Ejercicio de cinética enzimática, inhibición de la actividad.

Bioquímica Experimental, Grupo 8.

i. La enzima fosfatasa alcalina cataliza la siguiente reacción:

Un compuesto fosfatado, llamado FP (sustrato), perderá el grupo fosfato en presencia de la fosfatasa.

Un inhibidor de esta enzima es el Oxalato de Bromolevamisol.
Para saber el tipo de inhibición que este compuesto causa sobre la fosfatasa alcalina se realizó el
siguiente experimento:
1) Determinación de la actividad en presencia de concentraciones crecientes de sustrato (FB) sin
inhibidor
2) Determinación de la actividad en presencia de concentraciones crecientes de sustrato (FP) en
presencia de tres concentraciones distintas del inhibidor (Oxalato de Bromolevamisol).

Contesta lo siguiente
A) Realiza un análisis grafico (actividad vs concentración de sustrato, es decir, una gráfica tipo
Michaelis Menten) de cada una de las 4 mediciones.
B) Realiza un análisis de Lineweaver-Burk (doble recíproco) de cada una de las 4 mediciones.
C) Usando el gráfico de de Lineweaver-Burk, calcula la Km y Vmax de cada una de las
mediciones (i.e se tendrían que encontrar 4 Km y 4 Vmax).
D) Determina que tipo de inhibición causa el oxalato de bromolevamisol sobre la actividad de la
fosfatasa alcalina, FUNDAMENTA la respuesta en términos gráficos y cinéticos.

ii. La transaminasa glutámico pirúvica (TGP) transfiere un grupo amino del glutamato al
piruvato, como se muestra en la siguiente reacción:
 El ácido 2-hidroxisuccínico es capaz de unirse a la TGP e inhibir su actividad
Para saber el tipo de inhibición que este compuesto causa sobre la TGP se realizó el siguiente
experimento:
1) Determinación de la actividad en presencia de concentraciones crecientes de sustrato
(glutamato, Glu) sin inhibidor.
2) Determinación de la actividad en presencia de concentraciones crecientes de sustrato (Glu) en
presencia de tres concentraciones distintas del inhibidor (2-hidroxisuccínico).

Contesta lo siguiente
A) Realiza un análisis grafico (actividad vs concentración de sustrato, es decir, una gráfica tipo
Michaelis Menten) de cada una de las 4 mediciones.
B) Realiza un análisis de Lineweaver-Burk (doble recíproco) de cada una de las 4 mediciones.
C) Usando el gráfico de de Lineweaver-Burk, calcula la Km y Vmax de cada una de las
mediciones (i.e se tendrían que encontrar 4 Km y 4 Vmax).
D) Determina el tipo de inhibición que causa el ácido 2-hidroxisuccínico sobre la actividad de la
TGP, FUNDAMENTA la respuesta en términos gráficos y cinéticos.
A) Realiza un análisis grafico (actividad vs concentración de sustrato, es decir, una gráfica tipo
Michaelis Menten) de cada una de las 4 mediciones.

Bromolevamisol 0 μM
1.2

V0 (mmol/min)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8
[FP] ( μM)

Bromolevamisol 8 μM
0.8
V0 (mmol/min)

0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8
[FP] ( μM)

Bromolevamisol 16 μM
0.6
V0 (mmol/min)

0.4

0.2

0
0 2 4 6 8
[FP] ( μM)

Bromolevamisol 40 μM
0.4
V0 (mmol/min)

0.2

0
0 2 4 6 8
[FP] ( μM)
 Bromolevamisol

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 1 2 3 4 5 6 7

0 μM 8 μM 16 μM 40 μM

Realiza un análisis de Lineweaver-Burk (doble recíproco) de cada una de las 4 mediciones.

1/[S] 1/V0 (0 μM)
10 4.32900433
Bromolevamisol 0 μM
3.33333333 2.32018561
1.42857143 1.64744646 5
1/V0 (mmol/min)

0.76923077 1.33155792 4
0.55555556 1.23304562 3
0.38461538 1.09649123 2
0.24390244 1.04493208
1
0.17241379 1.01936799
0
0 2 4 6 8 10 12
1/[FP] ( μM)

y = mx + b
1 1
= 𝑚( )+𝑏
𝑉0 [𝑆]
𝑦2 − 𝑦1
𝑚=
𝑥2 − 𝑥1
 1.01936799 − 1.04493208
𝑚=
0.17241379 − 0.24390244
𝑚 =0.35759647

1.01936799 = 0.35759647(0.17241379) + 𝑏
𝑏 = 1.01936799 − 0.06165455061
𝑏 = 0.9577134394
1
= 0.9577134394
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 =
0.9577134394
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 1.044
𝐾𝑚
= 0.35759647
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
= 0.35759647
1.044
𝐾𝑚 = 0.37

1/[S] 1/V0 (8 μM)

10 4.76190476
Bromolevamisol 8 μM
3.33333333 2.7100271 5
1/V0 (mmol/min)

1.42857143 2.04918033 4
0.76923077 1.66944908 3
0.55555556 1.52207002 2
0.38461538 1.52207002 1
0.24390244 1.45348837
0
0.17241379 1.34952767 0 2 4 6 8 10 12
1/[FP] ( μM)

y = mx + b
1 1
= 𝑚( )+𝑏
𝑉0 [𝑆]
𝑦2 − 𝑦1
𝑚=
𝑥2 − 𝑥1
2.7100271 − 4.76190476
𝑚=
3.33333333 − 10
𝑚 =0.30132281

1.34952767 =0.30132281(0.17241379) + 𝑏

𝑏 = 1.34952767 − 0.05195220769
𝑏 = 1.297575462
 1
= 1.297575462
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 =
1.297575462
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 0.77
𝐾𝑚
= 1.45422665
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
= 1.45422665
0.77
𝐾𝑚 = 1.12

Bromolevamisol 16 μM
1/[S] 1/V0 (16 μM)
6
10 5.23560209
3.33333333 2.56410256 5
1/V0 (mmol/min)

1.42857143 2.35294118 4
0.76923077 2.14132762
0.55555556 1.88679245 3

0.38461538 1.83150183 2
0.24390244 1.78253119
1
0.17241379 1.7921147
0
0 2 4 6 8 10 12
1/[FP] ( μM)

y = mx + b
1 1
= 𝑚( )+𝑏
𝑉0 [𝑆]
𝑦2 − 𝑦1
𝑚=
𝑥2 − 𝑥1
1.83150183 − 1.88679245
𝑚=
0.38461538 − 0.55555556
𝑚 = 0.32345013

1.83150183 = 0.32345013(0.38461538) + 𝑏
𝑏 = 1.83150183 − 0.1243851139
𝑏 = 1.707116716
 1
= 1.707116716
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 =
1.707116716
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 0.58
𝐾𝑚
= 0.32345013
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
= 0.32345013
0.58
𝐾𝑚 = 0.18

1/[S] 1/V0(40 μM)

10 6.32911392 Bromolevamisol 40 μM
3.33333333 4.18410042 7
1.42857143 3.6101083 6
1/V0 (mmol/min)

0.76923077 3.28947368 5
0.55555556 3.13479624 4

0.38461538 3.04878049 3
2
0.24390244 2.84900285
1
0.17241379 2.90697674 0
0 2 4 6 8 10 12
1/[FP] ( μM)

y = mx + b
1 1
= 𝑚( )+𝑏
𝑉0 [𝑆]
𝑦2 − 𝑦1
𝑚=
𝑥2 − 𝑥1
0.38461538 − 0.55555556
𝑚=
3.04878049 − 3.13479624
𝑚 = 0.50319214

3.04878049= 0.50319214 (0.38461538) + 𝑏

𝑏 = 3.04878049 − 0.1935354361
𝑏 = 2.855245054
1
= 2.855245054
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 =
2.855245054
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 0.35
𝐾𝑚
= 0.50319214
𝑉𝑚𝑎𝑥
 𝐾𝑚
= 0.50319214
0.35
𝐾𝑚 = 0.17

Determina que tipo de inhibición causa el oxalato de bromolevamisol sobre la actividad de la

fosfatasa alcalina, FUNDAMENTA la respuesta en términos gráficos y cinéticos.

Bormolevadisol
7

5
1/V0 (mmol/min)

0
0 2 4 6 8 10 12
1/[FP] ( μM)

0 μM 8 μM 16 μM 40 μM

[S] Km Vmax
0 μL 0.37 1.04
8 μL 1.12 0.77
16 μL 0.18 0.58
40 μL 0.17 0.35
Análisis

Nuestro oxalato de bromolevamisol causa una inhibición de tipo acompetitivo, esto quiere decir que el
inhibidor se unirá al complejo enzima-sustrato, ya que, gráficamente podemos observar un paralelismo
entre cada línea, a excepción entre la de 8 y 16 micro moles ya que se puede apreciar un leve
delineamiento, se puede deber a errores prácticos, por otra parte en comparación a los términos
cinéticos se aprecia una disminución de la Km y la Vmax, esto corresponde con la literatura ya
mencionada, solo con un pequeño desfase en los 8 microlitros, se desconoce la causa pero podemos
asumir que también se debe a errores en la práctica.

Realiza un análisis grafico (actividad vs concentración de sustrato, es decir, una gráfica tipo
Michaelis Menten) de cada una de las 4 mediciones.
 0 mM
3

V0
1

0
0 5 10 15 20 25 30
[Glu](mM)

1 mM
3
2.5
2
V0

1.5
1
0.5
0
0 5 10 15 20 25 30
[Glu](mM)

2mM
3
V0

2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
[Glu](mM)

5.1 mM
2.5
V0

2
1.5
1
0.5
0
0 5 10 15 20 25 30
[Glu](mM)
 2 Hidroxisuccínico
3

2.5

1.5

0.5

0
0 5 10 15 20 25 30

0 mM 1 mM Series3 5.1 mM

Realiza un análisis de Lineweaver-Burk (doble recíproco) de cada una de las 4 mediciones.

Usando el gráfico de de Lineweaver-Burk, calcula la Km y Vmax de cada una de las mediciones (i.e
se tendrían que encontrar 4 Km y 4 Vmax).
1.66666667 1.69491525 2hidroxisuccínico 0mM
0.71428571 0.89285714 2
0.34482759 0.61349693
1.5
0.19230769 0.51546392

V0 (μmol/min)
0.125 0.456621 1
0.09708738 0.43859649
0.0625 0.43103448 0.5
0.03984064 0.38167939
0
0 0.5 1 1.5 2
1/[Glu] (mM)

1 1
= 𝑚( )+𝑏
𝑉0 [𝑆]
𝑦2 − 𝑦1
𝑚=
𝑥2 − 𝑥1
0.38167939 − 0.43103448
𝑚=
0.03984064 − 0.0625
𝑚 =2.17813248

0.38167939 = 2.17813248(0.03984064) + 𝑏
𝑏 = 0.38167939 − 0.08677819201
𝑏 = 0.294901198
1
= 0.294901198
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 =
0.294901198
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 3.39
𝐾𝑚
= 2.17813248
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
= 2.17813248
3.39
𝐾𝑚 = 7.38

1.66666667 2.08333333
0.71428571 1.0989011
0.34482759 0.6993007
0.19230769 0.58823529
0.125 0.51546392
0.09708738 0.48543689
0.0625 0.42918455
0.03984064 0.39525692
 2hidroxisuccínico 1mM
2.5

V0 (μmol/min)
1.5

1
1 1
= 𝑚( )+𝑏
𝑉0 [𝑆] 0.5
𝑦2 − 𝑦1
𝑚= 0
𝑥2 − 𝑥1 0 0.5 1 1.5 2
0.39525692 − 0.42918455 1/[Glu] (mM)
𝑚=
0.03984064 − 0.0625
𝑚 =1.4972898

0.39525692 = 1.4972898(0.03984064) + 𝑏
𝑏 = 0.39525692 − 0.0596529839
𝑏 = 0.3356039361
1
= 0.3356039361
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 =
0.3356039361
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 2.97
𝐾𝑚
= 1.4972898
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
= 1.4972898
2.97
𝐾𝑚 = 4.46

1.66666667 2.63157895
0.71428571 1.28205128
0.34482759 0.84033613
0.19230769 0.6097561
0.125 0.51546392
0.09708738 0.50251256
0.0625 0.44642857
0.03984064 0.44444444
 2hidroxisuccínico 2mM
3
2.5

V0 (μmol/min)
2
1.5
1 1
= 𝑚( )+𝑏 1
𝑉0 [𝑆]
0.5
𝑦2 − 𝑦1
𝑚= 0
𝑥2 − 𝑥1
0 0.5 1 1.5 2
1/[Glu] (mM)

0.44444444 − 0.44642857
𝑚=
0.03984064 − 0.0625
𝑚 =0.08756323

0.44444444 = 0.08756323(0.03984064) + 𝑏
𝑏 = 0.44444444 − 3.488575124x10 − 3
𝑏 = 0.4409558649
1
= 0.4409558649
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 =
0.4409558649
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 2.26
𝐾𝑚
= 0.08756323
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
= 0.08756323
2.26
𝐾𝑚 = 0.19

1.66666667 4.16666667
0.71428571 1.96078431 2hidroxisuccínico 5.1mM
0.34482759 1.14942529 4.5
4
0.19230769 0.84033613
3.5
0.125 0.64102564
V0 (μmol/min)

3
0.09708738 0.57471264 2.5
2
0.0625 0.52910053
1.5
0.03984064 0.4784689 1
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2
1/[Glu] (mM)
 1 1
= 𝑚( )+𝑏
𝑉0 [𝑆]
𝑦2 − 𝑦1
𝑚=
𝑥2 − 𝑥1
0.4784689 − 0.52910053
𝑚=
0.03984064 − 0.0625
𝑚 =2.2344684

0.4784689 = 2.2344684(0.03984064) + 𝑏
𝑏 = 0.4784689 − 0.08902265112
𝑏 = 0.3894462489
1
= 0.3894462489
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
𝑉𝑚𝑎𝑥 =
0.3894462489
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 2.56
𝐾𝑚
= 2.2344684
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚
= 2.2344684
2.56
𝐾𝑚 = 5.73

A) Determina el tipo de inhibición que causa el ácido 2-hidroxisuccínico sobre la actividad de la

TGP, FUNDAMENTA la respuesta en términos gráficos y cinéticos.
 2 Hidroxisuccínico
4.5
4
3.5

1/V0 (μmol/min)
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
1/[Glu] (mM)

1/V0 (0 mM) 1/V0 (1 mM) 1/V0 (2 mM) 1/V0 (5.1 mM)

[S] Km Vmax
0 mM 7.38 3.39
1 mM 4.46 2.97
2 mM 0.19 2.26
5.1 mM 5.73 2.56

Análisis

Nuestro ácido 2-hidroxisuccínico causa una inhibición de tipo no competitivo, esto quiere decir que el
inhibidor que el inhibidor es un tipo mixto donde se une con la misma afinidad a la enzima libre como
al complejo enzima-sustrato, ya que, gráficamente podemos observar que todas parten a la misma
altura en el eje de las X pero la pendiente va cambiando, a excepción de la de 5.1 mM ya que se puede
apreciar un leve delineamiento, se puede deber a errores prácticos, por otra parte en comparación a
los términos cinéticos se aprecia una disminución de la Km y la Vmax, esto corresponde con la
literatura ya mencionada, solo con un pequeño desfase en los la línea de 5,1 mM, se desconoce la
causa pero podemos asumir que también se debe a errores en la práctica.