UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

Informe de prácticas – II FASE

CURSO: BIOQUÍMICA

DOCENTE DEL CURSO:

Dr. Carlos Eitel Iván Paz Aliaga

INTEGRANTES:

 ALLISON NICOLE LLERENA CANEO

 CLAUDIA LUCÍA MARTÍNEZ PASTOR
 MICAELA BELÉN MERMA PAULI
 BRENDA YANELA MUÑÓZ CORNEJO
 HAROLD ARTURO SALVADOR NINA BENAVIDES
 ADRIANA BEATRIZ ORTIZ MOSCOSO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

SEMESTRE I
AREQUIPA – 2021
 DIGESTION

RELACION DE EXPERIMENTOS.

1. Hidrólisis enzimática del almidón. Acción de la amilasa salival.

2. Digestión de triglicéridos de la leche.
3. Digestión de la ovoalbúmina. Acción de la pepsina y tripsina.

OBJETIVOS.

1. Conocer la manera cómo actúa la amilasa salival sobre el almidón

2. Reconocer el requerimiento de sales biliares para una acción eficiente de la lipasa
pancreática sobre los triglicéridos.
3. Evaluar la necesidad de condiciones óptimas de pH para la buena actividad de
pepsina y tripsina para la degradación de proteínas.

INTRODUCCION.

Los Carbohidratos son moléculas formadas por C:H:O en proporción 1:2:1, químicamente
están formados por moléculas no hidrolizables, solubles en agua y de sabor dulce como los
monosacáridos, tienen función energética (4 Kcal./g) y algunos, función estructural (por
ejemplo la celulosa. Los monosacáridos son compuestos de 3 a 7 carbonos, en los que uno
de los átomos de carbono está unido por un doble enlace a un átomo de oxígeno, formando
un grupo carbonilo, y cada uno de los demás átomos de carbono posee un grupo alcohol. El
grupo carbonilo puede estar en un carbono terminal, formando una aldosa (monosacárido con
grupo aldehído), o bien en otro carbono formando una cetosa (monosacárido con un grupo
cetona), que normalmente se sitúa en el segundo carbono. En muchos casos, los
monosacáridos adquieren una forma cíclica. En el caso de la glucosa, el grupo carbonilo
reacciona con un grupo alcohólico de la propia molécula.

Los disacáridos y polisacáridos resultan de la unión de dos moléculas de monosacáridos ejem

maltosa (glucosa + glucosa); lactosa (glucosa + galactosa). o sacarosa: (glucosa + fructosa).
Los polisacáridos: resultan de la unión de n moléculas de monosacáridos liberándose (n-1)
moléculas de agua: existen los polisacáridos de reserva como el almidón en vegetales y
glucógeno en animales. o polisacáridos estructurales: la celulosa

Los lípidos presentan una composición química variada, son insolubles en agua y solubles
en compuestos orgánicos. Tienen funciones energéticas (9 Kcal./g), se utilizan a largo plazo
(ahorran espacio y peso). Los seres vivos primeramente utilizan los glúcidos para obtener
energía.

Se clasifican en glicéridos: grasas (sólidos) y aceites (líquidos). Son ésteres de glicerina y

ácidos grasos. Los más importantes son los triglicéridos. En los enlaces éster se liberan
moléculas de agua, por lo tanto, son compuestos hidrolizables. Los fosfolípidos forman la
membrana plasmática. Son moléculas anfipáticas, con un polo hidrófobo y otro hidrófilo,
formando bicapas lipídicas. Entre los esteroides el más importante es el colesterol, que
influye en las estructuras celulares, y son precursores hormonales.

La digestión y absorción, son las etapas previas que deben experimentar los carbohidratos,
lípidos y proteínas, que son los principales componentes de la dieta del hombre, para ser
incorporados al organismo.

De las sustancias que componen los alimentos, sólo, el agua, las sales inorgánicas, las
vitaminas, algunos lípidos y monosacáridos pueden ser utilizados directamente por el
organismo. La mayoría de los componentes que se ingieren en la dieta deben ser sometidos
a un proceso de degradación que se conoce con el nombre de digestión. Durante este proceso
las moléculas complejas presentes en los alimentos son descompuestas en sustancias más
simples, que el organismo puede incorporar y utilizar. Esta degradación se cumple mediante
reacciones de hidrólisis, catalizadas por enzimas presentes en los jugos digestivos.

Cuando se obtienen por la digestión, moléculas sencillas, éstas ingresan a la circulación

sanguínea mediante un proceso de absorción a nivel de la mucosa intestinal. Este proceso no
es simplemente una difusión de sustancias de bajo peso molecular a través de las membranas
celulares permeables, sino que éste es el resultado de un proceso selectivo.
Hidrólisis enzimática del almidón.
 El almidón es un hidrato de carbono ampliamente distribuido en las plantas, donde se
encuentra constituyendo gránulos envueltos en una fina membrana de celulosa. Estos
gránulos no son solubles en el agua, pero al romperse la pared de celulosa por trituración o
por calentamiento, se libera el almidón soluble. Si la solución en caliente es muy concentrada,
al enfriarse se transforma en un gel. El almidón es en realidad una mezcla de dos
polisacáridos: Amilosa y amilopectina. La amilosa es un polímero lineal formado por
moléculas de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa 1 – 4 . La amilopectina es un
polímero ramificado constituido por moléculas de glucosa, que se unen por enlaces alfa 1 –
4 y alfa 1 – 6. La hidrólisis de los enlaces glicosídicos del almidón es catalizada por ácidos,
así como por enzimas, dentro de estas últimas, podemos mencionar a la amilasa salival.

La amilasa salival, es una endoamilasa que hidroliza los enlaces 1 – 4 , presentes en el

interior de la molécula del almidón, obteniéndose como productos fundamentalmente
maltosa. Se producen además escasos residuos de maltotriosa, glucosa y unas estructuras
ramificadas llamadas dextrinas límite, que presentan enlaces 1 – 6, los cuales no son
hidrolizados por la amilasa salival. En la degradación del almidón por la amilasa salival se
obtienen los siguientes intermediarios:

Almidón

Almidón soluble

Dextrinas superiores + Maltosa + Maltotriosa

Eritrodextrinas + Maltosa + Maltotriosa

Acrodextrinas + Maltosa + Maltotriosa

Maltosa + Glucosa en pequeña cantidad

 El control de la degradación del almidón se realiza mediante las reacciones del yodo y
del Benedict cualitativo; la primera es positiva para los polisacáridos, mientras que la
segunda identifica al azúcar reductor que se forma.

PARTE EXPERIMENTAL

1. DIGESTIÓN DE CARBOHIDRATOS

Obtención de la amilasa salival:

a) Enjuagarse la boca con agua de caño.

b) Mantener en la boca unos 20 ml de agua destilada tibia durante 2 minutos y
vaciarla luego en un beaker.
c) Filtrar esta solución por una gasa y mantenerla en hielo hasta el momento de
usar.

Preparación de la solución de digestión.

a) Colocar 25 ml. de una solución de almidón soluble al 1 % en un Erlenmeyer

pequeño y añadir 3 ml de la solución de amilasa salival.
b) Tomar inmediatamente una alícuota con la cual se deberá realizar la reacción de
yodo y benedict, representando esta muestra, el tiempo cero.
c) El resto de la solución de digestión, se le incuba a 37 ºC por 30 minutos,
tomando alícuotas cada 30 segundos para la reacción de Yodo y cada 5 minutos
para la reacción de Benedict.

Reacción de Yodo.

 Rotular 10 tubos y medir en cada uno de ellos:

 HCl 0.05 N 2.50 ml.
 Solución de Yodo 0.25 ml.
 Solución de digestión 0.25 ml.
 Dejar en reposo, observar e interpretar los resultados:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Observ Azul Celeste Morado Violeta Rojo Rosado Anaranjado Anaranjado amarillo Blanco
Color intenso claro

Reacción de Benedict.
 Rotular 6 tubos y medir en cada uno de ellos:
 Reactivo de Benedict 2.50 ml.
 Solución de Digestión 0.25 ml.
 Colocarlos en baño hirviente por 5 minutos.
 Observar los resultados e interpretar.

Tubo 1 2 3 4 5 6
Azul Poco Aumento de Aumento de Más Mucho
precipitado precipitado precipitado precipitado precipitado
rojo rojo rojo rojo rojo

2. DIGESTIÓN DE LOS TRIGLICÉRIDOS DE LA LECHE.

Los lípidos se caracterizan por ser insolubles en el agua, lo cual constituye un problema
para la digestión, ya que los sustratos no son fácilmente accesibles a las enzimas digestivas
de la fase acuosa. Además, si los lípidos ingeridos se hidrolizan en constituyentes más
simples, estos tienden a agregarse en complejos mayores, lo cual dificulta su absorción. Estos
problemas se pueden superar mediante el aumento del área lipídica y por solubilización de
los productos de hidrólisis con detergentes.

La digestión de las grasas, en el organismo ocurre por acción de las lipasas, las cuales
requieren de un agente solubilizante, las sales biliares y de una proteína la colipasa que
permite la interacción de la lipasa con los triglicéridos que se encuentran en la parte interna
de la micela.

Fundamento.
 La digestión de los Triglicéridos da como resultado: - monoglicéridos, diglicéridos y
ácidos grasos, éstos últimos pueden ser determinados por titulación con hidróxido de sodio.

Procedimiento.

a) Colocar en 2 Beakers 10 ml de leche y 1 ml de extracto de lipasa (solución de

pancreatina), en cada uno de ellos.
b) A uno de ellos se le añade 1 ml de agua y al otro 1 ml de bilis. Mezclar rápidamente.
c) De cada beaker se toma 2 ml. y se colocan en 2 beakers respectivamente y se añaden
dos gotas de fenoltaleina y se titula con NaOH 0.01 N hasta la aparición de una
coloración rosada débil.
d) Anotar los ml. gastados y hacer los cálculos.
e) La mezcla que quedó después de retirar los 2 ml. se incuba en baño maría a 37 ºC por
una hora.
f) Transcurrido el tiempo de incubación, tomar nuevamente 2 ml. de cada beaker de
incubación y titularlos del modo antes descrito.
Determinar el Nº de mEq de ácidos grasos provenientes de la digestión de 100 ml.
de leche pura.

ml. de NaOH 0.01 N gastados meq. de Ac. grasos / 100 ml de

leche pura
Leche + agua Leche + bilis Leche + agua Leche + bilis
Muestra Basal 0.65 0.70 6,5 x 10 -3 7 x 10 -3
Muestra Incubada 0.75 2.50 7,5 x 10 -3 0,025

3. DIGESTIÓN DE LA OVOALBÚMINA.

Pepsina y tripsina son enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos, que se encuentran en el
interior de la molécula de proteína. Pepsina hidroliza enlaces peptídicos en los cuales
participan los aminoácidos aromáticos y leucina y que aportan el grupo amino para formar el
enlace peptídico. Tripsina hidroliza los enlaces peptídicos en los cuales el grupo carboxilo
es aportado por la arginina o lisina.
 El sustrato utilizado para estudiar estas dos enzimas es la ovoalbúmina, proteína globular
presente en la clara del huevo.

Parte experimental.

a) Tomar 4 tubos de ensayo y medir en cada uno de ellos 5 ml de albúmina de huevo.

b) Incubar en baño de agua a 37 ºC durante 5 minutos.
c) Después de este periodo de incubación añadir los siguientes reactivos, como se indica
a continuación:

Tubo Nº 1 2 3 4
Tripsina 0.5 ml. 0.5 ml. ------- -------
Pepsina ------- ------- 0.5 ml. 0.5 ml.
Buffer fosfato pH 8.6 ------- 3.0 ml. 3.0 ml. -------

HCl 0.1 N 4.5 ml. ------- ------- 4.5 ml.

Agua destilada ------- 1.5 ml. 1.5 ml. -------

d) Mezclar bien; continuar la incubación a 37 ºC

e) Observar cada 10 minutos la turbidez o aclaramiento de cada tubo. Incubar por 20
minutos.

Tubos 1 2 3 4
10 min. - + - +

20 min. - +++ - +++

30 min. - +++++ - +++++
INTERROGANTES.

1. Explique por qué los diferentes tubos toman esas coloraciones, tanto en el
experimento del lugol como en el de Benedict.
_En el experimento con YODO, los tubos toman esas coloraciones porque nos permiten
observar como el almidón está siendo catalizado. En el tubo 1: es azul porque el almidón
con el yodo da azul. En el Tubo 2: Da un azul menos intenso porque la amilosa se está
degradando (es la más fácil de degradar). En el Tubo 3: toma un color morado porque
cuando hay amilosa y amilopectina se mete a los dos, pero aquí ya hay poca amilosa y se va
a proyectar más la amilopectina (roja que junto al azul da morado). En el Tubo 5: toma
color rojo porque ya no hay amilosa, solo amilopectina que se sigue digiriendo. Y
finalmente en el Tubo 9: ya no hay reacción y el color es amarillo por el color del yodo.

En el experimento con Benedict, comienza a tomar ese color rojo ladrillo en el precipitado.
Eso indica que a más precipitado, más azúcar se ha formado. El precipitado aumenta
porque la amilosa está liberando maltosas y maltotriosas. __
2. ¿Qué enzimas se encargan de romper los enlaces 1–6 ?
__Las Isomaltasa________

3. ¿Dónde se completa la digestión de los oligómeros residuales, luego de la acción de

las amilasas? ¿Qué enzimas participan?
_ Se completa en la membrana del borde en cepillo de las células epiteliales del intestino
delgado. Participan las enzimas lactasa, maltasa y sacarasa. _____

4. ¿Qué es un azúcar reductor?

___Es aquel que tiene su carbono reductor libre. En el caso de las aldosas es el carbono
1, y en el caso de las cetosas es el carbono 2. Tiene la capacidad de liberar hidrógenos. _

5. ¿En qué consiste la intolerancia a la lactosa? ¿Por qué se presentan sus síntomas?
__Es una patología genética generada por la falta de lactasa en el organismo. Puede ser
también influenciada por el estilo de dieta que lleva una persona, así como también en
caso de una infección que pueda restringir la producción de esta enzima.
La ausencia de esta enzima provoca que la lactosa ingrese al organismo y no sea digerido,
generando alteraciones en el metabolismo y provocando síntomas como náuseas, dolor
de estómago, etc.__
6. ¿Cuál es el rol de las sales biliares en la digestión de los triglicéridos?
_Las sales biliares ayudan con la solubilidad de los triglicéridos. Se relacionan con ellos
formando así micelas (gracias a que son fuertemente anfipáticas) convirtiendo a los
triglicéridos en moléculas más simples donde van a poder actuar las enzimas respectivas.

7. ¿Cómo explica los resultados del experimento de digestión de los triglicéridos de la

leche?
___ Hay más equivalentes de ácido graso liberado en la muestra de leche + lipasa + bilis
porque el bilis contiene sales biliares que han facilitado la solubilidad y digestión de los
triglicéridos.
8. ¿Cómo explica los resultados del experimento de digestión de la ovoalbúmina?
_La actividad de las enzimas en los tubos 2 y 4 sí funciona porque están trabajando en
sus pHs óptimos.
____

9. Además de pepsina y tripsina, ¿qué otras enzimas participan en la digestión de las

proteínas? ¿Cuáles son sus sustratos?
 La quimiotripsina: triptófano, tirosina, fenilalanina y metionina
 Elastasa: fibras elásticas
 Carboxipeptidasa A: aminoácidos cargados negativamente
 Carboxipeptidasa B: aminoácidos cargados positivamente
 Dipeptidasa
 Tripeptidasa
 PRACTICA N° 6

GLUCOGENO HEPATICO

RELACION DE EXPERIMENTOS

1. Determinación de glucógeno hepático en animal alimentado

2. Determinación de glucógeno hepático en animal en ayunas
3. Determinación de glucógeno hepático en animal tratado con adrenalina
4. Determinación de glucógeno hepático en animal tratado con aloxano

INTRODUCCION

El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilizable. Al

igual que la amilopectina del almidón, es un polisacárido ramificado, constituido por
unidades de D-glucosa unidas mediante enlaces alfa (1-4) , y ramificaciones ligadas por
enlaces alfa (1-6). Las ramificaciones están separadas unas de otras por lo menos cuatro
residuos en las porciones más centrales de la molécula haciéndola más compacta.

El glucógeno, polisacárido de reserva, se encuentra en los tejidos animales, pero abunda

especialmente en el hígado y en el músculo. Aparece en las células como partículas discretas,
las cuales evidentemente son agregados de moléculas con un peso molecular que varia
alrededor de 2 X 107. La cantidad de glucógeno varia ampliamente, no solamente entre
diferentes tejidos, sino también dentro de un mismo tejido, dependiendo del suministro de
glucosa y de la demanda metabólica de energía. El hígado y el músculo contienen los más
grandes depósitos de glucógeno, por lo que nosotros nos ocuparemos de su metabolismo en
estos órganos.

En general la dieta afectará más el contenido de glucógeno del hígado que el del músculo,
mientras que el ejercicio físico afectará más el contenido de glucógeno muscular que el del
hígado. Además los depósitos de glucógeno hepático y muscular tendrán diferentes roles. El
glucógeno muscular esta presente para servir como una reserva de combustible para la
síntesis de ATP dentro del músculo, mientras que el glucógeno hepático funcionará como
una reserva de glucosa para el mantenimiento de la concentración de glucosa en sangre
(glicemia).

Un valor típico para el contenido de glucógeno hepático en una persona bien alimentada
es alrededor de 6,5g/100g de tejido; hay mucho menos después del ayuno y mucho más
después de una dieta rica en carbohidratos. El músculo esquelético típicamente tiene
1,4g/100g de tejido, el cual no cambia mucho después del ayuno nocturno o con una dieta
rica en carbohidratos.

El glucógeno hepático puede formarse a expensas de glucosa y otros monosacáridos

(glucogénesis), como también de residuos provenientes del metabolismo intermediario de
los hidratos de carbono, proteínas y lípidos (gluconeogénesis). Las vías de síntesis de
glucógeno (glucogénesis) y de degradación hasta glucosa (glucogenolisis), son
independientes, lo que determina que los mecanismos regulatorios del metabolismo del
glucógeno actúen independientemente.

La glucógeno sinteasa y la glucógeno fosforilasa son las enzimas regulatorias de síntesis

y degradación de glucógeno respectivamente. Ellas son reguladas recíprocamente; cuando
una es estimulada, la otra es inhibida, nunca están completamente activas simultáneamente.

Síntesis de glucógeno favorecida

GLUCOGENO SINTEASA A ACTIVA OH

GLUCOGENO FOSFORILASA B INACTIVA OH

Pi ATP

H2O ADP
GLUCOGENO FOSFORILASA A ACTIVA O-P

GLUCOGENO SINTEASA B INACTIVA O-P

Degradación de glucógeno favorecida

Regulación recíproca de la glucógeno sinteasa y la glucógeno fosforilasa por fosforilación y
defosforilación. Los grupos seril fosforilados se muestran como -O-P

OBJETIVOS:
1. Realizar la determinación de glucógeno hepático
2. Cuantificar los niveles de glucógeno hepático en diferentes estados nutricionales y
hormonales:
- Animal alimentado normalmente (ad libitum)
- Animal en ayunas
- Animal tratado con adrenalina
- Animal Diabético (tratado con aloxano)

PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACION DE LOS ANIMALES EXPERIEMNTALES

a) Rata A: Que recibirá su alimentación habitual sin restricción alguna.

b) Rata B: Que permanecerá en ayunas por lo menos 24 horas antes del experimento.
c) Rata C : Estando el animal bien alimentado, pesarlo y proceder a inyectarle 0,025
mg de adrenalina por cada 100 g de peso, con dos horas de anticipación a la
práctica. Utilizar una solución de adrenalina que contenga 0,25 mg / ml.
d) Rata D: 24 horas antes del experimento se inyectará por vía subcutánea una
solución de aloxano ( 50 mg / ml ) a razón de 200 mg / Kg de peso.

2. EXTRACCIÓN DEL GLUCÓGENO

Método: Método de krisman

Fundamento:

Se trata un trozo de tejido hepático con una base fuerte (KOH) en caliente, siendo
degradadas las proteínas y otros constituyentes; quedando preservado el glucógeno, el cual
es precipitado con etanol y se le hace reaccionar con el yodo para hacer su determinación
colorimétrica. Se aumenta la sensibilidad de esta reacción con la presencia del cloruro de
calcio.
 Reactivos:
1. Solución iodo-iodurada: Pesar 0,26 g de yodo y 2,6 g de yoduro de potasio. Disolver
en 10 ml de agua destilada
2. Cloruro de calcio saturado a temperatura ambiente. Pesar 97,7 g de cloruro de
calcio, disolver en 100 ml de agua. Filtrar antes de usar
3. Reactivo de yodo: Mezclar 130 ml de la solución de cloruro de calcio con 0,5 ml de
la solución iodo-iodurada. Guardar en frasco oscuro a 0 °C, durante siete días
máximo.

Procedimiento:

1. En un tubo de centrífuga medir 0,9 ml de KOH al 33 % y colocarlo en un baño

maría hirviente
2. Sacrificar los animales por decapitación y tan rápido como sea posible extraer el
hígado y pesar 100 mg de él. Colocar inmediatamente el trozo de hígado en la
solución de KOH que se encuentra en el baño hirviente y dejarlo allí por 20 minutos,
agitando de vez en cuando para permitir la disgregación del tejido.
3. Retirar el tubo del baño y enfriar. Añadir 1,3 ml de etanol al 96% mezclar y calentar
la solución hasta la ebullición teniendo cuidado que no se proyecte. Enfriar
inmediatamente en baño de hielo por 5 minutos, para permitir la precipitación del
glucógeno
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y decantar el sobrenadante. Colocar el tubo
boca abajo sobre un papel filtro
5. Neutralizar el exceso de álcali añadiendo 0,2 ml de cloruro de amonio saturado y
mezclar cuidadosamente con una varilla de vidrio permitiendo que la solución
añadida entre en contacto con toda la pared interna del tubo
6. Preparar un blanco para lo cual se mide 0,4 ml de agua destilada y 2,6 ml del
reactivo de yodo; proceder enseguida igual que las muestras problema.
7. Colocar el tubo en baño maría hirviente durante 15 minutos y enfriar. Añadir 0,2
ml de agua destilada y 2,6 del reactivo de yodo. Si la cantidad de glucógeno
precipitado es grande, hacer en esta etapa una dilución apropiada.
8. Medir la absorbancia utilizando filtro verde
9. Para preparar las soluciones estándar se pueden medir 0,4 ml de soluciones que
contengan 0,06 mg, 0,18 mg 0,24 mg de glucógeno. A cada una de estas tres
soluciones estándar, añadir 2,6 ml del reactivo de iodo , mezclar y proceder de la
misma forma que la señalada para la muestra de hígado.

Resultados.
1. Anotar el aspecto y tamaño del hígado de los animales de experimentación
Rata A: Consistencia dura, de color rojizo oscuro y con un tamaño de 4,2 cm.
Rata B: Consistencia blanda, de color rojo pálido con despigmentaciones y con un
tamaño de 3,5 cm.
Rata C: Consistencia blanda, de color rojo pálido con despigmentaciones y con un
tamaño de 2,9 cm.
Rata D: Consistencia dura, de color rojizo oscuro y con un tamaño de 2,5 cm.

2. Observar la cantidad de precipitado después de centrifugar.

Absorbancia Absorbancia Concentración Factor de

bruta neta de Glucógeno calibración
(mg)
BLANCO 0.118 - - -
ESTANDAR 1 0.192 0,074 0,06 0,81
ESTANDAR 2 0.338 0,22 0,18 0,82
ESTANDAR 3 0.416 0,298 0,24 0,81

3. Calcular el factor de calibración: 0,81

4. Graficar la curva de calibración con los datos anteriores. Utilizando papel
milimetrado.

5. Calcular la concentración de glucógeno en cada una de las muestras Expresar los

resultados en mg de glucógeno por 100 mg, 200 mg y en el peso total del tejido
hepático
Peso del Ab Ab CONCENTRACION en mg
hígado Bruta Neta / 200 mg / 100 mg / Hígado
(mg) Hígado Hígado Total
Rata A 5.35 1.20 1,082 1,76 0,88 47,08
(Alimentado )
Rata B 4.50 0.50 0,382 0,62 0,31 13,95
(ayunas)
Rata C 4.32 0.44 0,322 0,52 0,26 11,23
(trat. con adrenalina)
Rata D 3.98 0.38 0,262 0,42 0,21 8,36
(trat. con aloxano)
6. Calcular el porcentaje de disminución del glucógeno en 100 mg de hígado con
relación al animal alimentado

mg de glucógeno/ Porcentaje de disminución en

100 mg de hígado relación al animal alimentado
RATA A 0,88 -
RATA B 0,31 64,8%
RATA C 0,26 70,5%
RATA D 0,21 76,1%
 7. Haga la interpretación de los resultados para cada rata:
Rata A: A causa de que no se alteró su metabolismo y tuvo una buena alimentación
sin ninguna restricción, su producción de glucógeno fue alta.

Rata B: Como se encontraba en ayuno, se activó el glucagón el cual activa el

glucógeno fosforilasa que degrada el glucógeno, reflejándose en su bajo nivel.

Rata C: A pesar de haber tenido una buena alimentación, la adrenalina activó la

degradación del glucógeno.
Rata D: A causa de la presencia del aloxano, el glucógeno se degrada produciendo
más glucosa.

INTEROGANTES
1. ¿Qué ventaja tiene la fosforólisis del glucógeno en comparación con la hidrólisis.
La ventaja de la fosforólisis sobre la hidrólisis es de tipo energético, ya que libera
directamente una glucosa fosforilada; a diferencia de la hidrólisis, cuya glucosa tendría
que ser fosforilada por el ATP para entrar en la vía glucolítica.

2. ¿Qué diferencia hay entre la acción glucogenolílitica de la adrenalina y glucagon en

el hígado y en el músculo.

En el glucógeno hepático el glucagón y la adrenalina estimulan su degradación a través

de la glucogenólisis. La degradación del glucógeno muscular solo es estimulada por la
adrenalina

3. Represente esquemáticamente el mecanismo de acción de la adrenalina sobre la

regulación en el metabolismo del glucógeno.
4. Si se administra leucina marcada con C-14 será factible a la identificación posterior
de glucógeno marcado con C-14.

No, ya que la leucina no es un aminoácido glucogénico y no podría generar glucosa 6

fosfato

5. ¿Cómo se explica que el animal diabético tenga menores niveles de glucógeno

hepático que su contraparte normal.
A causa de la falta de insulina se va a aumentar la degradación de glucógeno en glucosa
haciendo que los niveles de glucógeno hepático se encuentren bajos.

6. Represente esquemáticamente el mecanismo de acción de la insulina sobre el

metabolismo del glucógeno.

TALLER
ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO

La herencia de las glucogenosis es autosómica recesiva excepto en el tipo VIII/IX, en el que

está ligada al cromosoma X. La incidencia se estima en alrededor de 1/25.000 nacimientos,
lo que puede representar una subestimación porque las formas subclínicas más leves pueden
no ser diagnosticadas. Para un listado más completo de glucogenosis, véase tabla
Glucogenosis y trastornos de la gluconeogénesis.
La edad de comienzo, las manifestaciones clínicas y la gravedad varían según el tipo, pero
los signos y síntomas son, la mayoría de las veces, los asociados con la hipoglucemia y la
miopatía.
El diagnóstico de las glucogenosis se sospecha por la anamnesis, el examen físico y la
detección de glucógeno y metabolitos intermediarios en los tejidos por RM o por biopsia. El
diagnóstico se confirma con análisis de DNA o con menor frecuencia mediante la detección
de una disminución significativa de la actividad enzimática en el hígado (tipos I, III, VI y
VIII/IX), el músculo (tipos IIb, III, VII y VIII/IX), los fibroblastos cutáneos (tipos IIa y IV)
o los eritrocitos (tipo VII) o por falta de aumento de ácido láctico venoso con la
actividad/isquemia del antebrazo (tipos V y VII). (Véase también evaluación de probables
trastornos hereditarios del metabolismo).
Los síntomas pueden aparecer desde el nacimiento o en el período de recién nacido con
hipoglucemias, acidosis láctica e hiperventilación, incrementándose la síntesis de colesterol,
ácidos grasos y de ácido úrico.
Los pacientes presentan una obesidad troncal, cara de muñeca y disminución de la velocidad
de crecimiento estatural, abdomen prominente por hepatomegalia, postura lordótica,
equímosis y epistaxis

El pronóstico y el tratamiento de las glucogenosis varían según el tipo, pero la terapia suele
incluir suplementación dietética con almidón de maíz para aportar una fuente sostenida de
glucosa en las formas hepáticas de glucogenosis y evitar del ejercicio en las formas
musculares

CASO CLÍNICO

Paciente de 12 años de edad, dé sexo femenino y que presenta una marca de aumento
en el volumen del abdomen. Esta niña tuvo episodios anteriores de debilidad, sudoración y
palidez, que se superaban con la alimentación. EI desarrollo de esta paciente había sido algo
lento se sentó sin apoyo al año de edad y caminó sin ayuda a los 2 años. Su rendimiento en
el colegio era insuficiente.

El examen clínico se encontró que tenía una presión arterial de 110/58, un peso de
22.4 Kg. una estatura de 128 cm. El examen de pulmones y de corazón no mostró alteración
alguna las venas del abdomen estaban distendidas. El hígado estaba muy aumentado de
tamaño, alcanza han incluso la pelvis, entre tanto bazo y riñón no se palpaban. Con excepción
dé una pobre musculatura, el resto del examen clínico resultó normal.

ANÁLISIS DE LABORATORIO
Con la muestra de sangre en ayunas obtenida de la paciente, se practicaron los
siguientes exámenes, siendo los resultados los mostrados a continuación.

Glucosa (mmol/L) 2.8

lactato (mmol/L) 6.5
Piruvato (mmol/L) 0.43
Ácidos grasos libres (mmol/L ) 1.60
Triblicéridos (g/L) 3.16
Cuerpos cetónicos (mg/L) 400
pH 7.25

A través de una incisión abdominal, sé obtuvo una muestra de hígado, que mostraba
consistencia firme pero no cirrosis. El examen histológico mostró células hepáticas dilatadas,
el área portal comprimida, pero no se detectaron signos de inflamación. La coloración de los
cortes histológicos de hígado con un colorante específico para carbohidratos, reveló una gran
cantidad de material en las células parenquimales, que desaparecía al tratarse con amilasa
salival (Figura A).
 Depósito de glucógeno en hígado (Tinción con PAS)

El contenido de glucógeno en la muestra obtenida fue de 11 g% y el contenido de

lípidos de 20.2 g%. El estudio de la estructura del glucógeno reveló que no existían
alteraciones estructurales. Utilizando la misma muestra de biopsia del paciente, se realizaron
las determinaciones de las siguientes actividades enzimáticas:

Unidades/ g de Tej. hepático

Glucosa 6 fosfatasa 22
Glucosa 6P deshidrogenasa 0.07
Fosfoglucomutasa 27
Hepatofosforilasa 24
Fructosa 1,6 bifosfatasa 8.4

CUESTIONARIO
1.- Escriba 8 de las alteraciones que Ud. considera más importantes para el diagnóstico
de la enfermedad de la paciente y que están descritas en la historia clínica.
- Baja presión arterial
- Venas del abdomen distendidas
- Baja estatura
- Rendimiento intelectual insuficiente
- Examen de pulmones y corazón sin alteración
- Pobre musculatura
- Hígado muy aumentado de tamaño
- Sin palpación del bazo y riñón
- Bajo peso
2.- Complete la tabla con los datos que se piden y anoté si los valores mostrados están
aumentados (A), normales (N) o disminuidos (D). Tenga en cuenta la información que
se proporciona en la última página de este protocolo.

Resultados
Valores aumentado,
Análisis de sangra en ayunas en el
normales normal o
paciente
 disminuido
CONDICIÓN
Glucosa (mmol/L) 2,8 mmol/L 3,19 – 10,8 D
Lactato (mmol/L) 6,5 mmol/L 0,56 – 2 A
Piruvato (mmol/L) 0,43 mmol/L 0,05 – 0,10 A
Acidos grasos libres (mmol/L) 1,60 mmol/L 0,3 – 0,8 A
Triglicéridos (g/L) 3,16 g/L 0,7 – 4,7 A
pH 7,25 7,35 – 7,45 D

3.- Complete la siguiente tabla anotando en palaras la reacción que catalizan cada una
de las enzimas y señale además si sus actividades están normales (N), aumentadas (A) o
disminuidas (D).
Reacción catalizada N, A o D
Glucosa 6 fosfatasa Glucosa 6 fosfato se degrada a glucosa . D
Glucosa 6P deshidrogenasa De glucosa 6 fosfato a 6 N
fosfogluconolactona.
Fosfoglucomutasa De glucosa 1 fosfato a glucosa 6 fosfato y N
visceversa.
Hepatofosforilasa Producción de glucosa 1 fosfato a partir N
del glucógeno.

4.- ¿Cómo está la concentración de glucógeno en el hígado de la paciente? Fundamente

su respuesta señalando los valores normales para este parámetro
La concentración de glucógeno que se obtuvo en la muestra fue de 11 g%, siendo esta
concentración anormal debido a que el límite de concentración de glucógeno en el hígado es
de 6,5g%.
5.- ¿Qué enfermedad tiene la paciente? Fundamente su respuesta.
Tiene la enfermedad de Von Gierke debido a que presenta la ausencia de la actividad
enzimática de la glucosa 6 fosfatasa haciendo que no se produzca glucosa y por tanto se
ocasiona hipoglicemia y la acumulación de glucógeno.
6.- ¿Cómo está la concentración de lípido en el hígado de la paciente? Fundadamente
su respuesta indicando los valores normales para este parámetro.
La concentración de lípido en el hígado esta elevada ya que se considera como VN por debajo
de 5g% y la paciente se encuentra en 20,2g%

7.- Normalmente, la administración de una sobrecarga de galactosa (Prueba de la

tolerancia ala galactosa) determina que en su mayor parte se convierta en glucosa. Esto
se objetiva al determinar la glicemia luego de la sobrecarga de galactosa.
Si la prueba de tolerancia a la galactosa es practicada a la paciente en estudio, ¿Qué
resultados se esperaría encontrar? Fundamente su respuesta
La galactosa se convertiría en glucosa 6P en el citoplasma, pero por la deficiencia de la
glucosa 6 fosfatasa no se podría liberar glucosa a la sangre y no aumentaría la glicemia, por
lo tanto la prueba sería negativa ya que en la prueba positiva si habría aumento de glicemia.

8.- De no disponer de la medida de la actividad enzimática en la paciente ¿Cómo

hubiera podido descartar la enfermedad de Forbes?
La enfermedad de Forbes es causada por la ausencia de enzima desramificante, los niveles
de lactato y ácido úrico son normales, presenta elevación de las transaminasas hepáticas en
lactantes y niños. El glucagón aumenta la concentración de glucosa.

9.- ¿Cómo se explica que la niña presentara episodios de sudoración y palidez y que
mejoraran con la alimentación?
Son síntomas de la hipoglucemia, debe de consumir alimento con glucosa para aliviar los
síntomas y no caer en coma hipoglucémico.

10.- ¿Cómo se explican el aumento en la concentración de ácidos grasos y cuerpos

cetónicos en la sangre de la niña enferma?
Debido a la baja concentración de glucosa, los adipocitos liberan grandes cantidades de
A.G los que son convertidos en cuerpos cetónicos

11.- En los pacientes portadores de la enfermedad de Vón Gierke se ha descrito aumento

dan la concentración sérica de ácido úrico ¿Cómo se explica este hallazgo?
Se debe a la ausencia de actividad de la glucosa 6 fosfatasa por lo que se acumularía glucosa
6 P y esta se iría a la vía de las pentosas 6 fosfato para producir ADN y ARN y cuando estos
se degraden va a generar ácido úrico.

12.- ¿Cómo se explica el estado de acidosis metabólica de los pacientes como la niña del
caso en estudio?
Se debe al aumento de Ac Láctico, Ac pirúvico y cuerpos cetónicos

13.- ¿Qué medidas terapéuticas Ud. propondría para los pacientes portadores de la
enfermedad de Von Gierke?
Seguir las pautas nutricionales adecuadas, consumir maicena, para contrarrestar la
acidosis administrar bicarbonato, no consumir galactosa ni fructosa.
 PRACTICA No 7

METABOLISMO DE LIPIDOS: HIGADO GRASO EXPERIMENTAL

RELACION DE EXPERIMENTOS

1. Producción de un hígado graso en rata

2. Determinación de ácidos grasos en el hígado de una:
- Rata control
- Rata a la cual se ha administrado Etionina
- Rata a la cual se ha administrado Etionina + Metionina

INTRODUCCION

El rol que cumple el hígado en el metabolismo lipídico es sumamente importante. En este

sentido podemos decir que los siguientes procesos se realizan en la:
- Oxidación de los ácidos grasos
- Síntesis de ácidos grasos y colesterol
- Síntesis de lipoproteinas plasmáticas: Lipoproteinas de muy baja densidad
(VLDL); lipoproteinas de alta densidad (HDL)
- Síntesis de ácidos biliares
- Se encarga casi exclusivamente de la síntesis de cuerpos cetónicos

En ocasiones puede ocurrir alteraciones de estos procesos en el hígado, lo que determina

un anormal aumento en su contenido graso, esta situación se denomina hígado graso o
esteatosis hepática. Esta entidad merece una especial atención del médico ya que resulta ser
con frecuencia la antesala de la cirrosis hepática.

Desde un punto de vista general podemos considerar hasta cuatro situaciones

importantes que pueden ocasionar hígado graso.

- Aumento en la cantidad de ácidos grasos que llegan al hígado; sea procedentes de

la alimentación o de otros tejidos
- Menor oxidación de los ácidos grasos en el hígado
 - Mayor síntesis de ácidos grasos en el hígado
- Disminución en la salida lipídica del hígado generalmente debido a un defecto en
la síntesis de lipoproteinas plasmáticas.

A P
M Metio
A ATP t
P A
S- M
Fo
Fo Sínt
S- LIP
A P
ET Metio
A ATP t
P
S-
Fo
Fo Sínt
S- LIP
FIGURA Nº 8.1. Rol
Arriba: Mecanismo por

Nota: Las líneas discontinuas indican que el evento no se está realizando.

Experimentalmente se puede inducir el hígado graso mediante la administración de

diversos agentes, como el tetracloruro de carbono, puromicina, ácido orótico, etionina,
etc. En esta práctica estudiaremos el hígado graso inducido por la etionina, tomando
como parámetro el contenido de ácidos grasos del hígado, ya que a pesar que el hígado
graso puede ser inducido de diversas formas, es común denominador el aumento de
triglicéridos

Etionina es un compuesto estructuralmente relacionado al aminoácido esencial

metionina y por lo tanto tiene un comportamiento de antagonista competitivo, en la
síntesis de proteínas y de fosfatidil colina, de esta manera bloquea la síntesis de
lipoproteinas y finalmente la salida de lípidos del hígado.
 COOH COOH

CH – CH2 – CH2 – S – CH3 CH – CH2 – CH2 – S – CH2 – CH3

NH2 NH2
Metionina Etionina

Objetivos:

1.- Conocer el mecanismo bioquímico por el cual etionina induce esteatosis hepática
2.- Conocer el fundamento de la determinación de los ácidos grasos en el hígado
3.- Estudiar el efecto de la metionina sobre el hígado graso producido por etionina
4.- Indicar algunas alternativas de tratamiento en pacientes que sufren esteatosis
hepática

Metodología.
El día anterior a la práctica se inyecta vía intraperitoneal a un lote de tres ratas
hembras, las siguientes soluciones:

1.- Rata control: Solución salina isotónica 3 ml. Inyectar la misma cantidad a las 2:30,
5 horas y 7 horas después de la primera inyección.
2.- Rata tratada con Etionina: Se inyectará intraperitonealmente 3 ml de una solución
de DL-Etionina (16,7 mg/ml). Inyectar la misma cantidad alas 2,5 horas; 5 horas y
7 horas después de la primera inyección.
3.- Rata tratada con Etionina + Metionina: Recibe el mismo tratamiento que la rata
con etionina, pero además se le inyecta 3 ml de L-metionina ( 20 mg/ml ) una hora
antes de la primera inyección de etionina y una hora después de cada inyección de
etionina.

En este experimento se usarán ratas hembras, debido a que el incremento de

grasa hepática es mucho más pronunciada en hembras que en machos.

DETERMINACION DE LOS ACIDOS GRASOS

 - Transcurridas 24 horas de iniciado el tratamiento de los animales se les sacrifica
y se les retira rápidamente del hígado un trozo de 2,5 g, el que se fragmenta con
la ayuda de tijeras y se deposita en un Erlenmeyer de 250 ml.
- Se le añade luego 10 ml de hidróxido de potasio al 33% y 40 ml de etanol al 96%
con alcohol isoamílico al 0,4%.
- Se calienta la preparación en baño maría hirviente durante 20 minutos, teniendo
cuidado que no se proyecte el contenido.
- Añadir 17 ml de HCl al 25%, mezclar y dejar en reposo algunos minutos
- Añadir luego con pipeta volumétrica 25 ml de éter de petróleo.
- Tapar cuidadosamente el recipiente y agitar fuertemente durante un minuto.
Dejar en reposo por 10 minutos para conseguir una adecuada separación de las
fases éter de petróleo y etanol-ácido. Para esta última etapa se puede utilizar una
probeta en lugar del Erlenmeyer, con la ventaja de mirar mejor la separación de
las dos fases.
- Retirar 5 ml de la capa etérea (superior), y colocarlos en un Erlenmeyer y añadir
1 ml de solución de etanol-alcohol isoamílico y dos gotas de azul de timol.
- Finalmente titular con NaOH 0.1 N hasta obtener un color azul verdoso que debe
permanecer estable por lo menos 3 minutos.

Para efecto de los cálculos asuma que el PM promedio de los ácidos grasos que se están
titulando es de 284.

Complete la siguiente tabla:

Características del hígado

Peso total Color Consistencia

Rata control 6.8 Rojo intenso

Rata con etionina 7.3 Anaranjado Débil

Rata con etionina + 7.2 Rojo opaco

metionina
Anote el contenido de ácidos grasos en miliequivalentes en el volumen de titulación y en
miligramos por gramo de tejido hepático húmedo.
Contenido de ácidos grasos

NaOH 0.1
mg de A.G.
N mEq / 5 mEq / 25
por gramo
mL mL mL
de hígado
gastados
0,13 0,65 73,84
Rata control 1.3

0,36 1,8 204,48

Rata con etionina 3.6

Rata con etionina + 0,20 1 113,6

2.0
metionina

INTERROGANTES

1.- ¿Por qué la administración de adenina revierte en cierta forma los efectos de la
etionina?

Al estar presente más ATP me permite sintetizar más Metionina.

2.- Cite por lo menos cinco alteraciones bioquímicas que se producen en los animales
tratados con etionina
Aumento de ácidos grasos
Bloqueo de síntesis de lipoproteínas.
Aumento de la fosfatidileticolina
Aumento de tejido hepático por la muerte celular
Aumento de los triglicéridos hepáticos

3.- ¿Por qué la deficiencia de ácido pantoténico puede determinar hígado graso?

Es la vitamina B5. Constituye una parte importante en la CoA, necesario para que se una el
acil y de esa manera el ácido graso pueda transportarse por el organismo, ser soluble y poder
ser metabolizado.

4.- ¿Qué conocimiento tiene sobre el hígado graso inducido por etanol?
El etanol aporta a la solubilidad de los lípidos
 PRACTICA Nº 8
PERFIL LIPIDICO DEL SUERO
(Lipidograma)
Introducción
Con mucha frecuencia se hace en el laboratorio de bioquímica la determinación de los
lípidos del suero sanguíneo que son transportados por las lipoproteínas y que incluye
básicamente al colesterol total, triglicéridos, colesterol transportado por las lipoproteínas de
alta densidad (HDL-Colesterol y colesterol transportado por las lipoproteínas de baja
densidad (LDL-Colesterol). Este conjunto de determinaciones analíticas es denominado
como Perfil Lipídico del Suero o Lipidograma y proporciona una información muy valiosa
del estado del metabolismo lipídico. En algunos casos también se suele incluir en el perfil
lipídico la determinación de los lípidos totales y de algunas apoproteinas séricas, sin
embargo, esta última determinación no está al acceso de cualquier laboratorio de análisis
clínicos.

Inicialmente sólo se determinaba el colesterol total y los triglicéridos para la detección

de anormalidades en el metabolismo de las lipoproteínas, actualmente con la determinación
del perfil lipídico se tiene una mejor información para hacer el diagnóstico y el seguimiento
de las enfermedades metabólicas primarias y secundarias que comprometen el metabolismo
de los lípidos.

El mayor uso del perfil lipídico del suero está actualmente en el establecimiento del riesgo
a padecer enfermedades cardiovasculares ya que al conocimiento que el colesterol total y los
mismos triglicéridos, cuando están a concentraciones altas, constituyen un factor de riesgo
importante , con la determinación de HDL-Colesterol y LDL-Colesterol del suero,
información se ve ampliada ya que se puede precisar si una hipercolesterolemia se asocia a
niveles altos del colesterol transportado por las LDL y que se suele llamar el “mal colesterol”
o si los niveles de HDL-Colesterol (“buen colesterol” ) son altos y más bien constituye un
factor de protección.

Alteraciones en el metabolismo de las lipoproteínas.

Actualmente no existe una clasificación satisfactoria de las alteraciones en el

metabolismo de las lipoproteínas. La clasificación genética que fue proporcionada hasta hace
algún tiempo, se ve actualmente complicada por el incrementado número de mutaciones que
se van descubriendo en los genes comprometidos con la estructura y metabolismo lipídico.
Así por ejemplo, la hipercolesterolemia familiar HF en donde se encuentra una severa
hipercolesterolemia, con triglicéridos séricos normales y depósitos lipídicos (xantelasma y
xantomas sobre los tendones) condicionando prematuramente enfermedad coronaria, se sabe
que actualmente puede ser ocasionada por más de 500 mutaciones diferentes en el gen que
codifica para el receptor de las LDL. También se ha reportado que mutaciones en el gen de
la Apoproteína B, da las mismas manifestaciones clínicas y laboratoriales. La
hiperquilomicronemia familiar, que se presenta con una severa hiperquilomicronemia,
evidente por la turbidez del suero y por el gran aumento de los triglicéridos, se sabe
actualmente que puede ser causada por mutaciones en el gen de la lipasa lipoproteica o en
los genes de la apoproteina C II (Apo C II).

En una forma muy simple, las alteraciones en las lipoproteínas (dislipidemias) se pueden
clasificar en primarias y secundarias.
 Primarias, cuando la alteración no es ocasionada por una enfermedad de fondo
identificable.
 Secundarias, cuando la alteración es ocasionada como manifestación de una
enfermedad.

Dislipidemias Primarias.

La clasificación más aceptada de las dislipidemias primarias corresponde a la

propuesta por Fredrickson y se basa más en las determinaciones de los lípidos séricos
que en la genética. La ventaja de esta clasificación es que es ampliamente aceptada y
proporciona pautas para su tratamiento.

Las hiperlipoproteinemias descritas por Fredrickson no se dan con la misma

frecuencia, mientras que las de tipo I y V son muy raras, las de tipo IIa, IIb y IV son
muy comunes.

Relación de experimentos
1. Determinación de colesterol sérico total
2. Determinación de triglicéridos séricos
 3. Determinación de HDL-Colesterol

Objetivos
1. Precisar el fundamento de los métodos más usados en la determinación del colesterol
total, triglicéridos y HDL-Colesterol.
2. Determinar el perfil lipídico de varias muestras de suero
3. Hacer la interpretación de las alteraciones que se encuentren en el lipidograma.

CUADRO. Nº Características de las hiperlipoproteinemias de Fredrickson

TIPOS Tipo I Tipo IIa Tipo IIb Tipo III Tipo IV Tipo V

Lipoproteina
Quilomi- LDL y LDL IDL Quilomi-
VLDL
crones. VLDL crones
Colesterol Normal o Normal o Normal o
Total

Triglicéridos Normal

LDL-Colest. Normal o Normal o Normal Normal

HDL-Colest. Normal Normal o Normal o Normal o Normal o Normal o

METODOS USADOS PARA LAS DETRMINACIONES DEL PERFIL LIPIDICO.

Determinación del Colesterol total sérico.

En la actualidad se prefieren el método colorimétrico enzimático para hacer las

determinaciones del colesterol, por su especificidad y facilidad de la determinación.

Fundamento.

El fundamento general de este método es el siguiente:

 1) Una colesterol esterasa (1) hidroliza los ésteres de colesterol para rendir colesterol
libre y ácidos grasos.

2) Enseguida una colesterol Oxidasa, oxida todo el colesterol a colestenona y peróxido

de hidrógeno.

3) Finalmente el peróxido de hidrógeno es sustrato de una peroxidasa donde el oxígeno

que se desprende reacciona con la 4 aminofenazona (4-AF) permitiendo la formación
de una quinona de color rojo. Se entiende que la intensidad del color formado es
proporcional a la concentración de colesterol en el suero.

Colesterol
Colesterol Esterasa
esterificado Colesterol + Acido graso

Colesterol O2 + H2O
Oxidasa

Colestenona + H2O2
4-Aminofenazona
Peroxidasa
H2O
Quinona
Roja
Procedimiento
1. En 3 tubos de ensayo medir los siguientes reactivos:

REACTIVOS 1 (Blanco) 2 (Estandar) 3 (Muestra)

Estándar de colesterol ------ 20 l ------
(200 mg %)
Suero sanguíneo ------ ------ 20 l
Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

2. Mezclar e incubar los tubos 5 minutos a 37 º C, o por 10 minutos a temperatura

ambiente.
3. Medir la absorbancia a 505 nm
Hacer los cálculos respectivos y expresar la concentración de colesterol en mg/100 ml de
suero.
Determinación de HDL-Colesterol

Fundamento.

a) Se precipitan las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de muy baja densidad

(VLDL) con el agregado de Sulfato de dextran en presencia de iones magnesio. En
el sobrenadante que es separado por centrifugación quedan las lipoproteínas de alta
densidad (HDL).
b) Luego se procede a determinar el colesterol de las HDL usando el mismo
procedimiento que el descrito para determinar el colesterol total.

Procedimiento

1. Mezclar 0.4 ml de suero con 1.0 ml de reactivo precipitante. Incubar por 15 minutos
a temperatura ambiente y centrifugar durante 20 minutos a 4000 rpm.
2. Utilizar 40 l del sobrenadante para hacer la determinación del HDL-colesterol de
acuerdo a la siguiente Tabla.
REACTIVOS 1 (Blanco) 2 (Estandar) 3 (Muestra)
Estándar de colesterol ------ 20 l ------
(200 mg %)
Sobrenadante ------ ------ 200 l
Agua destilada 40 l 20 l ------
Reactivo de trabajo 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml

3. Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 ºC, o por 10 minutos a temperatura ambiente.

4. Medir la absorbancia a 505 nm.
5. Hacer los cálculos correspondientes y expresar la concentración de HDL-Colesterol
en mg / 100 ml de suero.

Determinación de los triglicéridos séricos

Fundamento
a) Una Lipasa hidroliza los triglicéridos del suero y rinde glicerol más ácidos grasos.
b) El Glicerol formado, luego es convertido en glicerolfosfato en presencia de ATP por
acción de una Glicerol quinasa.
 c) El Glicerol3 fosfato es oxidado luego a dihidroxiacetona fosfato con la formación de
Peróxido de hidrógeno por acción de una Oxidasa.
d) Finalmente, el peróxido de hidrógeno reacciona con los cromógenos p-clorofenol y 4
aminofenazona (4AP) , rindiendo una quinona de color rojo. En esta última reacción
interviene una Peroxidasa.

Lipasa
Triglicéridos Glicerol + Acidos grasos
Glicerol ATP
Kinasa
ADP
Glicerol - 3 P
O2
Oxidasa
p-Clorofenol
4 AP
Dihidoxiacetona P H2O
+ Quinona de
H2 O 2 color Rojo
Peroxidasa

Procedimiento
1. En 3 tubos de ensayo medir los siguientes reactivos
REACTIVOS 1 (blanco) 2 (Estandar) 3 (Muestra)
Estándar (200 mg%) ------ 20 l ------
Muestra (Suero) ------ ------ 20 l
Reactivo de Trabajo 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml

2. Mezclar e incubar a 37 º C. por 4 minutos o 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Medir la Absorbancia a 505 nm.
4. Hacer los cálculos correspondientes y expresar la concentración de triglicéridos en
mg /100 ml de suero.

Expresión de Resultados.
1. Llene la tabla siguiente con los resultados obtenidos en las determinaciones realizadas
y además con los datos que el profesor le proporcionará en el curso del experimento.
 Colesterol Total HDL-Colesterol Triglicéridos
Paciente
mg % mmoles/L mg % mmoles/L mg % mmoles/L
A 268 69,68 28 7,2 151 17
B 394 102,44 30 7,8 86 9,7
C 230 59,8 59 15,2 131 14,8
D 326 84,76 61 15,8 164 18,5

2. Haga la estimativa aproximada de los valores de LDL-Colesterol con los datos del
colesterol total y del HDL-Colesterol de cada suero y consigne los resultados en la
siguiente tabla.

LDL-Colesterol
Paciente Índice Aterogénico
mg % mmoles / L
A 270,2 69,8 9,57
B 381,2 98,5 13,13
C 197,2 51 3,90
D 297,8 77 5,34

3. Estime el índice aterogénico para cada caso y consigne los resultados en la Tabla
anterior.

𝐂𝐨𝐥𝐞𝐬𝐭𝐞𝐫𝐨𝐥 𝐓𝐨𝐭𝐚𝐥
Í𝐧𝐝𝐢𝐜𝐞 𝐀𝐭𝐞𝐫𝐨𝐠é𝐧𝐢𝐜𝐨 =
𝐇𝐃𝐋 − 𝐂𝐨𝐥𝐞𝐬𝐭𝐞𝐫𝐨𝐥
PACIENTE A:
𝟐𝟔𝟖
- Í𝐧𝐝𝐢𝐜𝐞 𝐀𝐭𝐞𝐫𝐨𝐠é𝐧𝐢𝐜𝐨 = = 9,57
𝟐𝟖

PACIENTE B:
394
- Í𝐧𝐝𝐢𝐜𝐞 𝐀𝐭𝐞𝐫𝐨𝐠é𝐧𝐢𝐜𝐨 = = 13,13
𝟑𝟎
 PACIENTE C:
230
Í𝐧𝐝𝐢𝐜𝐞 𝐀𝐭𝐞𝐫𝐨𝐠é𝐧𝐢𝐜𝐨 = = 3,90
𝟓𝟗

PACIENTE D:
326
Í𝐧𝐝𝐢𝐜𝐞 𝐀𝐭𝐞𝐫𝐨𝐠é𝐧𝐢𝐜𝐨 = = 5,34
𝟔𝟏

4. Comente los resultados obtenidos para cada paciente, destacando las alteraciones
encontradas y si es posible hacer un diagnóstico tentativo en base a la clasificación
de Fiedrickson.
Según el perfil lipídico calculado, y teniendo en cuenta que la LDL colesterol en condiciones
normales se considera hasta 130mg/dl, podemos afirmar que los pacientes se encuentran en
una situación crítica ya que sus niveles de LDL colesterol están muy elevados. Según
Fredrickson es posible que sufran de hipercolesterolemia familiar o hiperlipidemia coronaria,
donde estarían relacionados con enfermedades como la aterosclerosis y la coronaria, además,
que no presenten síntomas y sufran de enfermedades vasculares.
PACIENTE A: Presenta colesterol total muy alto, HDL colesterol muy bajo y triglicéridos al
borde de lo normal.
PACIENTE B: Presenta colesterol total muy alto, HDL colesterol muy bajo y triglicéridos
en condición normal.
PACIENTE C: Presenta colesterol en nivel intermedio, HDL colesterol muy cerca de lo
normal y triglicéridos en condición normal.
PACIENTE D: Presenta colesterol total muy alto, HDL colesterol en condición normal y
triglicéridos a nivel intermedio.

INTERROGANTES.
1.- Consigne los valores aceptados como normales para cada determinación realizada.
Los valores normales:
 Colesterol total: máximo hasta 200mg/dl
 LDL colesterol: máximo hasta 130mg/dl
 HDL colesterol: mayor de 60mg/dl
  Triglicéridos: máximo hasta 150mg/dl

2.- Qué es el índice aterogénico, qué importancia tiene y como se estima?

Son indicadores bioquímicos, que, a partir de la relación entre el colesterol total, la LDL, la HDL y los
triglicéridos, permiten identificar sujetos con riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares.

3.- ¿Es posible hacer la determinación en el laboratorio de LDL-colesterol, para obtener

un valor más exacto que el obtenido mediante la aproximación que Ud. hizo? ¿Cuál
sería el fundamento del método?
Se podría determinar en el laboratorio la LDL colesterol mediante la electroforesis, pero esta ya no se utiliza
porque demora mucho en obtener los resultados. Básicamente se hacen precipitar las lipoproteínas y después
mediante su solubilización y a espectrometría se podría obtener el resultado.

4.- Que se entiende por índice metabólico?

Es el equilibrio de los procesos metabólicos que se realiza en nuestro organismo, los que
comprende los beneficios obtenidos de la digestión, por ejemplo la energía necesaria para
vivir, la grasa que cumple una función de protección, actividades motoras y en general
cualquier necesidad metabólica del cuerpo.

SEMINARIO-TALLER (8)

HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR

CASO CLÍNICO

O.C.M., químico de 30 años de edad consulto a su médico por presentar dolor

intermitente en el pecho. El paciente refirió que no había tenido ninguna molestia hasta 3
meses antes en que luego de haber disfrutado de una comida pesada en un restaurant sintió
dolor subesternal. Posteriormente sintió el mismo dolor al remover la nieve con la lampa, el
que duro cerca de 10 minutos y desaparecía con el reposo. Después de hablar con su hermano
de 34 años, quien estaba hospitalizado por un infarto de miocardio, decidió acudir al médico.
 Tres años antes el paciente tuvo un colesterol sérico de más de 400 mg% y se le
recomendó disminuir la ingesta de grasa y colesterol en la dieta; sin embargo no cumplió con
esta recomendación. Él no había tenido historia de diabetes, hipertensión o enfermedad
coronaria. Como habito tenía el de beber una cerveza todos los días después de la cena, nunca
fumo y su trabajo no era muy estresante.

No se encontró historia familiar de diabetes o hipertensión. Su padre tuvo niveles

altos de colesterol y murió con infarto cardiaco a los 41 años. Su madre estaba viva y
saludable. Su único hermano era el que estaba hospitalizado. Su hijo de 4 años y la hija de 2
años se encontraban aparentemente sanos.

El examen físico revelo un hombre blanco de 1.75 m de estatura y de 69 Kg de peso.

Su presión arterial era 124/ 64 mm de Hg, pulso de 84 por minuto, regular y 16 respiraciones
por minuto. El examen de cabeza fue normal, no se encontró arco corneal ni xantelasmas. El
examen de fondo de ojo no mostro retinopatía hipertensiva ni depósito de grasa. El examen
de tórax mostro que el choque de punta cardiaco estaba en los límites normales; sin embargo
a la auscultación se encontró un soplo sistólico de eyección, grado II/IV. El examen de
abdomen no mostro visceromegalias ni se palpaban masas. El examen rectal fue enteramente
normal. El examen de las extremidades no revelo edemas y se palpaban todos los pulsos
periféricos, sobre ambos tendones de Aquiles se encontraron masas nodulares con superficie
as per a e irregular. El examen neurológico fue completamente normal.

El recuento de hematíes, hemograma, electrolitos, nitrógeno ureico sanguíneo (BUN),

creatinina, glucosa, calcio, fosfato, transaminasa glutámico pirúvica, transaminasa glutámico
oxalacética, fosfatasa alcalina, bilirrubina, ácido úrico, proteínas sérica, albumina sérica,
electroforesis de las proteínas séricas y examen completo e orina, resultando todos normales.
Las pruebas de función tiroidea también resultaron normales. El nivel de colesterol sérico en
ayunas fue de 446 mg% (V.N. 135 – 235), triglicéridos séricos de 128 mg% (V.N. 45 – 205
mg%) y HDL colesterol de 50mg% (V.N. 35 – 45 mg%). Una placa radiográfica de torax
mostró un tamaño normal para el corazón y ninguna alteración a nivel pulmonar. El
electrocardiograma (ECG) reveló onda invertida en las derivaciones I, AVL, V 4, V5 y V6 .
 La prueba del esfuerzo resultó positiva y la angiografía coronaria reveló un marcado
estrechamiento de las arterías coronarias izquierda anterior descendente y circunfleja.

BASE MOLECULARES Y CORRELATO CLÍNICO – BIOQUÍMICO

El único factor de riesgo que presenta O.C.M. es la hipercolesterolemia. El examen
clínico y las pruebas de laboratorio indican claramente que no se trata de una
hipercoleesterolemia secundaria.

La hipercolesterolemia familiar es causada por mutación en el gen que codifica para

el receptor de las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Estas mutaciones no siempre son las
mismas y así pueden determinar:

a) Que los receptores sean sintetizados pero que tengan un transporte muy lento desde el
retículo endoplasmatico al aparatado de golgi.

b) Que los receptores son sintetizados, procesados y alcanzan la superficie celular pero fallan
en unir normalmente a las LDL.
c) Que los receptores sean sintetizados, procesados, que lleguen a la superficie celular,
incluso que fijen normalmente las LDL pero fallen en agruparse en los hoyos tapizados.

La Hipercolesterolemia Familiar (FH “Familial Hypercholesterolemia”) se

caracteriza clínicamente por niveles plasmáticos elevados de colesterol y de LDL en el
plasma, que se ven secundados por depósito de colesterol derivado de las LDL en los
tendones (xantomas) y en las arterias (ateroesclerosis).

Esta enfermedad se hereda con carácter autosómico dominante, siendo los

homozigotos más severamente afectados que los heterocigotos. Una de cada 8500 personas
son heterocigotos para la FH, los heterocigotos pueden ser diagnósticos al nacer por la
medida del LDL colesterol plasmático del cordón umbilical. Estos niveles resultan ser 2 ó 3
veces el vapor normal. Estos individuos producen solamente la mitad del número normal de
receptores funcionales, desarrollan generalmente los sin síntomas de ateroesclerosis
coronaria entre la tercera y cuarta década de vida con un pico de incidencia en la cuarta y
quinta década. Aproximadamente el 85% de los heterocigotos sufre de infarto de miocardio
en la sexta década. Un 75 % presenta xantomas en los tendones que corresponden al depósito
de esteres de colesterol en los macrófagos y característicamente comprometen al tendón de
Aquiles, tendones del dorso de la mano, codos y rodillas. Los depósitos de colesterol en los
parpados (xantelasmas) y en la córnea (arco corneal) se pueden presentar pero no son de
carácter diagnóstico.

Los homocigotos se presentan con una frecuencia de una persona por cada millón,
tiene niveles del LDL colesterol en más de 6 veces superiores a lo normal; sufren de infarto
de miocardio a partir de los dos años de edad y muy pocos superan los 20 años de vida. Se
observan frecuentemente xantomas cutáneas al nacer y siempre los desarrollan dentro de los
primero 6 años de vida.
Figura: Arriba.- Transporte de las lipoproteínas en condiciones normales. Abajo.- La falla
de los receptores provoca depósito de colesterol en las arterias de menor calibre (arteria
coronaria)

Desde que la hipocolesterolemia familiar se caracteriza por un defecto en el receptor

de LDL, se observan niveles elevado de LDL, colesterol en el plasma, lo que constituye el
medio muy útil para su diagnóstico.

Para la medida del LDL–colesterol se utilizan técnicas de ultra centrifugación, sólo

disponibles en laboratorios especializados. Por esta razón se ha descrito una fórmula (formula
de Friedewald y Fredrickson) para calcular los niveles de LDL colesterol indirectamente.
Esta fórmula es la siguiente.

LDL colesterol = Colesterol total – (HDL colesterol + TG/5)

Esta fórmula empírica puede aplicarse cuando la concentración de triglicéridos (TG)

plasmáticos.es menor a 400 mg %. Los valores normales de LDL-colesterol varían entre 80
a 185 mg%.
 Evidencias epidemiológicas indican que niveles altos de LDL- colesterol se
correlacionan positivamente con un riesgo ateroesclerótico; mientras que niveles altos, de
HDL- colesterol protegen de enfermedades coronarias.
BIBLIOGRAFÍA
1.- BROWN M.S. and GOLDSTEIN J.L. (1984). How LDL receptors Influence colesterol
and ateroesclerosis. Sci. Amer. 850:52-60

2.- MONTGOMERY R., CONWAY T. and SPECTOR A. (1990). Blochemistry: A case

oriented approach. V Ed. Mosby Co.

3.- SACKS F.M. and WILLETT W.W. (1991): More on chewing the Fat: The good fat and
the good colesterol. New. Eng. J. Med 325:1740 – 1741

4.- ROSS R. (1993). The pathogenesis of ateroesclerosis a Perspective for the 1990s. Natura
362: 801 – 809

INTERROGANTES
1.- ¿Qué son las liproteinas? ¿Cuál es sus estructuras? ¿Cómo se clasifican?
Las lipoproteínas son el transporte indispensable de los lípidos para cumplir con sus
funciones metabólicas. La estructura es la unión del lípido con una apoproteína, la cual dse
diferencia según la función de transporte que cumpla. Por ejemplo, las VLDL transportan
triglicéridos del hígado hacia los tejidos, las LDL transportan colesterol a los tejidos, las HDL
transportan colesterol de los tejidos al hígado y los quilomicrones transportan triglicéridos
de la sangre a los tejidos.

2.- Qué método conoce Ud. para separar las lipoproteínas plasmáticas.
Haría el experimento para precipitar la lipoproteína HDL, de ese modo se precipitan todas las otras y queda
como sobrenadante para medirla, Seguidamente con los triglicéridos y ya con estos dos resultados se puede
hallar la LDL.
En cuanto a los quilomicrones, se puede notar la presencia de estos en el suero, presentándose de forma un
poco viscosa.
3.- Correlacione la separación de las lipoproteínas mediante la electroforesis con su
separación mediante la ultracentrifugación. Haga la correspondencia entre las
fracciones obtenidas.

Ya no se realiza la electroforesis porque es un proceso que demora mucha. El procedimiento más rápido es
mediante la precipitación y la centrifugación. De esta manera podemos determinar los valores de estas
lipoproteínas de una forma más rápida gracias al reactivo según la lipoproteína que se quiera hallar.

4.- Cuáles son los factores que predisponen a la enfermedad coronaria.

Está mayormente asociada a una hipercolesterolemia familiar en donde se presentan los
siguientes análisis: Alto nivel de lipoproteína LDL, colesterol total elevado al igual que la
LDL-colesterol. En cuanto a los triglicéridos, se encuentran en nivel normal y por otro lado
las HDL colesterol o se encuentran bajas o en nivel normal.

5.- ¿Dónde se forman los quilomicrones? ¿Cuál es su función? ¿Qué es el quilomicrón

remanente? ¿Por qué no aparecen en la electroforesis del suero de una persona normal?

Se forman en las células epiteliales del intestino. Su función es transportar triglicéridos

provenientes de la dieta por la circulación sanguínea con dirección a los tejidos musculares
y adiposos donde se desarrollará el metabolismo.
Es considerado remanente cuando comienza perder triglicéridos, a ese punto solo le queda
ser capturado por el hígado.
No se pueden medir en electroforesis porque es un proceso muy lento para estas lipoproteínas
que desaparecen muy rápido.

6.- ¿Dónde se forman las VLDL? ¿Cuál es su función y cuál es su destino?

Se forman en el hígado y su función es el transporte de triglicéridos del hígado hacia los
tejidos extrahepáticos. Es un transporte endógeno.
 7.- ¿A qué se llama IDL? ¿Cómo se forman y cuáles su destino?
Son lipoproteínas de densidad intermedia que se forman de manera temporal del
metabolismo de las lipoproteínas VLDL.

8.- ¿Cuál es el mecanismo de formación e ingreso a la célula de las LDL?

Se forman por la degradación de las lipoproteínas IDL. Ingresa a la célula por transporte
endógeno gracias a que su apoproteína tiene un receptor que la reconoce y le permite ingresar.

9.- ¿Cómo se regula el contenido de colesterol en la célula?

Las células contienen receptores que captan a las lipoproteínas que contienen colesterol,
captación de colesterol libre de proteínas con colesterol y la célula también puede sintetizar
colesterol.

10.- ¿Qué es la colestiramina y cuál es su mecanismo de acción?

Es una resina de intercambio aniónico, utilizada para tratar la hipercolesterolemia. Funciona

secuestrando los ácidos biliares. Incrementa la síntesis de ácidos biliares en el hígado a partir del
colesterol plasmático.
11.- ¿Qué fundamento tiene el empleo de las estatinas en el HF?, señale algunos de ellos
Actúan inhibiendo la enzima hidroximeti- lglutarilCoA- reductasa (controla la
producción de colesterol en el hígado), son los fármacos más eficaces para reducir el
colesterol total y LDL-colesterol:
 Atorvastatina
 Lovastatina
 Pitavastatina
 Pravastatina
 Rosuvastatina
 Simvastatina

12.- ¿Toda persona que ingiere dietas con alto contenido de grasa saturada
necesariamente sufrirá de ateroesclerosis coronaria? Fundamente su respuesta.
No necesariamente, debido a que se debe evaluar a la persona, en base a los resultados se
puede determinar si hay o no un riesgo, los antecedentes familiares son importantes como
algún defecto congénito heredado.

13.- Con los datos reportados en el laboratorio para el paciente estimar los valores de
LDL-colesterol e indicar como está dicho valor en relación a los valores normales.
- colesterol sérico :446 mg% (V.N. 135 – 235)
- triglicéridos séricos: 128 mg% (V.N. 45 – 205 mg%)
- HDL colesterol: 50mg% (V.N. 35 – 45 mg%)
LDL colesterol = Colesterol total – (HDL colesterol + TG/5)
LDL colesterol = 446 – (50 + 128/5)
LDL colesterol = 370.4 mg%
Evidentemente el valor de LDL-colesterol se encuentra elevado

14.- ¿Por qué a los pacientes hipercolesterolémicos tratados con resinas fijadoras de
ácidos biliares se aconseja administrarles vitaminas liposolubles?
Porque este tratamiento puede afectar la manera en el que el cuerpo absorbe estas vitaminas,
para que los valores no se vean alterados, se administran dichas vitaminas.

15.- Si la esposa del paciente resulta embarazada, ¿qué prueba de laboratorio se podría
hacer para tener el diagnóstico prenatal de la hipercolesterolemia familiar?
El diagnóstico de HFHo se debe realizar alrededor de los 2 años o incluso antes y esto se
basa en concentración de cLDL sin tratamiento> 500mg/dl o cLDL con tratamiento
>300mg/dl, presencia de xantomas antes de los 10 años e historia de hipercolesterolemia o
diagnóstico genético en ambos progenitores.

16.- Al investigar el efecto de la concentración de LDL sobre la unión de LDL

radioactivo a fibroblastos cultivados (A) y sobre la actividad de la HMG-CoA reductasa
(B), en el paciente, se obtuvieron los resultados mostrados en la Figura. ¿Cuál es el
probable defecto? ¿Por qué?.
 Normal

Unión Actividad Paciente

del Paciente de HMG
LDL CoA

Normal

LDL (ug/ml en el medio de incubación LDL (ug/ml en el medio de incubación

 En la figura 1, hay una baja unión entre la concentración de LDL que produce los
niveles altos de colesterol y los cultivos de fibroblastos que son un modelo para
investigar el control del metabolismo del colesterol; algunas de las lipoproteínas de
baja densidad LDL no se han unido a los receptores de los fibroblastos.
Lo normal es que una vez que el receptor se haya unido a las LDL estas sean
degradadas, originando la hidrólisis de ésteres de colesterol y apo proteínas,
reprimiendo la actividad de la HMG CoA que es la encargada de sintetizar más
colesterol.
 En la figura 2 se observa los niveles altos en la actividad de la HMG CoA, por lo que
se sigue sintetizando colesterol.

17.- Si Ud. hubiera sido el medio de O.C.M., que recomendación hubiera hecho con
respecto al estilo de vida y a su dieta.
- Le recomendaría una dieta rica en frutas, verduras, pescado, cereales integrales: ya que
estos alimentos nos aportan nutrientes que nos ayudan a reducir la cantidad de colesterol en
la sangre y a aumentar el colesterol bueno por que aportan los ácidos grasos monoinsaturados,
omega 3, y antioxidantes (frutas y verduras)
- Disminuir niveles de estrés
- Actividad física
- Evitar el tabaco y alcohol