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GUIA DE PRÁCTICAS

Unidad académica: EAP DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ASIGNATURA. : BIOQUIMICA I

SEMESTRE: 2018 – II
INTRODUCCION

La bioquímica es una rama de la ciencia, cuya actividad primordial se halla


dirigida a desentrañar las reacciones básicas que determinan la estructura y el
funcionamiento de los seres vivos.
La enseñanza de la Bioquímica en las distintas áreas de Ciencias de la Salud
requiere de una metodología específica y profunda, en el caso de la Carrera
de Farmacia y Bioquímica se ha preparado el presente manual que permitirá a
nuestros estudiantes contar con un instrumento práctico y didáctico para
coadyuvar en el proceso enseñanza-aprendizaje. El manual, fruto del trabajo
docente tanto teórico como práctico presenta en forma clara el desarrollo de los
laboratorios y los ejercicios que debe realizar cada estudiante para un mejor
resultado académico.
PRACTICA Nº 01

CAPACIDAD AMORTIGUADORA DE UN FLUIDO BIOLOGICO

I. Fundamento teórico

La titulación es una técnica que permite determinar la concentración de una


solución cuya concentración es desconocida utilizando como patrón otra
solución pero con concentración conocida denominada (solución valorada).
La titulación de una sustancia ácida o básica se fundamenta en la reacción de
neutralización de dos especies contrarias, así tenemos que si no conocemos la
concentración de la solución ácida, la solución básica debe estar valorada y
debe conocerse en ambas soluciones los volúmenes utilizados.

HCl + NaOH NaCl + H2O

Los buffer son una mezcla de dos especie químicas relacionadas (ácido ó base
débil y su respectiva sal conjugada) ambas tienen una capacidad para captar y
liberar H+.
Los Buffer están presentes en casi todos los fluidos biológicos ejerciendo un
equilibrio en la concentración de H+.

Dentro de los buffer más conocidos que se encuentra presente en los sistemas
biológicos tenemos:

Buffer bicarbonato HCO3-1 y H2CO3


Buffer Fosfato HPO4-2 y H2PO4-1

Las proteínas y los aminoácidos también ejercen capacidad buffer, debido a los
grupos funcionales que presentan, a pesar que literalmente no son buffer sin
embargo por la función son considerados como buffer biológicos.

II Objetivos:
Determina la concentración de una muestra desconocida mediante la titulación
Determina la capacidad buffer.

III. Materiales y equipos:


3.1 Reactivos.
a. HCl 0,1N
b. NaOH 0,01N
c. Fenolftaleína
d. Agua destilada
3.2 Equipos y materiales
a. Cinta para medir pH
b. Matraz 100 mL
c. Bureta 25ml
d. Soporte universal
e. Pipetas 5 y 10ml
f. Potenciómetro
g. Beaker de 50ml
h. Pinzas de nueces
i. Baguetas

IV. Procedimiento:

a) Titulación de una solución ácido desconocida:


1. En un Matraz agregar 1 mL de la muestra desconocida del ácido y 9
mL de agua destilada, homogenizar.
2. Luego agregue II gotas de fenolftaleína.
3. Iniciar la titulación con NaOH 0.01 N, agregando gota a gota utilizando
la bureta.
4. Observar con que volumen de NaOH cambia de color (debe de
quedar de un color rosado pálido) anotar el gasto del NaOH.
5. Determinar la concentración [H+], mediante la siguiente formula.

[MP] x VMP = [bs] x Vbs

b) Capacidad buffer de la orina:

1. Colocar 2 mL de orina en un beaker, luego agregue 5 mL de agua.


2. Agregue II gotas del indicador de fenolftaleína
3. Titule con la bureta que contiene el NaOH 0.01 N.
4. Anotar el gasto del NaOH, en ambos frascos
5. Determinar la concentración de H+ en cada muestra, con la formula
anterior.
6. Determinar la capacidad amortiguadora de la orina, mediante la
siguiente formula:

β = # n (base adicionado)
Vol buffer (L) x Δ pH
V. Cuestionario:
1. Si el pH de la sangre es de 7,42 ¿Determinar la concentración de
hidrogeniones libres?
2. A una solución de 80 mL de ácido carbónico 0,05 mol/L se le adiciona
20 mL de NaOH 0,01 mol/L.

a) Represente la reacción en ecuación química


b) Después de la mezcla cual es la concentración del ácido y sal
en la solución
c) Determine el pH de la solución
d) Si a la solución final se le agrega 20 mL de agua destilada, cual
será su pH. Explique si existe variación o no.

VI. Fuentes de Información.


a. Devlin Thomás M. Bioquímica con Aplicaciones
Clínicas. Tomo I y II. Barcelona. Edit. Reverté Colombiana.
S. 2000.
b. Luque L, Hermoza A. Biología Molécular e Ingenieria
Genética. Barcelona.Edit. Hartcourt. 2001.

c. Martin D W. Bioquímica de Harper. México .Edit Manual


Moderno. 2000.

d. Rawn M. Bioquímica. Madrid McGraw- Hill .Interamericana.


2003.
PRACTICA Nº 2

EXTRACCIÓN DE LA CASEINA Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO


ISOELECTRICO

I. Fundamento teórico

La leche contiene vitaminas (tiamina, riboflavina, ácido pantoténico y Vit. A,


D y K), minerales (Ca, K, Na, P), proteínas, carbohidratos (lactosa) y lípidos.
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas
globulares y fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a
agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones
intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las
proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales.
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto
globulinas (todas globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que
se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las
fosfoproteinas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a
una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los
grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos
serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal
cálcica (caseinato cálcico).
La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El
pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína
cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a
la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los
grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita
Ca2+ Caseinato + 2HCl  Caseína + CaCl2

Todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en
el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen.
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres
pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos,
neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un
medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los
aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los
grupos amino de Arginina y lisina estarían protonados (-NH3 +).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto
estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo
estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma
neutra (NH2). Las proteínas tienen un pH característico al cual su carga
neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas
positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad
para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.

II. Objetivo

El objetivo fundamental de esta práctica es la determinación del punto


isoeléctrico de la caseína una vez extraída esta mediante procedimiento
químico de la leche entera liquida.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

- Beaker de 25 ml, 50ml, 250ml


- Probeta de 50ml
- Matraz aforado de 50 ml
- Pipetas de 5,0 ml, 1.0ml, 10ml
- Embudo de vidrio mediano
- Papel de filtro
- Termómetro
- Tubos

Reactivos

Agua destilada
Acetato sódico 0,1 N
Ácido acético 0,01 N
Ácido acético 0,1 N
Ácido acético 1,0 N
NaOH 1N
Éter etílico
Etanol al 70%

Materiales y reactivos de uso general:

Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro


Potenciómetro (pH-metro)
Leche entera corriente ( 1 litro)

DESARROLLO EXPERIMENTAL

A. Aislamiento de la caseína:

a. Caliente en un vaso de precipitado 150ml de agua destilada a 38ºC,


añada 50ml de leche y luego gota a gota y con agitación, adicione
ácido acético 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la
leche se corta)
b. Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de
cristal.
c. Lave el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro.
d. Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
e. Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño
previamente pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y
luego adicione 5ml/g de éter etílico.
a. Filtre nuevamente.
b. Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil
manipulación que es la caseína.

B. Preparación de la solución de caseína:

a. Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50ml.


b. Agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta
lograr una solución total de la caseína.
c. Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml,
adicione 5 ml de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta
50ml y mezcle bien.
d. La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

C. Determinación del pI de la caseína:

En diez tubos de 25 ml limpios y secos adicione exactamente los volúmenes


de los reactivos según la siguiente tabla:

TABLA DE DISOLUCIONES

TUBO Acetato Acetico Acetico pH


0.1N 0.1N 0.01 resultante(aprox.)
1 0.5 9.5 - 3.2
2 1 9 - 3.6
3 1.5 8.5 - 3.8
4 2 8 - 4.0
5 3 7 - 4.2
6 4 6 - 4.5
7 6 4 - 4.7
8 8 2 - 5.1
9 6 - 4 5.5
10 8 - 2 6.1

 Medir experimentalmente el pH de todos las muestras, que debe cubrir


un rango aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores
reales en la Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo
caso creciente.

 Añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo.

 Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.


 Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de
colorimetría de 1cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar
bien el contenido de cada tubo para obtener una solución / suspensión
homogénea antes de verter una parte en la cubeta.

 Anotar resultados, representar la absorbancia frente al pH, y determinar


el pI aproximado de la caseína.

IV. Cuestiones
1) ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?
2) Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pI?

V. Fuentes de información:

a. Devlin Thomás M. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas. Tomo I


y II. Barcelona. Edit. Reverté Colombiana. S. 2000.
b. Luque L, Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería Genética.
Barcelona. Edit. Hartcourt. 2001.

c. Martin D W. Bioquímica de Harper. México .Editorial Manual


Moderno. 2000.

d. Rawn M. Bioquímica. Madrid Mc Graw - Hill. Interamericana.


2003.
PRACTICA Nº 3

EXTRACCION DE OLIGOFRUCTANOS E IDENTIFICACION DE


CARBOHIDRATOS

I. Fundamento teórico:

Los carbohidratos son biomoléculas que presenta grupo funcional carbonilo


(aldehído y cetona) y varios grupos hidroxilos en cada carbono.
Los carbohidratos tienen la propiedad química oxidarse por el carbono
anomérico, (grupo carbonilo) dando origen a un ácido orgánico, y produciendo
la reducción de otros compuesto, es por ello que los carbohidratos
principalmente los monosacáridos y algunos disacáridos expresan esta
propiedad, sin embargo los polisacáridos dicha propiedad esta ausente.
Los carbohidratos pueden formar polímeros mediante la unión entre ellos
(enlaces o-glucosidicos) dando origen a monosacáridos, disacáridos,
oligosacáridos y polisacáridos.

Los fructanos son los polisacáridos no estructurales más abundantes en la


naturaleza, presentes en muchas especies de plantas, en hongos del tipo
Aspergillus sp. y en bacterias. De este grupo los más ampliamente estudiados
y de mayor uso a nivel industrial son la inulina y los fructooligosacáridos o FOS,
que se caracterizan por sus enlaces de tipo β-(2-1) entre las unidades de
fructosa, con un grado de polimerización que varía entre 2 y 60 unidades, y se
les considera carbohidratos de cadena corta o de bajo nivel de polimerización.

II. Objetivos:
Extraer oligofructanos del jugo del yacon
Identificar los carbohidratos con los diferentes reactivos.
Explicar el fundamento de reconocimiento de los reactivos.

III. Materiales y reactivos:

 Reactivo de Lugol
 Reactivo de Benedict
 Reactivo de Molish
 Reactivo de Selivanoff
 Ácido clorhídrico 0,5 N
 Alcohol etílico
 Acido sulfúrico
 Muestra A (Galactosa)
 Muestra B (Sacarosa)
 Muestra C (Maltosa)
 Muestra D (Almidón)
 Pipetas 5ml, 10ml, 1ml
 Beaker 250ml
 Rejilla
 Trípode
 Mechero
 Baño maría
 Tubos de prueba 13 x 100mm

IV. Método operatorio:

a. El extracto de yacon se obtiene triturando muestra fresca, se diluyó con


agua y se agitó por 15 min a 80 ºC. Se enfrió y se aforó a 100 mL con
agua destilada. Se filtró y se guardó (muestra E).
b. Reacción con el reactivo de Lugol: esta prueba es utilizada para
identificar polisacáridos:
A B C D E
mL Muestra A 0,5 -- -- -- --
mL Muestra B -- 0,5 -- -- --
mL Muestra C -- -- 0,5 -- --
mL Muestra D -- -- -- 0,5 --
mL Muestra E -- -- -- -- 0,5
mL HCl 0,5 N 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
mL Rvo. de 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Lugol

Llevar a baño María a 100ºC por 3 a 5 minutos. Evaluar el color y el


precipitado.
Si las muestras Son: galactosa, maltosa, sacarosa proteína, almidón.
Indique según resultado que carbohidratos corresponde a cada muestra.

c. Reacción de Molish.
Colocar 2 ml. de muestra problema. Luego adicionar II gotas de
reactivo de Molish, mezclar. Lentamente deslizar por las paredes
del tubo, 1 mL. de ácido sulfúrico concentrado, (reacción
exotérmica). La formación de un anillo de color violeta o púrpura
indica presencia de glúcidos.

d. Reacción de Benedict.
Depositar 2.5 ml de Reactivo de Benedict, calentar hasta
ebullición por 2 minutos. Si no hay cambio de color se adicionan
V gotas de Muestra problema, luego se coloca en B.M. hirviente
durante 3 minutos, luego se deja enfriar. La aparición de una
coloración o, precipitado, amarillo anaranjado o rojo, indica
presencia de glúcidos reductores.
e. Reacción de Selivanoff. En un tubo de prueba se coloca 3 ml
de solución clorhídrica de resorcinol y 6 ml de Muestra
problema. Luego se coloca en Baño de María hirviente por unos
minutos. El desarrollo inmediato de una coloración anaranjado
rojizo indica presencia de pentosas.

V. Cuestionario:

1. Explique el fundamento del reconocimiento de Benedict.


2. Indique dos métodos químicos para reconocer azucares reductores

VI. Fuentes de Información.

a.. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud. España


. Edit. Mc Graw- Hill- Interamericana de. 2001.
b. Luque L y Hermoza A. Biología Molecular e
Ingeniería Genética. Barcelona. Edit. Hartcourt. 2001.
c. Matheus Van Holde. Bioquímica. México. Edit. Mc Graw Hill. 2000.
d. Martin, D.W. Bioquímica de Harper. México. Edit. Manual
Moderno. 2000.
d. Lehninger, A.. Bioquímica. Barcelona .Edit. Omega. 2001.
e. Claros MG, Avila C. Gallardo F. Madrid .Edit. ISBN. 2001
PRACTICA Nº 4

SAPONIFICACIÓN DE UNA GRASA

I. Fundamentación teórica

Los aceites vegetales, como el aceite de coco o de olivo, y las grasas animales,
como el sebo, son ésteres de glicerina con ácidos grasos. Por eso cuando son
tratados con una base fuerte como sosa o potasa se saponifican, es decir
producen la sal del ácido graso conocida como jabón y liberan glicerina. En el
caso de que la saponificación se efectúe con sosa, se obtendrán los jabones de
sodio, que son sólidos y ampliamente usados en el hogar. En caso de hacerlo
con potasa, se obtendrán jabones de potasio, que tienen consistencia líquida.

II. Objetivo:

Poner de manifiesto ciertas propiedades de los lípidos, algunas de las cuales


pueden servirnos para su identificación.

III. Materiales y métodos

Materiales
 Beaker 500ml 100ml,
 Baño maría
 Papel filtro
 Pipetas de 10ml
 Cápsula de porcelana.

Reactivos

 Aceite de palma o aceite de coco


 KOH (1g/ml agua),
 HCl al 10%
 CaCl2 al 10%
 NaCl (sal de cocina).

IV. Procedimiento

Reacción de saponificación
En un vaso de precipitado de 1000ml calienta en un baño maría 15 g de
aceite de palma o aceite de coco. Agitando constantemente agrega 13 ml
de KOH (1g/ml agua). Terminada la adición, continúa calentado en baño
maría y agita durante 50 min. Adicionar cloruro de sodio para separar el
jabón.

V. Cuestionario

1) Si se agita frecuentemente la mezcla de reacción, ¿Se acelera la


velocidad de saponificación? ¿Porqué?

2) ¿Qué son las micelas?

3) Una molécula de jabón, ¿Es o no soluble en agua? Explica tu respuesta.

4) Explica físicamente cómo un jabón es capaz de quitar una mancha de


aceite de una tela.

5) ¿Qué diferencia estructural hay entre un jabón y un detergente?

VI. Fuentes de Información.

a. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud.


España . Edit. Mc Graw- Hill- Interamericana de. 2001.

b. Luque L y Hermoza A. Biología Molécular e


Ingenieria Genética. Barcelona.Edit. Hartcourt. 2001.

f. Matheus Van Holde. Bioquímica. México. Edit. Mc Graw Hill.2000.

g. Martin, D.W. Bioquímica de Harper. México. Edit. Manual


Moderno. 2000.

h. Lehninger, A.. Bioquímica. Barcelona .Edit. Omega. 2001.

i. Claros MG, Avila C. Gallardo F. Madrid .Edit. ISBN. 2001


PRACTICA Nº 5

EFECTO DE CONCENTRACIONES SATURANTES DEL SUSTRAATO


SOBRE UNA CONCENTRACION CONSTANTE DE ENZIMA MICHAELIS Y
MENTEN

I. Marco teórico.

A las reacciones que ocurren en los seres vivos, y que son


catalizadas por proteínas específicas llamadas enzimas se les
denomina reacciones enzimáticas. En estas reacciones las
moléculas sobre las que actúa la enzima en el inicio del proceso
se llaman sustratos, y estas los convierte n en diferentes
moléculas, los productos.

La actividad enzimática se expresa en unidades de micromoles


de sustrato convertido en producto por minuto, Cada reacción
requiere de un enzima apropiado, la ausencia de enzima trae
como consecuencia , que la reacción no se realice, ó que lo
haga lentamente, hecho que lo vincula con la velocidad de la
reacción que cataliza, es importante anotar que el enzima
incrementa la velocidad de la reacción sin cambiar el proceso, no
modifica la constante de equilibrio de la reacción y lo que es
fundamental el enzima no se consume.

En una reacción enzimática, los productos se forman a


expensas de la desaparición de los correspondientes sustratos,
en tanto la enzima (E) no se modifica.

El mecanismo de reacción enzima-substrato se expresa así:

(E) + (S) (ES) (E) + (P)

Los factores que modifican la actividad enzimática son :

1. Concentración de substrato (S).


2. Concentración de enzima (E).
3. pH del medio de reacción.
4. Influencia de la temperatura.
5. Efecto de inhibidores y activadores.
6. Presencia de cofactores y coenzimas.
7. Modulación alostérica de la A.I.
8. Efecto de la modificación covalente.
9. Activación proteolítica de la A.I.

II. Competencias.

Determinar el Km experimental de la pepsina , usando como


sustrato la albúmina, a partir de una gráfica de v i contra [S]
(Ecuación de Michaelis-Menten) y/o en una gráfica de dobles
recíprocas 1/vi vs 1/[S] (Ecuación de Lineweaver-Burk).

III. Materiales y equipos.

3.1. Equipos y material.

a. Espectrofotómetro.
b. B.M. a 37ºC.
c. Baño de hielo.
d. Tubos de prueba de 16 x 150mm.
e. Pipetas de 1 y 10 mL.
f. Gradillas.

3.2. Reactivos.

a. Solución de albúmina al 2 %.
b. Solución de pepsina al 1%.
c. Acido clorhídrico 1N.
d. Agua destilada.

IV. Procedimiento.

a. E n una gradilla disponer 7 tubos de


prueba de 13 x 100 mm. y proceder
como sigue:

TUBOS 1 2 3 4 5 6 7

Agua destilada 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0


ml.

HCl 1N ml. 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Albúmina ml. 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

b. Leer en el espectrofotómetro a 440 nm, el contenido de los


tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 7 y anotar las absorbancias (Lectura
inicial ).
c. Incubar los 7 tubos a 37ºC durante 5 minutos.
d. Adicionar 0.5 ml de la pepsina, a cada uno de
los tubos del 1 al 7 e Incubar a 37º C por 10 minutos.
e. Retirar del Baño a 37ºC y llevar a baño de hielo.
f. Leer en el espectrofotómetro a 440nn, nuevamente el
contenido de los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7. (lectura final ).

Resultados. La Actividad enzimática se obtiene:

Actividad enzimática = Lectura inicial – Lectura Final.


V. Cuestionario.

a. Esquematice los factores que afectan la actividad enzimática.


b. Explicite en que consiste la cooperatividad en los enzimas
c. Grafique la bomba de sodio y potasio y describa su importancia
biológica.
d. Elabore un mapa conceptual acerca de los transportes que se
realizan a través de los ionóferos.
e. Explique las aplicaciones clínicas de la ecuación de Linewaber y
Burk.
.

VI. Fuentes de Información.

a. Devlin Thomas M. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas.


Tomos I y II. Barcelona. Reverté Colombiana. S. 2000.

b. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud. España.


McGraw Hill- Interamericana. 2001.

c. David L N, Cox M M. y Lehninger A. Principios de Bioquímica.


Barcelona. Omega. 2001.

d. Luque L y Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería


Genética. Barcelona. Hartcourt. 2001.
PRACTICA Nº 6

DESCRIBA E INTERPRETE LOS FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD


ENZIMATICA EFECTO DE LA TEMPERATURA Y PH

I. Marco teórico

Las enzimas son proteínas que funcionan en un determinado medio, bien sea
intra o extracelular, donde las condiciones pueden variar, y por lo tanto el nivel
de actividad de la molécula puede verse modificado a lo largo del tiempo.
Dentro de los factores que afectan a la actividad enzimática merecen
destacarse:

El pH: Todas las enzimas tienen en su estructura primaria aminoácidos con


grupos radicales ionizables. Dependiendo del pH del medio en el que se
encuentren pueden no tener carga, o por el contrario estar cargados, bien
positiva o negativamente. Estas cargas sirven para estabilizar la conformación
natural de la proteína y cuando el pH las cambia, también se modifica la
estructura, llevando en último extremo a la desnaturalización de la proteína, y
en el caso de las enzimas a la pérdida de actividad.
Dependiendo del medio dónde deba ejercer su acción catalítica, cada enzima
tendrá su conformación más adecuada, y por lo tanto su máxima actividad,
alrededor de un valor concreto de pH, que recibe el nombre de pH óptimo. El
cambio, bien sea hacia valores más altos o más bajos provocará una
disminución de la actividad.
En el caso de la pepsina gástrica, una enzima digestiva, su pH óptimo está
alrededor de 2 ya que el medio estomacal es un medio de gran acidez;
mientras que otra enzima digestiva como la tripsina, cuyo lugar de acción
catalítica es el intestino delgado, presenta su pH óptimo aproximadamente a 8.

La temperatura: Este factor presenta dos efectos contrapuestos, por un lado


el aumento de temperatura produce, de forma general, un aumento en la
velocidad de cualquier reacción química; pero por otro lado, las enzimas
experimentan desnaturalización y pérdida de actividad al superar una
determinada temperatura. En este caso resulta más difícil determinar como en
el pH una temperatura óptima, y las curvas de actividad presentan un
incremento inicial de actividad más pronunciado para posteriormente al irse
desnaturalizando, decrece la velocidad de reacción.

II. Objetivo

Conocer la influencia del pH y la temperatura en la actividad enzimática


en los diferentes procesos metabólicos

III. Materiales
a. Bibliografía del silabo de Bioquímica I.
b. Bibliografía de carácter científico (revistas, manuales, etc.).
c. Retroproyector.
d. videos, VHS, etc.
e. Libros, revistas, folletos.
f. CD. Power point.

IV. Procedimiento.

Se realizará de acuerdo a las normas de aprendizaje establecidas


por la Universidad, donde los alumnos harán una exposición de los
temas, los cuales serán discutidos y analizados junto con el
docente.
V. Resultados.

Formular las conclusiones alcanzadas en el seminario

VI. Cuestionario.

a. De ejemplos de enzimas que se desnaturalizan a pH


básicos.
b. Elabore una tabla con el pH y temperatura optima de las
diferentes enzimas.
c. ¿Cómo utiliza la Industria farmacéutica las inhibiciones
enzimáticas?
d. Elabore un mapa conceptual de las inhibiciones enzimáticas.

VII. Fuentes de Información.

a. David LN, Cox M.M. y Lehninger A. Principios de Bioquímica.


Barcelona. Omega 2001.
b. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud
.España. McGraw-Hill Interamericana. 2001.

c. Luque L, Hermoza A. Biología Molécular e Ingenieria Genética.


Barcelona. Hartcourt 2001.
d. Martin DW . Bioquímica de Harper. México. Manual
Moderno. 2000.
PRACTICA Nº 7

SEMINARIO: LIPOSOMAS, TRANSPORTADORES GLUT, ESTUDIO DE


MEMBRANA DEL ERITROCITO

I. Marco teórico

La vida como la conocemos hoy no existiría si no existieran las membranas.


Estas estructuras definen el límite entre lo que se considera una célula y su
entorno. En el caso de las células eucariotas, las membranas también definen
las organelas internas. Las membranas tienen una función más compleja que
ser simples barreras delimitantes, son estructuras activas donde ocurren
procesos metabólicos como transporte de moléculas, transducción de señales,
respiración celular y generación de potenciales eléctricos entre otros. Es por
esto que las membranas están constituidas no solo de lípidos sino también de
proteínas y carbohidratos.

 Liposomas: son vesículas microscópicas esféricas, de 20 a 30


nanómetros de diámetro. Estan rodeadas por una membrana compuesta
por una bicapa de fosfolípidos y colesterol , que envuelve a una
sustancia acuosa de tal manera que sirven para transportar esta
sustancia. Tienen la ventaja de poder transportar la sustancia que
contienen a un lugar del cuerpo con gran precisión. Como su membrana
es similar a las membranas celulares, los liposomas pueden
incorporarse a células vivientes y depositar en ellas su contenido. Los
liposomas, al tener una capa externa de tipo graso, son absorbidos con
facilidad por la piel, con lo que la distribución de la sustancia hidratante
que contienen es mucho más eficaz y se necesita en menores
cantidades que si se vertiera el líquido directamente sobre la piel.

 Transportadores GLUT : Son proteínas transportadoras de glucosa:


GLUT, por difusión facilitada y constituyen una familia de proteínas,
estrechamente relacionadas entre sí, que cruzan doce veces a través de
la membrana celular. Se diferencian de los transportadores de glucosa
dependientes del sodio quien realiza el transporte activo secundario de
dicho glúcido hacia el exterior del intestino y de los túbulos renales.
Glut 1: se ha encontrado en el cerebro y en los eritrocitos; actúa como
una puerta en la cual la proteína une al azúcar en la superficie externa
de la membrana y sufre un cambio conformacional que conduce al
azúcar hacia el interior de la célula, donde se desune. Mientras el Glut
2 es el transportador de glucosa en hígado, riñón, intestino y células
Beta del páncreas. El Glut 1 y Glut 3 están presentes en la membrana
plasmáticas de casi todas las células ( eritrocitos y encéfalo); Glut 1,
tiene una afinidad elevada para la glucosa y el GLUT 3 por las
neuronas, Glut 4 es la isoforma dependiente de insulina, presente en el
músculo y en las células adiposas. Su función es captar glucosa
estimulada por la insulina, Glut 5 se encuentra en el intestino delgado
en el lado arterial de la célula epitelial, y actúa conjuntamente con el
cotransportador de la glucosa y el sodio en el lado luminal.
II. Objetivo

Conocer la importancia de las membranas en los diferentes procesos


metabólicos así como el transporte a través de ella.

III. Materiales

a. Bibliografía del silabo de Bioquímica


b. Bibliografía de carácter científico (revistas, manuales, etc.).
c. Retroproyector.
d. videos, VHS, etc.
e. Libros, revistas, folletos.
f. CD. Power point.

IV. Procedimiento.

Se realizará de acuerdo a las normas de aprendizaje establecidas


por la Universidad, donde los alumnos harán una exposición de los
temas, los cuales serán discutidos y analizados junto con el
docente.
V. Resultados.
Formular las conclusiones alcanzadas en el seminario

VI. Cuestionario.

a. De ejemplos de transportadores.
b. ¿Cómo se aprovecha en la Industria farmacéutica el
transporte a través de membranas ?
c. Elabore un mapa conceptual de las formas de transporte
a través de membranas.

6.7.Fuentes de Información.

a. David LN, Cox M.M. y Lehninger A. Principios de Bioquímica.


Barcelona. Omega 2001.
b. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud
.España. McGraw-Hill Interamericana. 2001.

c. Luque L, Hermoza A. Biología Molécular e Ingenieria Genética.


Barcelona. Hartcourt 2001.
d. Martin DW . Bioquímica de Harper. México. Manual
Moderno. 2000.
PRACTICA Nº 8

DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDON

I. Marco teórico

El almidón es un polisacárido muy abundante en los vegetales en los cuales se


encuentra generalmente en forma de pequeños gránulos microscópicos de
estructura cristalina. El grano de almidón está formado por amilosa y
amilopectina. La amilopectina se encuentra en la parte exterior del grano, es
insoluble en agua y no da coloración con la solución de lugol. La amilosa se
encuentra en la parte interna y da coloración violeta en presencia de lugol.

Por otro lado, la amilasa cataliza la hidrólisis del almidón, glucógeno y dextrinas
superiores en moléculas cada vez más pequeñas, en un proceso progresivo
dando como producto final el disacárido maltosa. La amilasa es una mezcla de
enzimas. En el hombre la encontramos en la boca (amilasa salival) y en el
intestino (amilasa pancreática). La amilasa pancreática se considera idéntica
en su acción a la amilasa salival. El pH óptimo para la amilasa salival es de 6.6.
Cuando se encuentra en medios con pH más ácidos o más alcalinos, la
actividad de la enzima disminuye o se inhibe por completo. La presencia de
sales también modifica la actividad de esta enzima.

En esta práctica, el avance de la hidrólisis del almidón se demostrará


siguiendo la formación del complejo con yodo el cual da una coloración violeta
con los almidones. A medida que se va efectuado la hidrólisis, el color azul va
desapareciendo y aparece un color rojizo (eritrodextrinas) y posteriormente se
observa una coloración amarilla, debida únicamente a la solución de yodo, lo
que demuestra que el almidón ha sido hidrolizado hasta maltosa.

dextrinas
almidón → almidón → superiores → acrodextrinas
soluble + + → Maltosa
molec. Maltosa molec. Maltosa

II. Objetivo:

Verificar la actividad de la amilasa sobre el almidón a través de su producto de


hidrólisis.

III. Materiales y métodos

Materiales

 Tubos de ensayo
 Baño maría
 Placa de porcelana excavada
 Gradilla
 Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml
 Pipeta pasteur
 Pinzas para tubo.
 Almidón 1% en regulador de fosfatos 0.02 M
 Glucógeno 1% en regulador de fosfatos 0.02 M
 Glucogeno al 1% en regulador de fosfatos 0.02 M
 Solución de NaCl 0.5N
 Solución de amilasa pancreática al 1% o amilasa salival
 Solución de lugol.

IV. Procedimiento

Prepare una serie de 7 tubos de ensayo debidamente etiquetados de acuerdo a


la siguiente tabla, utilizando 5 diluciones diferentes de enzima comercial o
saliva:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Almidón 1% 1 1 1 1 0 0 0
ml
Agua 0 0 0 0 1 1 1
destilada
preincubacion Dejar 37Cº por 5min
Enzima al 1% Sin Dil. Dil. Dil. Dil. Dil. Dil.
diluir 1:5 1:10 1:20 1:5 1:10 1:20
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
NaCl 5% 1gta 1gta 1gta 1gta 1gta 1gta 1gta
incubación Dejar 37Cº
Lectura color
2min
4min
6min
8min
10min
12min
Mas tiempo

Antes de agregar la enzima y a intervalos de 1 minuto después de


adicionada, haga la prueba de gota del contenido de cada tubo con solución
diluida de yodo (lugol).

Transcurridos 10 minutos, haga las determinaciones cada dos minutos hasta


que la prueba sea negativa. Hacer las lecturas comparando con el tubo testigo.
ANOTE EL TIEMPO INICIAL Y FINAL DE LA DIGESTIÓN EN CADA TUBO.

En el reporte (Resultados) indique el tiempo necesario para que la reacción sea


completa en cada tubo y calcule las Unidades de Amilasa en cada tubo,
definiendo una Unidad de amilasa como: “número de mililitros de solución de
almidón al 1% que pueden ser hidrolizados en 30 min, por 1 ml de extracto
puro, en condiciones de pH y temperatura que se haya trabajado.

V. Cuestionario

a. Haz los cálculos para determinar las unidades de amilasa.


b. Explique ¿como demostraste que el almidón fue totalmente
transformado en sus subproductos al reaccionar con la amilasa?
c. Que son las Unidades (enzimáticas). Todas son iguales o varían con el
tipo de sustrato que usas?.
d. Como afecta el NaCl en la actividad de la amilasa?.
e. En el ser humano, donde podemos encontrar amilasa?
f. Cual es el pH en el cual la actividad de la amilasa es óptima?.
g. Haga un esquema de la estructura de amilosa y de amilopectina
h. Describa un método para determinar azúcares reductores.

VI. Fuentes de Información

1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of


practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.
2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and
practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA.
3. Voet, D., and J.G. Voet. 1995. Biochemistry. Second Edition. John
Wiley & Sons, Inc. U.S.A
4. Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000. Biochemistry.
Third edition. Addison Wesley Longman Inc. USA.
5. Stryer, L. 1995. Bioquímica. Cuarta edición. Editorial Reverte.
Barcelona España.
PRACTICA Nº 9
AISLAMIENTO DE GLUCOGENO DEL HIGADO DE POLLO

I. Marco teórico.

El glucógeno como sustancia de reserva, se encuentra en


muchos tejidos animales, especialmente en el hígado y
músculos. El hígado de gran número de especies animales
tiene la capacidad de almacenar la glucosa bajo la forma de
glucógeno.

El glucógeno puede ser extraído por varios métodos, uno de los


cuales es la hidrólisis alcalina del tejido, la que degrada a las
proteínas y otros constituyentes de la célula dejando al
glucógeno, posteriormente puede ser precipitado por su baja
solubilidad en alcohol.

Si una persona es sometida a un período de ayuno durante 24


horas, el glucógeno hepático disminuye ya que tiene que cubrir
las necesidades de glucosa.

La vía de síntesis y degradación de este polisacárido,


denominadas glucogénesis y glucogenólisis respectivamente,
están integradas en el conjunto de reacciones de la red
metabólica celular a través de un metabolito común la glucosa-
6-fosfato.

II. Objetivo

Aislar glucógeno del higado de pollo y determina el


porcentaje de glucógeno contenido en el hígado.

III. Materiales y equipos.

3.1. Equipos y materiales.

a. Espectrofotómetro.
b. Centrifuga.
c. Baño María 37ºC.
d. Cocina eléctrica.
e. Mortero y pilón.
f. Balanza.
a. Gradilla.
b. Pipeta de y 10 ml.
c. Micropipeta de o a 50 uL
d. Tubos de prueba de 13 x 100mm y de 16 x 150 mm.
e. Micropipetas de oa 50Ul con punteras.
f. embudo mediano; baguetas y punteras amarillas.
g. Pinzas de madera y bola de vidrio de 100 mm de diámetro

3.2.Reactivos.

a. Solución saturada de sulfato de sodio.


b. Set completo de reactivos enzimáticos para determinación
de glucosa.
c. KOH al 30% ; NaOH O.5M.
d. HCl 1.2 M
e. Alcohol etílico absoluto
f. Indicador rojo de fenol.
g. Agua destilada.

IV. Procedimiento.

A. Aislamiento de glucógeno

a. En un tubo de prueba de 16 x 150 mm, depositar 5g.


de hígado (triturado) , adicione 4 mL de KOH al 30%
luego colocar el tubo en Baño María hirviente
durante 20 minutos, agitando de vez en cuando.
b. Retirar los tubos y colocarlos en un recipiente con agua
helada.
a. Adicionar 0.4 mL de solución saturada de sulfato
de sodio y mezcle enérgicamente
b. Adicione luego 8 mL de alcohol absoluto (para pp el
glucógeno), deje en el baño de hielo durante 5 minutos.
c. Centrifugue por 5 minutos a 3,000 g.
d. Elimine el sobrenadante y disuelva el glucógeno pp en 5
mL de agua destilada, (caliente suavemente para
disolver).

B. Hidrólisis y determinación del glucógeno.

a. En una gradilla disponga dos tubos de prueba, y adicione a


cada tubo 2mL de la solución anterior.
b. Adicionar a cada tubo 2 Ml de HCL 1.2 M., tape la boca
de los tubos con una bolita de vidrio, y luego coloque los
tubos a B.M. por 2 hrs.
c. Agregue a cada tubo I gota de rojo de fenol y neutralice con
NaOH 0.5 M hasta que el indicador vire de rosa a
anaranjado y luego a amarillo.
d. Deje enfriar y luego complete a 5 ml con agua destilada.
e. Determine luego glucosa por el método de la glucosa
oxidasa.

V. Resultados.
El glucógeno se expresa en mg/dL de glucosa.

VI. Cuestionario.

a. Grafique la cascada glucogenolítica


b. Fundamente la causa por la que la glucosa no se
almacena en el organismo
como glucosa, sino bajo la forma de glucógeno.
c. Describa como actúan las enzimas que intervienen en la
glucogenolisis.
d. ¿Cómo se realiza la regulación de la glucogenogenésis?

VII. Fuentes de Información.

a. Lehninger, A. Bioquímica. Barcelona . Omega.


2002.
b. Devlin TM. Bioquímica con aplicaciones clínicas.
Barcelona. Reverté Colombiana S.A. 2000.
c. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias
de la Salud. España McGraw - Hill- Interamericana.
2001.
d. Luque L. y Hermoza A. Biología
Molecular e Ingeniería Genética. Barcelona.
Hartcourt. 2001.
e. Martin DW. Bioquímica de Harper. México.
Manual Moderno.2000.
PRACTICA Nº 10

SEMINARIO: ACTIVIDAD DE LA LACTATO DESHIDROGENASA EN SUERO


Y LA DEFICIENCIA DE LA 6 FOSFATO DESHIDROGENASA

I. Marco teórico

La enzima lactato deshidrogenasa (LDH), la cual controla la formación y


utilización de lactato, ha sido clasificada en cinco isoformas con distintas
afinidades por el lactato. La isoforma H (isoforma cardíaca) es sensible a
la inhibición por piruvato y se ha sugerido que cataliza la transición de
lactato a piruvato, mientras que la isoforma M (isoforma muscular) posee
una mayor afinidad por la conversión de piruvato a lactato.
Las fibras glucolíticas poseen la mayor actividad total de LDH, y un alto
porcentaje de la isoforma M (LDH4 y LDH5), mientras que las fibras
oxidativas tiene una actividad total de LDH menor y un alto porcentaje de
la isoforma H (LDH1 y LDH2).

Esta oxidorreductasa cataliza una reacción redox, en la que el piruvato


es reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+. Dado que
la enzima también puede catalizar la oxidación del hidroxibutirato,
ocasionalmente es conocida como Hidroxibutirato Deshidrogenasa
(HBD).

Participa en el metabolismo energético anaerobio, reduciendo el piruvato


(procedente de la glucólisis) para regenerar el NAD+, que en presencia
de glucosa es el sustrato limitante de la vía glucolítica.

Los vertebrados, en algunos tejidos o tipos celulares, obtienen la mayor


parte de su energía del metabolismo anaerobio (toda en el caso de
eritrocitos dado que carecen de mitocondrias).

II. Objetivo
conocer la importancia de la deficiencia de la 6 fosfato deshidrogenasa
diferentes procesos metabólicos.

III. Materiales

c. Bibliografía del silabo de Bioquímica


d. Bibliografía de carácter científico (revistas, manuales, etc.).
g. Retroproyector.
h. vides, VHS, etc.
i. Libros, revistas, folletos.
j. CD. Power point.

IV. Procedimiento.

Se realizará de acuerdo a las normas de aprendizaje establecidas


por la Universidad, donde los alumnos harán una exposición de los
temas, los cuales serán discutidos y analizados junto con el
docente.
V. Resultados.
Formular las conclusiones alcanzadas en el seminario

VI. Cuestionario.

a. Explique el Ciclo de Cori.


b. Elabore un mapa conceptual de la actividad biológica de
la enzima lactato deshidrogenasa.
c. Explique el incremento de LDH en tumores malignos.

VII. Fuentes de Información.

a. David LN, Cox M.M. y Lehninger A. Principios de Bioquímica.


Barcelona. Omega 2001.
b. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud
.España. McGraw-Hill Interamericana. 2001.

c. Luque L, Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería Genética.


Barcelona. Hartcourt 2001.
d. Martin DW. Bioquímica de Harper. México. Manual Moderno.
2000.
PRACTICA Nº 11

SEMINARIO: REGULACION HORMONAL DEL METABOLISMO DE LOS


CARBOHIDRATOS Y DIABETES MELLITUS Y HEMOGLOBINA
GLICOSILADA.

I. Marco teórico

La glucosa es el principal combustible en el metabolismo celular, especialmente


en el sistema nervioso central, donde los monosacáridos constituyen la única
fuente de energía. Cabe señalar que la entrada de glucosa a la célula nerviosa
depende únicamente de su .concentración en la sangre, no siendo afectada por
la insulina u otras hormonas. Este hecho determina la gran importancia que
tiene para el organismo la mantención de la glucemia a un nivel constante y
suficiente para satisfacer el alto requerimiento energético del cerebro.

La glucemia normal es aproximadamente 100 mg%. La glucosa sanguínea


proviene, por una parte, de los hidratos de carbono ingeridos con los alimentos,
en los cuales constituyen la mayor proporción (glucosa exógena). Por otra
parte, la sangre recibe glucosa por vía endógena, proveniente de la
degradación del glucógeno (glucogenólisis) o de la síntesis de glucosa a partir
de otras moléculas como aminoácidos o lípidos (gluconeogénesis). En el curso
del metabolismo intermedio de los hidratos de carbono, la glucosa se degrada
hasta la formación de CO2 y H2O, liberando energía térmica y química
necesaria para el funcionamiento normal del organismo. Otra parte de la
glucosa se acumula en el hígado y en los músculos en forma de glucógeno,
polisacárido que representa la principal reserva del organismo en hidratos de
carbono. Por último, en el hígado se efectúa la síntesis de aminoácidos, ácidos
grasos y glicerol a partir de glucosa, procesos reversibles, ya que estos
compuestos pueden reconvertirse a glucosa. El balance de entradas y salidas
de glucosa hacia y desde la sangre y su papel determinante del nivel
glucémico.

La regulación de la glucemia se efectúa a través de hormonas que modulan la


actividad de las enzimas responsables de los procesos anteriormente
mencionados. De acuerdo a su acción, estas hormonas pueden ser divididas
en: a) hipoglucemiantes (insulina); b) hiperglucemiantes (Glucagon, adrenalina,
glucocorticoides, hormona de crecimiento, tiroxina).
 Diabetes Mellitus

Es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por


hiperglicemia, consecuencia de defectos en la secreción y/o en la acción
de la insulina. La hiperglicemia crónica se asocia en el largo plazo daño,
disfunción e insuficiencia de diferentes órganos especialmente de los
ojos, riñones, nervios, corazón y vasos sanguíneos.

 La hemoglobina glicosilada (A1C)

Es una prueba que se debe hacer a toda persona que padece diabetes.
La hemoglobina es una proteína que se encuentra en los glóbulos rojos
(hematíes). La fracción “A1C” es una hemoglobina que ha sido
modificada porque durante su proceso de formación se le ha unido
glucosa (azúcar).
Mientras más glucosa haya en la sangre, más glucosa se pegará a la
célula de hemoglobina que está en formación.
Esta prueba le provee información al médico de cómo han estado sus
niveles de glucosa en la sangre en los últimos tres meses, que es el
tiempo promedio de vida de un hematíe. La prueba de hemoglobina
glicosilada ayuda a comprobar si tu plan de acción y tratamiento para
manejar la condición de diabetes ha sido efectivo o si requiere ser
modificado.

I. Objetivo

Conocer la importancia de la regulación en el metabolismo de los


carbohidratos.

II. Materiales

e. Bibliografía del silabo de Bioquímica


f. Bibliografía de carácter científico (revistas, manuales, etc.).
k. Retroproyector.
l. vides, VHS, etc.
m. Libros, revistas, folletos.
n. CD. Power point.

III. Procedimiento.

Se realizará de acuerdo a las normas de aprendizaje establecidas


por la Universidad, donde los alumnos harán una exposición de los
temas, los cuales serán discutidos y analizados junto con el
docente.
IV. Resultados.
Formular las conclusiones alcanzadas en el seminario
V. Cuestionario.

a. Describa la bioquímica de la Diabetes Mellitus.


b. Elabore un mapa conceptual de las formas de regulación
en el metabolismo de los carbohidratos.

6.7.Fuentes de Información.

a. David LN, Cox M.M. y Lehninger A. Principios de Bioquímica.


Barcelona. Omega 2001.
b. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud
.España. McGraw-Hill Interamericana. 2001.

PRACTICA Nº 13
DETERMINACION DE TRANSAMINASAS

1. Marco teórico.

Las transaminasas son dos: la alaninoaminotransferasa (ALT -GPT) y


la aspartatoaminotransferasa (AST-GOT). La elevación de
transaminasas se produce por una alteración en la permeabilidad
celular, con salida de las enzimas desde el hígado al torrente
circulatorio. La concentración de ellas en el hepatocito es muy elevada
y cada vez que se altera difusamente la permeabilidad de la membrana
citoplasmática, sea por necrosis o por inflamación, las transaminasas
experimentan un aumento de actividad en sangre periférica.

La actividad en plasma es importante en presencia de un daño


hepático agudo, donde la inflamación y la necrosis celular son un
fenómeno masivo (sobre 500 mU/ml y habitualmente sobre 1000
mU/ml).

En el daño hepático crónico, el incremento de transaminasas es


común, pero no es nunca de gran magnitud, llegando por lo general a
niveles de alrededor de 200 mU/ml. Esto ocurre porque el daño es
difuso, pero no es agudo. Esta alteración de la permeabilidad se
produce en parte por el efecto detergente de las sales biliares que se
retienen y en parte por el proceso inflamatorio crónico, presente en la
mayor parte de las cirrosis.

Las transaminasas requieren la coenzima piridoxal-fosfato, que se


convierte en piridoxamina en la primera fase de la reacción, cuando un
aminoácido es convertido en un cetoácido. La piridoxamina enlazada a
la enzima reacciona con alanina, oxalacetato o alfa-cetoglutarato,
dando piruvato, ácido aspártico o ácido glutámico, respectivamente.

Cuando los niveles de glucosa en sangre son bajos, el organismo debe


romper las proteínas en aminoácidos, a expensas del tejido muscular.
La preferencia de las transaminasas del hígado por el oxalacetato o el
alfa-cetoglutarato desempeña un papel fundamental en la canalización
del nitrógeno desde el metabolismo de los aminoácidos a asparagina y
glutarato, para la conversión a urea que sirve como excreción del
nitrógeno. Del mismo modo sucede en los músculos, donde el uso del
piruvato en la transaminación produce alanina, que es llevada por la
corriente sanguínea al hígado. Allí, otras transaminasas regeneran el
piruvato, que proporciona un valioso precursor para la
gluconeogénesis.

2. Competencia.
Determina la concentración en suero, de las transaminasas:
alaninoaminotransferasa y aspartatoaminotransferasa.

3. Material y equipos.
3.1. Equipos y material.
a. Espectrofotómetro.
b. Centrifuga.
c. Baño María regulado a 37ºC.
d. Jeringas descartables.
e. Micropipietas de 0 a 50 uL
f. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
g. Gradilas, algodón, ligadura.

3.2. Reactivos
a. Sustrato GOT.
b. Sustrato GPT.
c. Standard de Piruvato.
d. Reactivo de color de 2, 4- dinitrofenilhidrazina

4. Procedimiento.
4.1. Hacer la curva de calibración de acuerdo al siguiente esquema.

REACTIVOS TUBOS
1 2 3 4 5 6
Agua destilada ( mL ) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Standard (mL.) - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Sustrato GOT (mL ) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Reactivo de color mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Mezclar e incubar a 37ª C x 20 minutos a la temperatura del cuarto
NaOH 0.4 N mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Mezclar. Reposo 5 minutos . Leer a 505 nn contra el blanco que es el
tubo Nº 1
UNIDADES U /L U /L U /L U /L U /L U /L
GOT 0 22 55 95 150 215
GPT 0 25 50 83 126 -
Graficar en papel milimetrado las unidades de transaminasa en el eje
X y las absorbancias en el eje Y.
4.2. Determinación de transaminasas en suero.
a. En una gradilla disponer tres tubos marcados B (blanco); P1
(GOT ) y P2 (GPT ) y proceder como sigue:

Blanco P1 GOT P2 GPT


Sustrato GOT mL 0.5 0.5 -
Sustrato GPT mL - - 0.5
Incubar a 37ª C x 5 minutos
Agua destilada mL 0.2 - -
Suero - 0.2 0.2
Incubar a 37ªC 60 min 60 min 30min.
Reactivo de color mL 0.5 0.5 0.5
Incubar a temperatura ambiente x 20 minutos
NaOH 0.4 N mL 5 5 5
Mezclar por inversión y leer a 505 nn

4.3. Cálculos.

Interpolar las lecturas obtenidas para GOT y GPT en la curva de


calibración para obtener las unidades respectivas de
transaminasas.

4.4.Valores de transaminasas referenciales.

GOT De 5 a 40 U/L
GPT de 5 a 45 U/L

5. Cuestionario.

a. ¿Qué ocurre, si una persona bebe alcohol en forma


permanente. ¿Porqué?
b. El dosaje de las transaminasas , se puede llevar a cabo
sin la presencia del piridoxal fosfato
c. Cómo dosaría Ud un suero que de antemano le indican ,
que tiene más de mil unidades de TGO
d. Explique a que se debe que para calcular las unidades
de aminotransferasas no se utilice factor.
e. Considera Ud, que un suero hemolizado, no se puede
utilizar para determinar aminotransferesas.

6. Fuentes de Información
a. Reitman and Frankel. Am. J. Clin. Path. 28 ( 56 ), 1957.
b. Lehninger, A. Bioquímica. Barcelona. Omega. 2002.
c. Luque L y Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería
Genética. Barcelona.
Hartcourt. 2001.
d. Martin DW. Bioquímica de Harper. México. Manual
Moderno. 2000.
PRACTICA Nº 14

DETERMINACION DE UREA

1. Marco teórico.
La úrea es el metabolito final del metabolismo de las proteinas ,es
excretada en grandes cantidades por la orina. Su excreción es la
función principal del riñón, representando por sí sola bastante más de
la mitad del residuo sólido de la orina. Usualmente constituye del 80 al
90% del nitrógeno total; El cuerpo produce en promedio 25 a 30
gramos de urea al día –algo más en personas que comen dieta rica en
proteínas, menos en personas con dieta pobre en proteínas Toda esta
urea debe eliminarse por orina; de lo contrario se acumulará en líquidos
corporales.

Los dos factores principales que establecen el ritmo de excreción de


urea son: 1) la concentración de urea en el plasma, y 2) la intensidad
de filtración glomerular. Estos factores aumentan la concentración de
úrea.

En general, la cantidad de úrea que pasa por los túbulos y va a la orina


es aproximadamente proporcional a la carga de úrea que penetra en
los túbulos proximales, en promedio 50 a 60%. Sin embargo, esto solo
es cierto cuando la intensidad de filtración glomerular es normal.

Cuando la intensidad de filtración glomerular es muy baja, el filtrado


persiste en los túbulos por largo tiempo, antes de acabar en la orina.

Como todos los túbulos son por lo menos ligeramente permeables a la


urea, cuanto más tiempo persista el liquido tubular en los túbulos,
mayor reabsorción de úrea hacia la sangre; la proporción de úrea
filtrada que llega a la orina disminuye considerablemente.

Por otra parte, cuando la filtración glomerular es muy intensa, el liquido


pasa a través del sistema tubular tan rápidamente que se reabsorbe
muy poca úrea. Por lo tanto con intensidad de filtración glomerular muy
elevada, casi el 100% de úrea pasa a la orina.

Es importante destacar que en aquellos pacientes con insuficiencia


renal se debe conservar la intensidad de filtrado glomerular en valores
altos, debido a que cuando esta disminuye demasiado, se incrementa
la úrea en sangre.

2. Competencia.

Determinar úrea en sangre por el método enzimático de la ureasa.


3. Materiales y equipos.
3.1. Equipos y materiales.
a. Espectrofotómetro.
b. Centrifuga.
c. Baño María regulado a 37º.
d. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodón.
e. Tubos de prueba de 13 x 100 mm.
f. Micropipetas de 0 a 50 uL., pipetas de 1 , 5 y 10 ml.
g. Gradillas, baguetas.

3.2.Reactivos.
a. Reactivo 1: contiene fenol y nitroprusiato de sodio.
b. Reactivo 2: contiene una solución concentrada de
hipoclorito de sodio e hidróxido de sodio.
c. Ureasa en solución.
d. Standard de úrea solución de úrea 60 mg / dL.

4. Procedimiento.
a.En una gradilla disponer 3 tubos de prueba de 13 x 100 ml.,
marcarlos con las letras S (standard ); P (problema ) y B
(blanco ) y proceder como sigue :

B S P
Standard - 20ul -
Suero - - 20ul
Ureasa I gota I gota Igota
Mezclar por agitación suave e incubar x 5 minutos a
37ºC Luego agregar
Reactivo Nº 1 mL. 1 1 1
Reactivo Nº 2 mL. 1 1 1
Mezclar por agitación suave e incubar x 5 minutos a
37ºC Luego agregar
Agua destilada mL 10 10 10

b. Mezclar por inversión. Reposos 10 minutos y leer a 540 nn.


c. Calcular la concentración de úrea en mg/dL aplicando la
siguiente fórmula

mg / dL = lectura del problema x 60


lectura del Standard
13.4.1. Valores de referencia. De 20 a 45 mg / dL.

5. Cuestionario.
a. Explique porque para obtener mg/dL, se multiplica por 60.
b.¿ Cómo se convierte el N uréico en urea y, viceversa
c. Grafique la interrelación del ciclo de la urea con el ciclo de
Krebs.
d.Indique que enzimas actúan en la mitocondria, y cuáles en
el citoplasma, en el ciclo de la úrea.
e.Se requiere de ayuno para realizar la determinación de
úrea en sangre.

6. Fuentes de Información.
a. Devlin T homas M. Bioquímica con Aplicaciones
Clínicas. tomos I y II. Barcelona. E Reverté Colombiana.
S A. 2000.
b. David LN, Cox M M. Lehninger Principios de Bioquímica .
Barcelona. Omega. 2001.
c. Lozano – Galindo. Bioquímica para Ciencias de la
Salud. España. McGraw - Hill- Interamericana.
d. Luque L y Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería
Genética. Barcelona. Hartcourt. 2001.