g que hay que pesar destilad
para preparar malonato de a
sodio 0.1M en un volumen de D ml de 1.0 1.0 1. 1. 1. 1.0
25ml. homoge 0 0 0
𝑔
Solución De g=0.1𝑀 𝑋 0.025𝐿 𝑋 160.17𝑚𝑜𝑙 nizado
Succinato De de
Sodio hígado
Solución de 𝑔 E Azul de 1.0 1.0 1. 1. 1. 1.0
𝑔
azida de sodio = 0.1𝑀 𝑋 0.025𝐿 𝑋 160.17𝑚𝑜𝑙 metilen 0 0 0
0 .1M o
Solución de 𝑔 Indicad
𝑔
cianuro de = 0.1𝑀 𝑋 0.025𝐿 𝑋 160.17𝑚𝑜𝑙 or
sodio 0.1M F ml - - - 0. - -
Homogenizado malonat 5
de hígado o de
sodio
G ml de - - - - 0. -
azida 5
H ml de - - - - - 0.5
cianuro
 Cuadro #4 Tubo control #1
Cuadro #3 Contraste De Resultados
Procesos Observacione
s
Agregados todos
los reactivos
previo al
calentamiento en
el tubo #1 se
observa 2 fases
Tubo #2 de igual
manera se
observan dos
Antes de Luego de Luego de
fases
calentar calentar centrifugar
Tubo# 3 se
realizó aparte por
requerimientos Cuadro #5 Tubo #2
especiales
Tubos luego de
calentados por
30 minutos
En el tubo #1 no
hubo cambio
cambio de
coloración en el
tubo #2 después
de 7 minutos se
observó un
cambio de color y
se formó un
sobrenadante en Antes de Luego de Luego de
#3, #6 no se calentar calentar centrifugar
observó ningún
cambio de Cuadro #6 tubo 3
coloración y en
el #4 y #5 se
observa
claramente un
sobrenadante en
el fondo.

Tubo #1 y #6 sin
formación de
precipitado Antes de Luego de Luego de
Tubo #2 agregar la añadir la centrifugar
2 3 4 5 precipitado enzima enzima
6
Tubo #3 calentada sometida a
precipitado color temperatura
oscuro elevada
Tubo #4 gran
precipitado
Tubo #5 gran
cantidad de
precipitado
 Cuadro #8 tubo #5 Agregado Azida
Cuadro #7 tubo #4 Agregado malonato

Antes de Luego de Luego de

calentar calentar centrifugar
Antes de Luego de Luego de
calentar calentar centrifugar
Cuadro #9 tubo #6 Agregado cianuro de sodio

Antes de calentar Luego de Luego de

calentar centrifugar
Cuadro#10 efectividad después del
calentamiento

Inhibidor Tub Efectividad Observaciones

o
Malonat 4 Efectivo Azul oscuro
o
Ilustración 1 Como actúa el inhibidor de Azida 5 Parcialmen Azul
malonato te efectivo
cianuro 6 No efectivo No hubo
cambio de
color

Ilustración 2 Mecanismo Del Succinato

Deshidrogenasa

Ilustración 3 color del precipitado luego de

calentar diferencia y efectividad del inhibidor
Cuadro#11 observaciones de precipitado luego
de centrifugar
Inhibido T Efectivida Observaciones
r u d catálisis enzimática efectivamente como se
b puede apreciar en el cuadro #5 de los
o resultado donde el contraste de las reacciones
Malonat 4 Efectivo
o
Azul oscuro
Azida 5 Parcialme
nte
efectivo
Azul claro
cianuro 6 No No hubo cambio de
efectivo color
Discusión:
Durante esta experiencia pusimos aprueba la
reacción de deshidrogenasa ante la presencia
o ausencia de diferentes efectores que
puedan alterar su función catalítica y por ende
la fisiológica que realizan para mantener
nuestro organismo en equilibrio. Iniciamos
preparando en el tubo #1 (que podemos
observar en el cuadro de resultados #4)
agregando lo indicado del cuadro #2 con el fin
de que este primer tubo nos sirva de control y
comparación con los demás a los cuales les
variamos los diferentes efectores que pueden
afectar el funcionamiento óptimo de nuestra
enzima en estudio. Por lo que en este tubo no
se observó reacción ya que no contenía
sustrato, es decir, no hubo inhibición. De esta
forma no pudo realizar su conversión de
succinato a fumarato. La enzima succinato
deshidrogenasa está sujeta a una poderosa
inhibición competitiva por parte de reactivos,
en este caso el fenol, (Barrantes, 2016). Por
otro lado en el tubo # 2, posterior al haber
mantenido una temperatura de 37° la cual es
la temperatura óptima para su funcionamiento
pasados 7 minutos se observó un
sobrenadante en el fondo del tubo con una de
coloración lo que nos confirma que si se dio la
a medida que pasa el tiempo y que va
realizando su función de inhibición. Lo que
quiere decir que succinato deshidrogenada
pudo realizar la
conversión de succinato a fumarato según sus
funciones habituales en nuestro organismo
Según (Walla, 2000), esto se logra
removiendo 2H+ y 2 electrones del succinato
para formar fumarato y la coenzima reducida
(FADH2), en este caso la enzima
deshidrogenada succínica reduce al azul de
metileno, ya que este actúa como aceptor y el
azul de metileno reducido es
incoloro. Continuamos nuestra experiencia
esta vez con el efector que naturalmente
afecta las enzimas por su origen proteico es la
temperatura por ende durante esta prueba
sometimos a la enzima a una temperatura
superior de la que puede soportar por lo que
sufrio una desnaturalización, por consiguiente
pierde su actividad catalítica. Esto no permitió
la reacción por los efectos de la temperatura
de 55 °C por lo que confirmamos que un
aumento de la temperatura provoca la
desnaturalización de la
enzima deshidrogenasa la cual trabaja
óptimamente a 37 °C. Se utiliza azul de
metileno porque es un indicador redox
apropiado para
estas funcione. Se trata de una sustancia de
color azul en su forma oxidada, que al
aparecer
átomos de hidrógenos del sustrato originan la
forma leuco, la cual es incolora (Vázquez M.
2002). Posteriormente probamos con otros
efectores esta vez inhibidores químicos. “El
Malonato es una Molécula con estructura
similar a la del succinato que se emplea para
inhibir de forma competitiva la enzima
succinato deshidrogenasa” según (Miranda
K. 2018). En el tubo 4 agregamos 0.5 de
malonato fue evidente la formación de un
precipitado con lo que podemos afirmar que el
malonato es un inhibidor competitivo del
succinato. En la reacción de fosforilación
oxidativa, el malonato es un inhibidor del Hemo de la citocromooxidasa impidiendo su
complejo II que, nuevamente, contiene interacción con el oxígeno.
succinato deshidrogenasa. El malonato es un
Cuestionario:
inhibidor competitivo de la deshidrogenasa
succínica, de tal manera que la presencia de 1. ¿En qué tiempo desaparece el color
malonato detiene el ciclo de en el tubo 2?
Krebs. La reacción que cataliza la enzima es
la de deshidrogenar al succinato para producir R: En nuestra tubo 2 no desapareció el color,
fumarato y FADH2. Detener el ciclo de Krebs si no que fue notable a los 7 minutos una
implica parar la cadena respiratoria y por lo degradación del color azul indicando que la
enzima de succinato se convirtió en fumarato
luego de haber trabajado en la temperatura
indicada para su mejor funcionamiento.
2. ¿Por qué no desaparece el color en
el tubo 1 y 3?
R: En el tubo 1 no se observó reacción ya que
no contenía
sustrato, fue tomado como control, es decir,
no hubo inhibición, por lo tanto no hubo
Ilustración 4 El malonato es una sustancia análoga
desaparición de color. En el tubo tres no se dio
con el ácido succínica
la desaparición de color porque esta muestra
tanto la maquinaria de producción de ATP. fue llevada a una temperatura de 52ºC,
Cuando ocurre la inhibición de una enzima superior a la de su rango de trabajo, por lo
que se encuentra dentro de una determinada que la enzima sufrió una desnaturalización y
vía metabólica, el sustrato de la enzima tiende no realizó la reacción catalítica.
a acumularse, ya que no puede ser
3. Presente las reacciones
transformado en un producto, (Gonzales,
correspondientes en los tubos
2011). En el tubo 5 una formación de
donde hubo actividad enzimática.
precipitado nos confirma una inhibición por la
azida de sodio que es una sustancia química R: reacción general del succinato con
que afecta a la cadena respiratoria. Son inhibidores:
sustancias que se enlazan a alguno de los
componentes de la cadena de transporte de
electrones bloqueando su capacidad para
cambiar de una forma reversible desde la
forma oxidada a la forma reducida y viceversa.
Esta inhibición resulta en una acumulación de
los componentes en sus formas reducidas
antes del punto de inhibición, y la presencia de
las formas oxidadas de los componentes de la
Cadena de transporte de electrones después
del punto de inhibición. Y por último en el tubo
Ilustración 5 acción de succinato con inhibidores
6 se observó que no hubo una decoloración
por lo tanto no hubo actividad inhibidora en el
tiempo estipulado. Sin embargo el cianuro es
un inhibidor más efectivo según (Miranda K.
2018). Se puede deducir que no hubo una
actividad inhibidora debido a que no se le dejo
reaccionar por más tiempo. La función del Ilustración 6 Inhibición con el malonato
cianuro como inhibidor es actuar sobre el
 4. Clasifique los inhibidores como
efectivo, parcialmente efectivos y no
afectivos.
Efectivos Parcialmente No
efectivos
Efectivos
Malonato Azida de Cianuro de
sodio sodio
5. ¿Qué tipo de inhibidor
malonato?
R: El malonato es un inhibidor de la
respiración celular, porque se une al sitio
activo de la succinato deshidrogenasa en el
ciclo del ácido cítrico, pero no reacciona,
compitiendo con el succinato. En la reacción
de fosforilación oxidativa, el malonato es un
inhibidor del complejo II que, nuevamente,
contiene succinato deshidrogenasa.
Esquema de la inhibición del malonato:
Ilustración 7 inhibidor competitivo
6. ¿Qué papel desempeña el succinato
de deshidrogenasa en el ciclo de
Krebs y en la cadena de transporte
electrónico?
R: la enzima en el ciclo de Krebs: es un
complejo proteico ligado a la membrana
interna mitocondrial que interviene en el ciclo
de Krebs y en la cadena de transporte de
electrones, y que
contiene FAD unido covalentemente.
Cataliza la reacción:
Succinato + ubiquinona fumarato
ubiquinol
Esta proteína puede degradarse a la enzima
número EC 1.3.99.1 que ya no reacciona con
la ubiquinona necesitando otros aceptores de
electrones.
Succinato + aceptor fumarato + aceptor
reducido
El FADH2 de la succinato deshidrogenasa, al
no poder desprenderse del enzima, debe
oxidarse nuevamente in situ. El FADH2 cede
es el sus dos hidrógenos a la ubiquinona (coenzima
Q) que se reduce a ubiquinol (QH2) y
abandona el enzima, difundiendo en la bicapa
lipídica hasta alcanzar el siguiente complejo
enzimático de la cadena respiratoria.
La molécula de FAD del enzima es el aceptor
de electrones de la reacción. En general la
función bioquímica del FAD es oxidar
los alcanos a alquenos, mientras que el
NAD+ oxida
los alcoholes a aldehídos o cetonas. Esto es
debido a que la oxidación de un alcano (como
el succinato) a un alqueno (como el fumarato)
es suficientemente exergónica como para
reducir el FAD a FADH2, pero no para reducir
el NAD+ a NADH. Es poco usual hallar una
unión covalente entre el FAD y una proteína;
en la mayoría de los casos, el FAD se
encuentra asociado a los enzimas de forma no
covalente.
En transporte de electrones; La succinato
deshidrogenasa actúa separando dos átomos
de hidrógeno que entre sí se hallan en
posición trans de los átomos de
carbono metilénicos del succinato
Se trata de un complejo formado en
mamíferos por 4 subunidades proteicas.
Cataliza la reacción de oxidación del succinato
a fumarato acoplándola con la reducción de la
ubiquinona a ubiquinol. El acoplamiento se
realiza gracias a una cadena de oxidaciones
(esquematizada a la derecha) en varios
coenzimas redox incluidos en este complejo.
subunidad coenzima
+ SDHA FAD, unido de modo covalente
 3 núcleos Fe·S (Fe2S2, Fe4S4 y Bibliografía
SDHB------
Fe3S4)
 Alvarado, S. (2013). Bioquímica II.
SDHC----- Recuperado el 7 de noviembre de 2017 de
- grupo hemo y sitio de unión para http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.co
CoQ m.mx/media/users/10/523320/files/51871/
SDHD Ma.

La coenzima Q (ubiquinona) difunde entre la  Gonzáles R.. (2011). Clasificación de las

región hidrófoba de la bicapa lipídica y el sitio enzimas. Recuperado el 7 de noviembre
de unión en las subunidades C y D del de básicos/indicador-redox.
complejo II, integradas en la membrana. Una
 Vázquez M. 2002.
vez reducido, el ubiquinol (QH2) puede
Collen S. & Lieberman, M.
desplazarse por la membrana y así transportar
BIOQUIMICA BASICA. Un enfoque clínico.
los electrones hasta el complejo III.
España: Mcgraw-hills. Interamericana.
Además de la succinato deshidrogenasa (que
 Sierra, K. (2013). Actividad enzimática.
interviene en el ciclo de Krebs, otras enzimas
Recuperado el 7 de noviembre de 2017 de
que utilizan FAD pueden también ceder
http://www.medicina.uat.edu.mx/bioquimic
protones y electrones a la ubiquinona.
a/enzimas/Enzimas_y_coenzimas2.html
Conclusiones:
 (Miranda K. 2018). Bioquímica. México:
 Logramos observar mediante diferentes Ed. Reverté.-Walla, M. Marchuk, D.
pruebas la actividad enzimática en la Activated enzymatic: Identificacion de alfa-
deshidrogenasa succínica. amilasa salival.2aed. España: Lancet

 Reafirmamos que las enzimas por ser de

origen proteico al enfrentar condiciones
fuera de lo habitual como el cambio brusco
de temperatura interfiere de forma directa
con la actividad catalítica que realiza y que
en presencia de presencia de sustancias
inhibidoras como el malonato, azida y
cianuro de sodio. También su actividad
enzimática se ve perjudicada.

 Determinamos cómo se da la velocidad de

reacción en una enzima en condiciones
óptimas vs una sometida a cambios o en
presencia de inhibidores competitivos
como lo es el malonato el cual fue
evidenciada observando la reacción de
oxidación del azul de metileno y la
deshidrogenasa succínica.