Resumen

El cianuro es tóxico para la mayoría de los organismos vivos. La toxicidad del cianuro se deriva de
su capacidad para inhibir la enzima citocromo C oxidasa de la cadena de transporte electrónico. A
pesar de su alta toxicidad, varios procesos industriales dependen del uso de cianuro, y cantidades
considerables de residuos industriales deben tratarse adecuadamente antes de su vertido. Los
tratamientos biológicos para la descontaminación de residuos de cianuro incluyen el uso de
microorganismos y enzimas. En cuanto al uso de enzimas, cianuro dihidratasa (CynD), que cataliza
la conversión de cianuro en amoníaco y formiato, es un candidato atractivo. No obstante, la
principal impedimento para el uso efectivo de esta enzima para la biodegradación del cianuro es la
marcada intolerancia al pH alcalino en que se guardan los residuos de cianuro. En este trabajo,
exploramos las capacidades operativas de células enteras de E. coli que sobreexpresan Bacillus
pumilus CynD inmovilizado en tres matrices de polímeros orgánicos: quitosano, poliacrilamida y
agar. Sorprendentemente, los inmovilizados las células en agar y poliacrilamida retuvieron más del
80 % de actividad incluso a pH 10 y mostraron una alta capacidad de reutilización. Por el contrario,
el las células inmovilizadas en quitosano no estaban activas. Finalmente, la idoneidad de los
complejos activos para la degradación del cianuro libre de una solución derivada de la industria de
procesamiento de oro.

Introducción

El cianuro es un compuesto tóxico que se presenta en una variedad de y ambientes

antropogénicos. La toxicidad del cianuro es principalmente atribuible a su capacidad para
interrumpir la electrónica

cadena de transporte al bloquear la enzima citocromo C oxidasa (Cummings 2004). A pesar de su

alta toxicidad, más de 1 millón de toneladas de cianuro al año se utilizan en procesos industriales,

como la síntesis química, la galvanoplastia, la fabricación de plásticos, las pinturas y la extracción

de oro y plata (Logue et al. 2010).

Todas estas actividades industriales generan residuos que deben ser tratados adecuadamente
para evitar posibles catástrofes ambientales por derrames accidentales (Johnson 2015).

Hay varios tratamientos químicos disponibles para el cianuro eliminación, la mayoría de los cuales
se basan en el uso de oxidación de sulfitos, H2SO5 o peróxido de hidrógeno (Kuyucak y Akcil
2013).
Además, también se han desarrollado tratamientos biológicos que se basan en el uso de
microorganismos y enzimas (Akcil 2003; Dash et al. 2009; Gupta et al. 2010). Con respecto a el uso
de enzimas para la biorremediación de desechos de cianuro, cianuro dihidratasa (CynD) y cianuro
hidratasa (CHT) han sido sugeridas como alternativas viables (Thuku et al.

2009; Martínková et al. 2015; Parque et al. 2017).

Sin embargo, la intolerancia de estas enzimas a los alcalinos pH (Jandhyala et al. 2005), condición
obligatoria para evitar volatilización del cianuro (Mekuto et al. 2016), presenta las principales

impedimento para la biodegradación enzimática del cianuro.

Las enzimas CynD son de origen bacteriano y tienen forma helicoidal.

estructuras cuaternarias que pueden alcanzar masas moleculares de más de 400 kDa (Park et al.
2017). La enzima CynD de Bacillus pumilus expresado recombinantemente en Escherichia coli

exhibe parámetros cinéticos que son similares a la enzima nativa (Jandhyala et al. 2003), tiene una
temperatura óptima cerca de 38 °C, es completamente inactivo a pH > 8.5, y es inhibida por Hg2+
(Jandhyala et al. 2005). Avances recientes en la ingeniería de proteínas produjo mutantes CynD
que muestran mayor tolerancia a un pH alcalino y termoestabilidad (Crum et al. 2015; Crum et al.
2016). Sin embargo, el pH más mutante tolerante retuvo el 40% de su actividad a pH 9.5 y estaba
inactivo a pH 10. Por lo tanto, un catalizador aún más robusto se requiere para la biorremediación
de aguas residuales con cianuro.

La inmovilización de estas enzimas o células enteras que las expresan en matrices poliméricas
puede permitir operaciones ventajas, como una mayor estabilidad a un pH muy alcalino, y otras
condiciones extremas asociadas con las soluciones industriales de cianuro. Así, exploramos las
características de complejos inmovilizados de células enteras de E. coli que expresan la Enzima
CynD de Bacillus pumilus en tres matrices de polímeros orgánicos: quitosano, poliacrilamida y
agar. Además, nosotros probó la capacidad de los complejos activos para degradar el cianuro libre
de una solución derivada de la industria de procesamiento de oro.
materiales y métodos

Medios de cultivo y reactivos

Todas las cepas bacterianas se cultivaron en caldo Luria-Bertani (LB) (Merck Millipore, Burlington,
MA, EE. UU.) o LB complementado con kanamicina (Gibco, Life Technologies, Grand Island, Nueva
York, Estados Unidos). Tris HCl, NaCN, KCN y TEMED se adquirieron de Thermo Fisher (Waltham,
MA, EE. UU.). Ácido pícrico, glicina, isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), EDTA, fosfato de
sodio, NaCl, glutaraldehído (50%), ácido acético (99,7%), quitosano (peso molecular medio), y la
base Tris se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). MOPS fue comprado de
Biomatik

(Wilmington, DE, EE. UU.). Los kits de minipreparación se compraron de Omega Bio-Tek (Norcross,
GA, EE. UU.). Agua MQ ultrapura se obtuvo utilizando un sistema Arium® Pro Ultrapure (Sartorius,
Göttingen, Alemania).

Cepas bacterianas y plásmidos

Las cepas bacterianas Escherichia coli DH5α, utilizadas para el ADN replicación, y Escherichia coli
BL21 (DE3), utilizado para proteínas producción, eran de Merck (Burlington, MA, EUA). Los la
secuencia del gen que codifica la cianuro dihidratasa (CynD) de Bacillus pumilus C1 de tipo salvaje
se optimizó por codones para E. coli, y clonado en el vector PD451 por DNA 2.0 (Atum, Newark,
CA,

USA) con una etiqueta de afinidad de hexahistidina en su región C-terminal.

Este plásmido, denominado PD451-BpumCynD, está disponible solicitud.

Expresión de CynD

Colonias individuales de E. coli BL21(DE3) transformadas con el plásmido PD451-BpumCynD se

cultivaron en medio LB para 16 h a 37 °C y 300 rpm. Los cultivos frescos se iniciaron con un
Dilución de 100 veces del cultivo de la noche a la mañana en medio LB fresco suplementado con
kanamicina a 25 μg/mL. Cuando el OD600nm alcanzó 0.5–0.9, los cultivos fueron inducidos con
IPTG 0,4 mM. Las células se recogieron 4 h después de la inducción por centrifugación durante 30
min a 4 °C y 5800 rpm utilizando un Centrífuga Eppendorf 5804R (Eppendorf, Hamburgo,
Alemania). Los sedimentos celulares se usaron inmediatamente o se almacenaron a - 80 °C hasta
su uso posterior. E. coli no transformada BL21(DE3) se cultivaron siguiendo un procedimiento
similar pero sin la adición de antibióticos o IPTG. Este cultivo sirvió como control negativo para la
degradación del cianuro. La expresión de CynD fue monitoreado por SDS-PAGE y cuantificado por
densitometría

utilizando un generador de imágenes Amersham Imager 600.

Inmovilización en quitosano

Para inmovilización de E. coli-CynD en esferas de quitosano, 0,3 g de quitosano se diluyó en una

solución de 10 mL de acético al 2% ácido. A esta solución se le resuspendieron 0,3 g de células en 1
mL de Se añadió tampón Tris-base 20 mM, pH 8,0. Esta mezcla fue se dejó caer en 50 ml de una
solución que contenía metanol e hidróxido de sodio 1 M (1:4) (Jyoti et al. 2017). Las esferas de
quitosano se recuperaron por filtración y se incubaron en un solución de glutaraldehído al 2%,
como agente intercalante, para 10 minutos. Además, para probar el efecto de la malla sobre la
actividad,

Se sintetizaron esferas sin glutaraldehído. las esferas se lavaron con tampón de fosfato de sodio
100 mM (pH 7,0) y almacenados a 4 °C en el mismo tampón. Para determinar si la difusión del
sustrato fue la causa de la baja actividad observada, la Se aumentó el tamaño de poro de las
partículas reduciendo el quitosano al 1%. Además, permeabilizado (5% tolueno, 6 mM Se usaron
EDTA en tampón Tris-base 50 mM pH 8,0) o células E. coli CynD sonicadas para la inmovilización en
quitosano.

Inmovilización en agar

Se realizó la inmovilización de E. coli-CynD en agar utilizando el método de Woodward (1988).

suspensiones celulares de 0,3 y 0,6 g de E. coli-CynD resuspendidos en 1 mL de solución al 0,9% Se
inmovilizó NaCl (p/v) por atrapamiento en agar al 0,4%. La solución de agar se enfrió a 50 °C antes
de agregar las células y la polimerización a temperatura ambiente, y la El gel resultante se
fragmentó en cubos de 0,7 × 0,7 mm. Para la producción de pequeñas perlas de agar, la
metodología de Se siguió a Ahamad y Kunhi (2011). En este caso, un Solución de agar al 0,4% en 4
mL de NaCl al 0,9% (p/v), mantenida a 50 °C, se mezcló con la suspensión celular de 0,6 g de E.
coli-CynD. Esta mezcla se dejó caer en 50 ml de agua fría KCl 0,2 M para obtener un tamaño de
hilo uniforme de 3–7 mm en diámetro. Tanto los cubos como las hebras se almacenaron en
Tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) a 4 °C.
Inmovilización en acrilamida

Suspensiones celulares de 0,3 y 0,6 g de E. coli-CynD en 1 mL de Se inmovilizaron tampón de

fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0) por atrapamiento en poliacrilamida mezclando con 1.875 μL de
monómeros de acrilamida y N,N-metilenbisacrilamida en un relación molar de 39:1, 50 μL de
persulfato de amonio al 10%, 3 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), y 4 μL de
TEMED. La reacción de polimerización se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. El gel
resultante fue fragmentado en cubos de 0,7 × 0,7 mm o perlas más pequeñas y almacenada en
tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) a 4 °C.

Determinaciones de actividad

Para la capacidad de degradación del cianuro libre, 0,3 g de cianuro libre o Se incubaron células E.
coli-CynD inmovilizadas con 5 mM NaCN en tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 8,0). Todos los
ensayos se realizaron a temperatura ambiente con constante mezclando Se tomaron alícuotas de
las soluciones en 30 min, y el contenido de cianuro se determinó usando metodología del ácido
pícrico. Se utilizaron concentraciones de cianuro para calcular el porcentaje de cianuro removido
por el catalizador.

Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Además, Los experimentos de actividad
de eliminación de cianuro se realizaron de forma gratuita. Células E. coli-CynD en presencia de
ácido acético al 2 % y ácido acético al 2 % glutaraldehído y para E. coli-CynD inmovilizada con
quitosano en la presencia de NaCl 1 M. Los experimentos de control incluyeron la determinación
de la eliminación de cianuro después de la adición de E. coli transformada con un vector vacío y la
adición de polímeros sin células.

Para estudios de velocidad inicial con E. coliCynD libre o inmovilizada, suspensiones celulares de
100 μL que contenían 0,092 mg de Se utilizaron proteínas totales. Para los ensayos cinéticos, el
soporte de poliacrilamida se fragmentó en pequeñas partículas para reducir su radio, y el soporte
de agar se polimerizó en KCl para obtener pequeños hilos. Las reacciones se realizaron en 1 mL de
las soluciones con diferentes concentraciones de cianuro. Cada reacción se llevó a cabo durante 5
min y se tomaron muestras cada minuto. Los variaciones en las concentraciones de cianuro con el
tiempo se utilizaron para calcular las velocidades de reacción iniciales. Gráficas de velocidad inicial
vs concentración de cianuro se ajustaron al Michaelis-Menten ecuación para obtener valores de
KM y Vmax.
Determinación de cianuro

La concentración de cianuro se determinó por el método de Fisher y Brown (1952). En este

método, la reacción producto entre el cianuro y el ácido pícrico se cuantifica en 520 nm, y se usa
una curva de calibración para determinar la concentración de cianuro en la muestra. La
concentración de cianuro se determinó utilizando una curva estándar que oscila entre 0 y cianuro
4,0 mM. Las muestras de las soluciones derivadas de los ensayos de actividad se mezclaron con
volúmenes iguales de ácido pícrico al 1% y carbonato de sodio 0,5 M. La reacción se incubó a 90 °C
durante 5 min y se detuvo mediante la adición de agua destilada. La absorbancia se midió a 520
nm con un

Espectrofotómetro GENESYS 10S (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La solución de ensayo
se diluyó cuando la concentración de la muestra fue > 4,0 mM, de modo que la absorbancia a 520
nm cayó dentro del rango lineal de la curva estándar.

El porcentaje de remoción de cianuro se calculó de la siguiente manera:

Cianuro inicial – Cianuro final

% remoción de cianuro = ---------------------------------------- X 100
Cianuro inicial
Reutilización
Para los experimentos de reutilización de E. coli-CynD inmovilizados en agar y poliacrilamida, se
inmovilizaron 0,3 g de células en cada soporte. Cada ciclo de reacción se llevó a cabo utilizando
una solución que contiene NaCN 5 mM y tampón Tris-base 20 mM (pH 8,0). El contenido de
cianuro en la solución se determinó después de 120 min de reacción usando la metodología del
ácido pícrico y los resultados se usaron para calcular el porcentaje de cianuro degradado. Después
de cada ciclo, se retiró el soporte sólido de la solución y lavado, y un nuevo ciclo de reacción fue
iniciado por la adición de NaCN 5 mM fresco en tampón Trisbase 20 mM (pH 8,0). Cuando no
estaba en uso, el sistema inmovilizado se almacenó en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0)
a 4ºC

Lixiviación de polímeros

La lixiviación de E. coli-CynD de los soportes de agar y poliacrilamida se probó utilizando el método

de Bagal y Karvé (2006). Para ello, se inmovilizaron 0,3 g de células en cada soporte se suspendió
en 5 mL de Tris-base 20 mM tampón (pH 8,0) durante 5 h. Luego, en ensayos independientes, 100
μL de la solución en la que se había suspendido cada polímero se ensayaron en 1 ml de NaCN 5
mM en Tris-base 20 mM tampón (pH 8,0). Después de 30 min de reacción, el porcentaje de
cianuro se determinó la degradación.

Actividad a pH alcalino

Para estos ensayos, 100 μL de suspensión de células E. coli-CynD que contenía 0,092 mg de
proteína total se utilizó libre o inmovilizado en gotas de agar y pequeñas poliacrilamida rosario. Se
prefirieron partículas pequeñas para minimizar el efecto de difusión sobre la actividad. La
actividad de CynD se probó usando soluciones de cianuro 5 mM en tampón Tris-base 20 mM pH
8,0 o tampón de glicina 20 mM a pH 9,0 y 10,0.

Las reacciones se realizaron en un volumen final de 1 mL, a temperatura ambiente temperatura y

con mezcla constante. Velocidades de reacción, en cada pH, se determinaron midiendo la
concentración de cianuro cada 2 min durante 10 min. Cada reacción se realizó por triplicado y la
concentración de cianuro se determinó utilizando el Método del ácido pícrico. Para E. coliCynD
libre o inmovilizada, la actividad se informó en relación con la de pH 8,0.

Biodegradación de aguas residuales industriales con cianuro

Las aguas residuales resultantes de un proceso de cianuración (solución estéril) se obtuvo de

Sociedad Minera del Sur S.A, una mina de oro ubicada en Buenos Aires, Cauca, Colombia. Para
biorremediación, 0,6 g de peso celular de E. coli-CynD fue inmovilizados en agar y
poliacrilamida.Los sistemas de inmovilización se agregaron a la solución estéril ya sea diluidos 30-
veces o sin diluir, y el contenido de cianuro se determinó 4 h después de la adición del catalizador.
El porcentaje de degradación del cianuro se calculó utilizando la concentración en un control
mantenido a condiciones similares pero sin la adición de catalizador

Caracterización fisicoquímica

La caracterización de los sistemas de E. coli-CynD inmovilizado en agar y poliacrilamida se llevó a

cabo por micrografía electrónica de barrido (SEM) realizada en el laboratorio de nanociencia y
nanotecnología de la Universidad Pontificia Bolivariana (Bucaramanga, Colombia) utilizando un
Microscopio Tescan MIRAN 3 FEG-SEM.

Software y secuencias
GraphPad Prism 7 se utilizó para el análisis cinético y la construcción de gráficos. El número de
acceso de GenBank para el El gen de la dihidratasa de cianuro C1 de Bacillus pumilus es AF492815.

Además, la secuencia de nucleótidos para el gen CynD, codón optimizado para la expresión en E.
coli y con un C-terminal etiqueta de seis histidinas, se depositó en GenBank en virtud de la
adhesión

número MH917689.

Resultados

Expresión de CynD en E. coli CynD se expresó eficientemente en E. coli, como lo demuestra el

presencia de una banda prominente alrededor de 38 kDa, la esperada peso molecular de CynD
(Fig. 1). La máxima expresión de CynD se produjo 4 h después de la inducción con IPTG, y en base a
análisis densitométrico, la enzima representa aproximadamente 20% del contenido proteico total
de E. coli.

Fig. 1 Análisis temporal de Expresión de CynD en células de E. coli.

Arriba: SDS-PAGE del contenido total de proteínas de E. coli-CynD.
Abajo: análisis densitométrico de la banda correspondiente a CynD (38 kDa) monitoreada en
diferentes tiempos después de la inducción con IPTG
Actividad de E. coli-CynD inmovilizada

La actividad de un biocatalizador inmovilizado puede verse influenciada por las características de

la matriz de inmovilización. Por lo tanto, se determinó la capacidad de las células inmovilizadas de
E. coli-CynD para degradar el cianuro en tres matrices orgánicas diferentes (Tabla 1). Después de
30 min de tiempo de reacción, E. coli-CynD inmovilizado en agar y poliacrilamida degradó
aproximadamente el 70% del cianuro contenido en la solución. En contraste, E. coli-CynD
inmovilizada en quitosano solo se degradó 9% del cianuro contenido en la solución. Se llevaron a
cabo experimentos posteriores para determinar las posibles causas de la baja actividad observada
para E. coli-CynD inmovilizada en quitosano y para caracterizar aún más los sistemas activos de E.
coliCynD en agar y poliacrilamida.

Caracterización cinética
La dependencia de la velocidad de reacción inicial de la concentración de cianuro mostró cinética
de saturación para libre y E. coli-CynD inmovilizada (Fig. 2). Los parámetros cinéticos para células
enteras de E. coli-CynD se informan en la Tabla 2. El El valor de Vmax se informa en relación con el
número de celdas completas utilizado en la reacción. El análisis cinético de inmovilizados E. coli-
CynD permite el cálculo de factores de efectividad estacionaria y operativa (Tabla 2). El
estacionario (η) y Los factores de efectividad operativa (η°) se pueden calcular de acuerdo con las
Ecs. 1 y 2, respectivamente (Buchholz et al. 2012). En la ecuación 1, Vimm es la velocidad del
catalizador inmovilizado, mientras que Vf representa la velocidad del catalizador libre. En la
ecuación. 2, el factor de eficacia operativa se calcula en función del tiempo requerido para la
misma cantidad de libre (t) e inmovilizado (ť) catalizador para llevar la reacción al 90% de
finalización.

η = Vimm / Vf Eq (1)

η = t / t´ Eq (2)
Fig. 2 Dependencia de la velocidad inicial de la concentración de cianuro para E. coli-CynD libre e
inmovilizada. Todos los ensayos se realizaron utilizando un solución de E. coli-CynD que contiene
0,092 mg de proteína total. Células libres (círculo), inmovilizado en agar (círculo negro), o
inmovilizado en poliacrilamida (triángulo negro). Las velocidades iniciales se calcularon mediante

monitoreando la concentración de cianuro cada minuto durante 5 min. Los símbolos representan el
promedio de tres repeticiones experimentales, y La línea representa el resultado de los datos
ajustados a la ecuación de Michaelis-Menten. La concentración de cianuro se determinó por el
método del ácido pícrico

Inmovilización de E. coli-CynD en quitosano

Durante los experimentos en los que se inmoviliza E. coli-CynD sobre quitosano, el medio se
acidifica con ácido acético para aumentar la solubilidad del polímero (Jyoti et al. 2017). En
Además, la estabilidad del polímero se puede mejorar con un agente de reticulación tal como
glutaraldehído. Aunque estos Los reactivos tienen el potencial de afectar la actividad de E. coli
CynD, a las concentraciones utilizadas en el proceso de polimerización, ni el ácido acético ni el
glutaraldehído afectaron la actividad de E. coli-CynD (Fig. 3).
a. La solución de ensayo contenía NaCN 5 mM, tampón Tris 20 mM (pH 8,0), y 0,3 g de células E.
coli-CynD inmovilizadas en cada matriz. Reacciones se realizaron durante 30 min a 25 °C. El
porcentaje de cianuro removido se determinó comparando el contenido de cianuro con un control
sin adición de cualquier biocatalizador. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos
independientes (n = 3). La concentración de cianuro se determinó por el método del ácido pícrico

b El cianuro eliminado por cada polímero se calculó en tres experimentos independientes.

Reportamos el valor promedio para los tres polímeros. La pérdida de actividad de E. coli-CynD
cuando se inmoviliza en el quitosano no parece estar relacionado con el tamaño de los poros,
porque ni la variación en el porcentaje de quitosano (de 1 a 3%) ni la ausencia de glutaraldehído
en la polimerización reacción aumentó la actividad catalítica (Fig. 3). Es más, fue imposible
aumentar la actividad de E. coli-CynD inmovilizado en quitosano usando permeabilizado o
sonicado células o por la adición de NaCl, el último de los cuales se añadió en un intento de reducir
las interacciones electrostáticas repulsivas.

Finalmente, se descartó que la falta de actividad en la matriz de quitosano se debió a la lixiviación

celular durante el proceso de inmovilización, porque no hubo evidencia de actividad enzimática en
las soluciones de polimerización (datos no mostrados).
Caracterización de E. coli-CynD inmovilizada en agar y poliacrilamida

Células de E. coli-CynD inmovilizadas en agar y poliacrilamida mostró una alta capacidad para
degradar el cianuro (Cuadro 1). Uno de Las ventajas de inmovilizar biocatalizadores es que
promueve su uso continuo, reduciendo los costos de operación. Usando una solución 5 mM de
cianuro a pH 8,0, el sistema E. coli-CynD inmovilizados en agar demostraron una alta reutilización
(Fig. 4). Sorprendentemente, en el ciclo 22, todavía podía degradar el 91% del cianuro añadido. Sin
embargo, para el ciclo 30, la remoción de cianuro la capacidad había disminuido a
aproximadamente el 60%. Además, un Se determinó una vida media de 30 días a 4 °C para este
sistema. Por el contrario, la reutilización de E. coli-CynD inmovilizado en poliacrilamida fue mucho
menor. La actividad de este sistema cayó rápidamente después de 5 ciclos. La pérdida de actividad
parecía estar asociado con una mayor lixiviación celular en el última matriz (Recurso en línea 1 Fig.
S1). En los procesos industriales, las soluciones de cianuro se mantienen a pH 10 o superior para
evitar la formación de HCN volátil (Johnson 2015). Para las células libres de E. coli-CynD,
observamos un clara pérdida de actividad a un pH > 9 (Fig. 5). La característica pérdida de
actividad a pH alcalino para la enzima purificada fue previamente informado (Jandhyala et al.
2005). En marcado contraste, E. coli- CynD inmovilizada en agar o poliacrilamida mantuvo altos
niveles de actividad incluso a pH 10 (Fig. 5).