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1.

Introduccin
Las lipasas (acilhidrolasa triacilglicerol, EC 3.1.1.3) se definen como hidrolasas de ster de glicerol
que catalizan la hidrlisis de los triglicridos a cidos grasos libres y glicerol, y actan en la
interfase entre el aceite y el agua ( Treichel et al., 2010 ). Como enzimas de superficie, su actividad
est muy influenciada por la zona interfacial ( Talukder et al., 2006 ). En entornos no acuosos
lipasas pueden revertir la reaccin para sintetizar triacilglicrido a partir de glicerol y cido graso
libre. Por lo tanto, las lipasas pueden catalizar una amplia gama de reacciones tales como
hidrlisis, interesterificacin, esterificacin, alcoholisis, acidlisis, y aminolisis ( Joseph et al.,
2008 ). Las lipasas son un importante grupo de enzimas con aplicaciones de la biotecnologa
pertinentes en las industrias de alimentos, lcteos, detergentes y productos farmacuticos.En la
industria alimentaria lipasas comerciales se utilizan para mejorar el sabor de los productos lcteos
y elaboracin de carne, verduras, zumos de fruta, etc. ( Singh y Mukhopadhyay 2012 ). A medida
que son indispensables para la bioconversin de los lpidos en la naturaleza, hay un mayor inters
para aplicaciones tcnicas establecidas de lipasas, as como para el completo nuevas reas de
aplicacin.
Aunque el metabolismo del carbono de los microorganismos se basa principalmente en hidratos de
carbono, la presencia de lipasas permite muchos microorganismos de utilizar fuentes de carbono
lipdicas. Como lpidos pueden membranas celulares no pasivamente transversales, que tienen
que ser degradados en cidos grasos libres fuera de la clula antes de cidos grasos libres son
absorbidos por la clula. Este proceso requiere que las lipasas microbianas son excretados en el
medio donde se hidrolizan los lpidos (Najjar et al., 2011 ). Muchos microorganismos secretan
lipasas incluyendo bacterias, hongos y levaduras se han aislado de ambientes ricos en lpidos. Sin
embargo, la produccin de lipasa a partir de levaduras permaneci un rea mucho ms descuidado
en comparacin con bacterias u hongos ( Ali et al., 2010 ).
Debaryomyces hansenii es una no patgena, osmotolerante y levadura oleaginosa lpidos
acumulando.Levaduras oleaginosas acumulan lpidos y contribuyen al metabolismo de los
lpidos. Por lo tanto la capacidad de D. hansenii para sintetizar, acumular y almacenar lpidos es
ventajoso para los procesos biotecnolgicos ( Breuer y Harms, 2006 ). Por otra
parte, D. hansenii es una levadura halfilas, a medida que crece ptimamente a 3-5% de sal (v /
w), y es capaz de crecer en concentraciones de cloruro de sodio hasta 2,5 M ( Breuer y Harms,
2006 y Prista et al., 2005 ) . La produccin de lipasa por D. hansenii ha sido escasamente
explorado ( Tak y Sengel, 2010 ). El incidense de D. hansenii en ambientes salinos y el
comportamiento peculiar de
Gnolevures D.hansenii para

esta levadura contribuy que el


secuenciar
y
anotar
su

consorcio seleccionado
genoma,
disponible

en http://cbi.labri.fr/Genolevures/ . El aumento de la produccin de lipasa por D. hansenii durante el


proceso de fermentacin es esencial para las aplicaciones industriales. Sin embargo no hay
resultados publicados se informan respecto a la mejora del proceso de fermentacin teniendo en
cuenta la variacin de los componentes del medio y sus interacciones.
Aceitunas salados secos son un tipo especial de aceitunas negras naturalmente llamado
"aceitunas saladas secas estilo natural negro Tasos", ya que se cultivan tradicionalmente en la isla
de Tasos en Grecia. Las aceitunas se cosechan completamente maduro y completamente de color

negro, se coloca en depsitos de hormign en capas con cloruro de sodio grueso en una
proporcin de hasta el 40% y gradualmente pierden agua y oleuropena (el compuesto fenlico que
hace que el sabor amargo de oliva). En 30 a 60 das, las aceitunas se convierten desamargada,
arrugada y comestible. La microflora del producto se compone de levaduras ( Panagou et al.,
2002 ).
Metodologa de superficie de respuesta (RSM) es una tcnica estadstica til para la investigacin
y optimizacin de procesos complejos. Es una coleccin de tcnicas matemticas y estadsticas, y
se utiliza ampliamente en diferentes procesos biotecnolgicos para estudiar los efectos de varios
factores que influyen en las respuestas variando simultneamente y llevar a cabo un nmero
limitado de experimentos.Diseo compuesto central (CCD) es un diseo de superficie de respuesta
muy utilizado cuando la regin experimental se define por los lmites superior e inferior de cada
factor y no se extendieron ms all de ellos (Neter et al., 1996 ). Una combinacin de factores
genera una cierta respuesta ptima se puede identificar.Adems, las interacciones significativas
entre las variables pueden ser identificados y cuantificados por esta tcnica. El proceso de
produccin de lipasa por Rhizopus delemar fue optimizado por RSM ( Aikel et al., 2010 ).
El presente trabajo tuvo como objetivo la optimizacin de los componentes del medio que mejoran
la produccin de lipasa por D. hansenii asla con la ayuda de RSM. Un CCD se emple para
optimizar las fuentes de carbono y de carbono lipdicas, as como el valor de pH del medio de
produccin, que tienen una influencia significativa en la produccin de lipasa y los resultados
fueron analizados por RSM.

2. Materiales y mtodos
2.1. El aislamiento y la deteccin de la produccin de lipasa levaduras
Las cepas de levadura con actividad lipoltica se aislaron a partir de aceitunas saladas secas de la
variedad de Tasos. Las muestras de 20 g de aceitunas obtenidos despus de la eliminacin de la
fosa se homogeneizaron durante 60 s con 180 ml de solucin salina estril (0,85 g / L NaCl) que
contena Tween 80 (1 ml / L) usando un Stomacher Lab-Blender 400 (Seward Medical, Londres,
Reino Unido). Diluciones apropiadas de los homogeneizados de muestras se inocularon en YMPG
(levadura-malta-peptona-glucosa) medio de agar (Difco, Becton Dickinson y Company, Sparks,
MD, EE.UU.) suplementado con oxitetraciclina y sulfato de gentamicina (Oxoid) como agentes
selectivos para las levaduras y incubados hasta 5 das a 27 C. Se seleccionaron un total de 97
colonias que muestran variaciones en la apariencia en agar YMPG (relativas superficie, textura,
forma, margen y dimetro) y se purific en el medio anterior. Los cultivos puros se observaron bajo
un microscopio de contraste de fase (Nikon Eclipse 50i, Japn) para distinguir la morfologa
celular. Para el mantenimiento y almacenamiento de los cultivos puros se utiliz YMPG agar, se
incubaron a 27 C y se almacen a 4 C.
Se estudiaron los 97 aislamientos para la actividad lipasa mediante el mtodo de agar de aceite de
oliva rodamina ( Kouker

y Jaeger, 1987 ) segn lo descrito por Rodrguez-Gmez et

al. (2010) . Cada cepa se cultiv en 5 ml de caldo de YMPG durante 24 h a 30 C. Despus de


centrifugacin a 12.000 g durante 10 minutos, los sedimentos celulares se lavaron dos veces en
50 mM de tampn de fosfato estril (pH 7) y se resuspendieron en 2 ml del mismo tampn

estril. Las cantidades de 10 l de toda la clula se colocaron en agar rodamina de aceite de


oliva. Despus de 48 h de incubacin a 30 C, las colonias se irradiaron con luz UV a 350 nm. La
aparicin de halos fluorescentes naranja alrededor de las colonias indica la produccin de lipasa.

2.2. Caracterizacin e identificacin de cepas de levadura


Los 20 aislamientos que muestran la produccin de lipasa fueron identificados a nivel de especie
de acuerdo con la metodologa y las caractersticas dada por Kotzekidou (1997) , y Psani
Kotzekidou (2006) y Suzuki et al. (2011) .

2.3. La produccin de lipasa por D. hansenii YLL29 en la cultura frasco de agitacin


La produccin de lipasa se estudi en matraces de 250 ml Erlenmeyer que contienen 50 ml de
medio basal con la siguiente composicin (g / L): extracto de levadura 5,0, K 2 HPO 4 4,0, MgSO 4
7H 2 O 1.0, peptona 10. El medio de produccin est compuesto por el medio basal suplementado
con diferentes concentraciones de glucosa y aceite de oliva mientras que el pH del medio se ajust
a diferentes valores (es decir, 5.5, 6.5, y 7.5). De acuerdo con la concentracin de aceite de oliva,
Tween 80 se aadi al medio de produccin en una concentracin de 20% (w / w) de aceite de
oliva. El medio se esteriliz a 121 C durante 15 min. Despus de enfriar, el medio de produccin
contenida en cada matraz se someti a sonicacin en un procesador ultrasnico de Vibra Cell
(Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, EE.UU.) que estaba equipado con una punta de micro
durante 30 s para crear una emulsin. Los matraces se inocularon con 10% de la cultura recin
preparada de D. hansenii YLL29 cultiva en caldo YMPG a 30 C durante 24 h. Los matraces se
incubaron a 30 C durante 72 h en un incubador agitador rotatorio (Lab Line Orbit-Environ Shaker,
Lab-Line Instr., Melrose Park, IL, EE.UU.) a 150 rpm. Los datos son la media de tres experimentos
independientes. Los datos fueron analizados por ANOVA y Tukey en = 0,05 utilizando el
software estadstico SPSS (SPSS Statistics 17.0, Chicago, IL, EE.UU.).

2.4. Diseo experimental y anlisis estadstico


Actividad de la lipasa se puede calcular como una funcin de los niveles de las tres variables
independientes (glucosa, aceite de oliva, de pH) con una influencia significativa en las variables de
respuesta. Cada parmetro tiene tres niveles: el valor mximo corresponde a 1, el mnimo a -1, y el
punto central a 0, como se muestra en la Tabla 1 A de segundo orden ecuacin polinmica, que
incluye todos los trminos de interaccin, se utiliza para. calcular la respuesta prevista:

donde Y representa la respuesta predicha, es decir, actividad de la lipasa (LA) liberado en el medio
de cultivo se expresa en U / ml, 0 es el intercepto, i coeficiente de primer orden, ii segundo
coeficiente de orden, ij el coeficiente de efecto de interaccin y x i , x j los niveles codificados de
las variables X i yX j investigado en experimentos. La variable X i se codific como x i de acuerdo
con la ecuacin: x i = ( Xi - X 0 ) / X i , donde x i es el valor de la variable codificada X i (sin
dimensiones), X 0 es el valor de X ien el nivel de punto central y el cambio de ritmo valor X i =

(nivel alto - bajo nivel) / 2. Se requiere la codificacin ya que los factores se expresan en unidades
distintas ( Tabla 1 ).

CCD es un diseo til para adquirir datos para encajar el polinomio anterior. A 2 3 diseo factorial
completo con seis repeticiones en el punto central que resulta en 20 experimentos se utiliz para
investigar las tres variables seleccionadas (es decir, glucosa, aceite de oliva y pH) para la
determinacin de los componentes del medio de produccin para la produccin de lipasa. Los
niveles de las variables ( Tabla 1 ) fueron elegidos despus de una serie de experimentos
preliminares. Los experimentos fueron diseados utilizando el paquete de software Statistica
(Statsoft, Tulsa, OK). El diseo experimental se presenta en la Tabla 2 . El diseo experimental se
repiti en tres repeticiones.

Los datos experimentales se sometieron a anlisis de regresin mltiple utilizando el programa


STATISTICA (Statsoft, Inc., Tulsa, OK) para obtener los coeficientes del polinomio de segundo
orden. ElF se utiliz la prueba para evaluar si el modelo fue significativo. Las mltiples coeficientes
de correlacinR y el coeficiente de determinacin R 2 se calcularon para evaluar el desempeo de
la ecuacin de regresin. Mediante el anlisis de la presentacin grfica de la ecuacin se
investig el comportamiento del modelo en la zona experimental. Los niveles ptimos de las
variables para obtener la mxima respuesta se denota por el vector X s = - B -1 b *, donde los
elementos de la matriz B son los coeficientes estimados en los trminos de segundo orden y los
elementos del vector b * son los coeficientes estimados de los trminos de primer orden ( Neter et
al., 1996 ). La prueba estadstica del modelo se llev a cabo en forma de anlisis de varianza
(ANOVA), que se requiere para poner a prueba la importancia y adecuacin del modelo. En la
parcela de Pareto de los efectos estandarizados, los efectos importantes se identifican
visualmente. Las barras corresponden a las magnitudes absolutas de los coeficientes efecto
estimado. Un efecto que supera la lnea vertical ( p = 0.05) puede ser considerado significativo.

2.5. Ensayo de la actividad lipoltica y la produccin de biomasa


Despus de 72 h de incubacin, se analiz el contenido de cada matraz. Todos los datos fueron
asumidos como los valores medios de tres experimentos independientes.
La determinacin de la actividad lipasa se basa en el procedimiento descrito por Tommaso et
al. (2011)con algunas modificaciones. Ensayo de lipasa se realiz usando aceite de oliva como
sustrato.Actividad de la lipasa se calcul por valoracin de los cidos grasos liberados de aceite de
oliva con lcali. La mezcla de ensayo contena 2 ml de aceite de oliva esterilizada por filtracin a
travs de filtro de nitrocelulosa con una porosidad de 0,22 micras (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.),
4,5 ml de 100 mM tampn fosfato pH 7, 0,5 ml de 100 mM CaCl 2 y 0,5 ml de sobrenadantes de
cultivo (12.000 g , 10 min).La mezcla se incub durante 30 min a 30 C con agitacin continua a
200 rpm. La reaccin enzimtica se detuvo mediante la adicin de 20 ml de etanol. Los cidos
grasos liberados durante la incubacin de la muestra y un ensayo en blanco llevado a cabo la
adicin de etanol directa despus de la adicin de la solucin de enzima, se determinaron
mediante valoracin con NaOH 50 mM en presencia de indicador de fenolftalena. Una unidad de
actividad lipasa se define como la actividad que libera 1 mol de cido graso libre por minuto bajo
las condiciones anteriores.
Diez muestras de un mililitro del caldo de fermentacin se filtraron a travs previamente pesado
discos de filtro Whatman GF / C (dimetro 47 mm). La biomasa recogida se lav dos veces con
agua destilada y despus con tres alcuotas (10 ml, cada uno) de n-hexano para eliminar posibles
restos de aceite residual; el filtro se sec a 105 C, durante 24 h hasta peso constante, se enfri
en un desecador y se pesa.

2.6. Lipasa y la produccin de biomasa por D. hansenii asla en condiciones


optimizadas
El 20 D. hansenii asla a partir de aceitunas saladas en seco de la variedad Thassos se cultivaron
en matraces de 250 ml Erlenmeyer que contienen 50 ml optimizados medio con la siguiente
composicin (g / L): extracto de levadura 5,0, K 2 HPO 4 4,0, MgSO 4 7H 2 O 1,0, peptona 10,
glucosa 13,1, aceite de oliva 19, Tween 80 3,8 y el pH se ajust a 6,4. El medio se esteriliz a 121
C durante 15 min. Despus de enfriar, se someti a sonicacin el contenido de cada matraz,
inoculadas

incubadas

en

un

incubador

agitador

rotatorio

como

se

describe

anteriormente. Actividad de la lipasa y la biomasa seca se determinaron como se ha descrito


anteriormente. Todos los datos fueron asumidos como los valores medios de tres experimentos
independientes. Los datos fueron analizados mediante un anlisis de varianza (ANOVA) y
procedimientos de comparacin mltiple por parejas (prueba de Tukey a = 0,05) utilizando el
software estadstico SPSS (SPSS Statistics 17.0, Chicago, IL, EE.UU.).

3. Resultados y discusin
3.1. El aislamiento, la identificacin y seleccin de la produccin de lipasa
levaduras

Aceitunas salados secos de variedad Tasos se han seleccionado como un biotopo para el
aislamiento de la produccin de lipasa levaduras debido a que el producto cumple con los
siguientes requisitos: las cepas tienen una larga tradicin como levaduras de grado alimenticio, ya
que son parte de la microflora de un alimento tradicional del producto y la enzima producida puede
ser generalmente reconocidos como seguros (GRAS), que es particularmente atractivo para la
lipasa utilizada en la industria cosmtica alimentos, productos lcteos, y farmacutica.
Un total de 97 colonias de levaduras se aislaron a partir de muestras de olivo, incluidos los
representantes de todos los tipos de colonias visto. De las 97 cepas evaluadas, 20 cepas de
levaduras mostraron una mayor actividad de la lipasa en rodamina agar de aceite de oliva. Las
cepas anteriores se realizarn las pruebas de 32 caracteres morfolgicos y fisiolgicos e
identificados como D. hansenii (Kotzekidou de 1997 , Psani y Kotzekidou de 2006 y Suzuki et al.,
2011 ). Las caractersticas bioqumicas y tecnolgicas de los 20 aislamientos con aumento de la
actividad de la lipasa caracterizado como D.hansenii se presentan en la Tabla 3 . Una
caracterstica importante de las 20 cepas aisladas es la capacidad de adaptarse a condiciones
ambientales rigurosas, es decir, baja temperatura (las cepas fueron capaces de crecer a 4 C), y
alta concentracin de sal. Las principales caractersticas de la D.hansenii son que el
microorganismo crece ms rpido en presencia de hasta 1 M de NaCl debido al aumento en la
fluidez de la membrana de plasma como consecuencia del aumento de insaturacin de los cidos
grasos a concentraciones de NaCl superiores en comparacin con menor concentracin de sal
( Turk et al., 2007 ).

La cepa de levadura que forma el ms intenso de halo fluorescente naranja alrededor de las
colonias en agar rodamina de aceite de oliva (es decir, D. hansenii YLL29) fue seleccionado para
experimentos de optimizacin de la produccin de lipasa. Los resultados preliminares mostraron

que las condiciones de crecimiento tales como la disponibilidad de fuentes de carbono y nitrgeno,
la presencia de agentes tensioactivos, la temperatura de incubacin, pH, nivel de inculo y la
aireacin influir en la produccin de la lipasa extracelular.

3.2. La produccin de lipasa en la cultura frasco de agitacin


La produccin de lipasa se llev a cabo en cultivos de matraz agitado como la tasa de aireacin
mejorada favorece la produccin de enzimas extracelulares por los organismos aerobios. Los
experimentos preliminares mostraron que la aireacin es esencial para la produccin de lipasa y la
actividad ms alta se obtiene en cultivos de matraz agitado en comparacin con cultivos estticos.
La adicin de glucosa en el medio de produccin era esencial para lograr una alta produccin de
biomasa, que es un requisito previo para la produccin de lipasa; a fin de lograr la mxima
produccin de lipasa el microorganismo debe crecer y producir o liberar la lipasa en las condiciones
de crecimiento imperantes. Lee et al. (2007) encontraron glucosa como la mejor fuente de carbono
para la produccin de lipasa. Considerando que, aumento de la actividad de la lipasa se logr
por Candida cylindracea Y-17506 en un medio lquido optimizado donde la glucosa se haba
utilizado como nica fuente de carbono ( Muralidhar et al., 2001 ). La produccin de lipasa se
induce en presencia de aceite de oliva a partir del cual se libera el cido oleico ( Dalmau et al.,
2000 ). Por lo tanto, es evidente que la glucosa y el aceite de oliva son componentes esenciales
para el crecimiento y la secrecin de lipasa. Como se aadi tensioactivo Tween 80 (monooleato
de polioxietilensorbitn) en el medio de produccin en una proporcin de 20% (w / w) de aceite de
oliva como experimentos preliminares mostraron que esta fue la proporcin ptima debido a mayor
concentracin de Tween 80 se prob para inhibir la actividad de la lipasa . Tween 80 es un
detergente de polioxietileno no inico, la parte hidrfoba de los cuales por lo general consta de una
cadena de alquilo, y la parte hidrfila est hecha de unidades de xido de etileno no cargado
( Helisto y Korpela, 1998 ). Tween 80 estimula la biosntesis y la secrecin de lipasa, ya que
aumenta la permeabilidad celular y facilita la exportacin de lipasa a travs de la membrana celular
(Dalmau et al., 2000 ). Ultrasonidos se ha aplicado al medio de produccin con el fin de dispersar
eficazmente el sustrato. En el sistema de ultrasonidos de la zona interfacial es mejorada mediante
la formacin de una emulsin de microgotas acuosas en un sistema bifsico ( Talukder et al.,
2006 ). La actividad enzimtica depende altamente de la propiedad de "interfacial-activacin", que
puede ser descrito como la mejora de la actividad de la lipasa cuando se expone a la interfaz
aceite-agua.

3.3. Optimizacin de la produccin de lipasa


El objetivo de la investigacin fue la optimizacin de la produccin de lipasa extracelular
por D. hanseniicepas aisladas de un producto rico en aceite de oliva y el aumento de la
concentracin de sal. Se evaluaron diferentes fuentes de nitrgeno y carbono, as como la
temperatura de incubacin y el pH del medio de produccin. La simple estrategia de optimizacin
de una en un tiempo se aplic para la seleccin de las variables de proceso que conforman el
mayor impacto en el proceso. Despus de los estudios preliminares de glucosa, aceite de oliva y el

pH fueron seleccionados como componentes del medio de produccin para el proceso de


optimizacin.
RSM se adopt para optimizar el medio con el fin de obtener un aumento de la actividad
lipasa. Diseo estadstico de experimentos ofrece metodologa eficiente para identificar las
variables significativas y para optimizar los factores con el nmero mnimo de experimentos. CCD
se utiliza como una herramienta muy til para determinar el nivel ptimo de los componentes del
medio y pH, as como su interaccin. Los niveles mnimos y mximos de cada parmetro
(concentracin de glucosa, la concentracin de aceite de oliva y pH) se determinaron despus de
los experimentos preliminares. En el medio basal se aadieron la concentracin mxima de
glucosa y aceite de oliva o mnimo, el pH del medio se ajust a valores de 4,5, 5,0 y 7,5 y la
actividad de la lipasa se determin despus de incubacin a 30 C durante 72 h. A
concentraciones de glucosa de aceite de oliva mnimo y cuando el valor de pH del medio de
produccin fue de 4,5 o 5,0 la actividad de la lipasa determinada era insignificante o muy baja, por
lo que el intervalo de pH ensayado fue 05/05 a 07/05. Las concentraciones de glucosa y aceite de
oliva y los valores de pH investigados por su efecto sobre la produccin de lipasa
por D. hanseniiYLL29 se presentan en la Tabla 1 . La actividad de la lipasa determinada despus
de la incubacin a 30 C durante 72 h se presenta en la Tabla 2 . Como se muestra en la Tabla 2 ,
se detect la actividad ms alta y la ms baja de la lipasa en los medios 6 (LA 10,12 U / ml) y 1 (LA
3,25 U / ml), respectivamente. Los datos se ajustaron por la siguiente ecuacin polinmica de
segundo orden, que representa la lipasa producida por D. hansenii YLL29.

donde LA es la lipasa producida por ml del medio de produccin como una funcin de la
concentracin de glucosa y aceite de oliva (en g / L) y el valor pH.
La bondad de ajuste de la ecuacin de regresin se evalu mediante el coeficiente de correlacin
( R ) y el coeficiente de determinacin ( R 2 ). El modelo de segundo orden anterior es adecuado
predictor de los resultados experimentales como el valor de R

(0,98) indica una buena

concordancia entre los valores experimentales y predichos. El valor de determinacin R

(0,96)

indica que el modelo de respuesta puede explicar el 96% de las variaciones totales. El valor del
coeficiente de determinacin ajustado (

) Era lo suficientemente alto para indicar la

importancia de la modelo. De acuerdo con el correspondiente anlisis de la varianza (ANOVA) del


modelo de regresin de la F -test para la regresin fue significativa a un nivel de 5% ( p <0,05).
Los efectos estandarizados de las variables independientes y sus interacciones sobre la variable
dependiente fueron investigados por la preparacin del diagrama de Pareto ( Fig. 1 ). Los
coeficientes positivos para los componentes del modelo ( X

,X

,X

favorable o sinrgico sobre la produccin de lipasa por D. hansenii


coeficientes negativos para los componentes del modelo (

) Mostr un efecto

YLL29, mientras que los

X 1 X 2 y X 2 X 3 ) indicaron un

efecto desfavorable sobre la produccin de lipasa. La interaccin de la glucosa y el aceite de oliva


era el efecto ms significativo, seguido por el efecto lineal de aceite de oliva. Adems de las

observaciones anteriores, como se muestra en la Fig. 1 el efecto cuadrtico del valor de pH tuvo
una influencia positiva significativo sobre la actividad de la lipasa lo que significa que una pequea
variacin en el pH se altera la produccin de lipasa en una medida considerable. La produccin de
lipasa por Pichia lynferdii Y-7723 aument proporcionalmente con el pH hasta el valor ptimo (pH
7,0) y se redujo drsticamente a partir de entonces ( Kim et al., 2010 ).Efectos lineales de glucosa y
aceite de oliva son altamente significativa para la produccin de lipasa porD. hansenii YLL29 ( Fig.
1 ) y explican que pueden actuar como una limitacin de nutrientes y la variacin sutil en sus
concentraciones alterar la produccin de lipasa. El hecho de que la barra para la interaccin de la
glucosa y pH ( X 1 X 3 ) se mantuvo dentro de la lnea de referencia, y el coeficiente ms pequeo
para este trmino en comparacin con los otros trminos de la ecuacin. (1) , indic que este
trmino contribuy al menos en la prediccin de la produccin de lipasa por D. hansenii YLL29.

El contorno y tridimensionales parcelas de interacciones entre las variables anteriores mostraron


un aumento en la produccin de lipasa como la concentracin de aceite de oliva aument hasta 19
g / L (Fig. 2 a) y la concentracin de glucosa incrementado hasta un nivel ptimo, es decir, 13,1 g /
L ( Fig. 2 b) por el aumento de pH hasta el nivel mximo. En la Fig. 2 c presentando la interaccin
de aceite de oliva y la glucosa mxima prevista rendimiento lipasa se indica por la superficie
confinado en la elipse ms pequea en el diagrama de contorno. Los grficos de contorno
hiperblicos en la figura. 2 A y B (silla de montar o contornos minimax) indican que el centro no es
ni un mximo ni un punto mnimo. De dos dimensiones grficos de contorno son las
representaciones grficas de la ecuacin de regresin y ayuda en la identificacin de las
interacciones entre las variables de la prueba. Las formas de los trazados de contorno
proporcionan una medida de la importancia de las interacciones mutuas entre las variables. Cada
curva de contorno representa un nmero infinito de combinaciones de las dos variables de la
prueba (es decir, aceite de oliva y glucosa con pH mantenido en el valor ptimo). El grfico de
contorno elptico en la figura. 2 c indica una interaccin significativa entre la glucosa y la
concentracin de aceite de oliva. Fig. 1 y Fig. 2 muestran que el aumento de las concentraciones

de glucosa y de aceite de oliva tuvo influencia positiva en la produccin de lipasa hasta que el valor
ptimo; mientras que el aumento de las concentraciones de los constituyentes anteriores tenido
influencia significativamente negativo en la produccin de lipasa.

Los niveles ptimos predichos de las variables de la prueba, a saber, glucosa, aceite de oliva y el
pH se obtuvieron mediante la aplicacin de anlisis de regresin de la Ec. (1) . Los niveles ptimos
para D.hansenii YLL29 fueron los siguientes: glucosa 13,1 g / L, aceite de oliva 19 g / L, pH 6,4 con
la actividad de la lipasa correspondiente 7,59 U / ml. Verificacin del valor predicho se llev a cabo
mediante el uso de condiciones ptimas en experimentos de inoculacin. Tres experimentos
repetidos se realizaron bajo las condiciones ptimas previstas. El valor medio de la actividad de
lipasa fue 7,44 U / ml, que es en excelente acuerdo con el valor predicho (7,59 U /
ml). Optimizacin result en aumento de 2,28 veces en la produccin de lipasa en comparacin
con las condiciones no optimizadas ( Tabla 2 , funcionamiento 1: 3,27 U / ml).
Con el fin de comparar visualmente los datos predichos y observados, los valores predichos
representan frente a los valores observados como se muestra en la Fig. 3 . Los resultados
corroboraron la validez del modelo tal como tambin lo indica el factor de sesgo calculado ( B f =
1.00) que es una medida del acuerdo general entre los valores pronosticados y observados ( Ross,
1996 ). El modelo se puede considerar bastante fiable para predecir la produccin de lipasa
de D. hansenii YLL29.

Para las 20 cepas de D. hansenii aislado a partir de aceitunas saladas en seco de la variedad
Thassos dotado con alta produccin de lipasa en rodamina agar de aceite de oliva, se utiliz el
medio optimizado para la lipasa y la produccin de biomasa en cultivos en matraz de agitacin
durante 72 horas a 30 C.Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 4 . No hubo
diferencias estadsticamente significativas entre la D. hansenii aislados sobre la actividad de la
lipasa y la produccin de biomasa.Aunque las cepas YLL3, YLL17, YLL19, YLL21, YLL29, YLL30,
YLL31, YLL33, YLH91 no difirieron significativamente en la produccin de lipasa, hubo diferencias
estadsticamente significativas ( p <0,05) entre las cepas anteriores sobre la produccin de
biomasa ( Tabla 4 ). La cepa D. hansenii YLL29 mostr tanto la ms alta produccin de lipasa y
tambin el ms alto de la biomasa en comparacin con las otras cepas que indican que la
produccin de lipasa se asocia crecimiento. La actividad de la lipasa ms bajo de las cepas
investigadas era 6,00 U / ml y el ms alto 7,44 U / mL. Actividad lipoltica bajo se obtuvo por
un D. hansenii cepa aislada a partir de residuos de una industria lechera ( Prista et al., 2005 ).La
actividad de la lipasa ms alto detectado utilizando Candida cylindracea NRRL Y-17506 creciendo
sobre aguas residuales de oliva molino suplementado con NH 4 Cl (2,4 g / L) y aceite de oliva (3,0 g
/ L) fue 9,23 U / ml ( D'Annibale et al. , 2006 ). En un medio de la incorporacin de suero de queso,
un co-producto de cervecera, extracto de levadura, extracto de malta, Tween 80 y aceite de oliva
una actividad de lipasa de 20,2 U / ml se logr por Candida rugosa ( Tommaso et al., 2011 ). Como
lipasas son diseadas por la naturaleza para la hidrlisis de los enlaces ster en trigliceroles en la
presencia de exceso de agua sus usos industriales son enormes ya que contribuyen a ahorrar
energa y minimizar la degradacin trmica durante la hidrlisis.

4. Conclusin
Diseo y anlisis de superficie de respuesta compuesto central eran tiles para determinar los
niveles ptimos de las variables de proceso que influyen significativamente en la produccin de
lipasa por D.hansenii aislado de aceitunas saladas secas de la variedad de Tasos. La produccin
mxima de la lipasa era una funcin de la estrecha interaccin entre la concentracin de glucosa y
aceite de oliva y el pH inicial del medio. Los resultados corroboraron la validez y la eficacia del
modelo, como los enfoques estadsticos demostraron ser adecuados en la prediccin de la
composicin del medio de produccin ptima para la mxima produccin de lipasa. El
20 D. hansenii aislamientos mostraron una mayor actividad de la lipasa que crecen en el medio
optimizado. La cepa D. hansenii YLL29 mostr tanto la ms alta de la lipasa y la produccin de
biomasa que indica que es una cepa adecuada para los estudios de escalado para alcanzar una
explotacin comercial del proceso por lotes.