Código FLA-23 v.

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Guía Unificada de Laboratorios
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1. Titulo: Extracción de ADN genómico

2. Objetivo: Aprender los pasos para extraer y concentrar ADN genómico.

3. Marco Teórico: El ADN genómico constituye la información genética total de un

organismo. Los genomas de casi todos los organismos están constituidos de ADN, las
únicas excepciones son algunos virus que tienen genomas de ARN. Las moléculas de
ADN genómico son generalmente grandes y en la mayoría de los organismos están
organizados en complejos ADN-proteína llamados cromosomas. El tamaño, el número de
cromosomas y la naturaleza del ADN genómico varía entre los diferentes organismos. Los
genomas de ADN virales son relativamente pequeños y pueden ser de una sola o de
doble hebra, lineal o circular. Todos los demás organismos tienen genomas de ADN de
doble hebra. Las bacterias tienen un único cromosoma circular. En eucariotas, el ADN
genómico se encuentra dentro del núcleo (ADN nuclear) como múltiples cromosomas
lineales de tamaños diferentes. Las células eucariotas adicionalmente contienen ADN
genómico en la mitocondria. En las plantas y eucariotas inferiores, los cloroplastos
también tiene ADN. Este ADN es generalmente una molécula circular y está presente
como múltiples copias dentro de estos organelos. El ADN genómico contiene genes,
regiones discretas que codifican para una proteína o un ARN. Un gen comprende la
secuencia de ADN codificante, así como elementos que controlan la regulación asociada
a la expresión génica. Los genes eucariotas nucleares también contienen regiones no
codificantes llamado intrones. El número de genes varía ampliamente entre los diferentes
organismos. La codificación del ADN representa sólo una pequeña fracción de ADN
genómico eucariota: la mayor parte del ADN es no codificante, muchas de éstas son
secuencias repetitivas. Algunas secuencias no codificantes del ADN tiene funciones
estructurales y reguladoras, sin embargo, la función de la mayor parte de este ADN es en
gran parte desconocida o apenas se está empezando a estudiar.
El número de copias de cada locus genético presente en una célula, o ploidía, también
varía entre los organismos. Las células somáticas (cuerpo) de los organismos que se
reproducen sexualmente son por lo general diploides, tienen dos conjuntos de
cromosomas homólogos y por lo tanto dos copias de cada locus genético, mientras que
las células germinales (reproductiva) son haploides y tienen sólo una copia de cada
cromosoma. Las células procariotas son haploides. Algunas plantas son poliploide, por
ejemplo, el trigo moderno, es hexaploide (seis copias de cada cromosoma).
Diferentes métodos se han reportado para el aislamiento de DNA genómico de bacterias,
algunos procedimientos usan la ruptura mecánica de las células bacterianas, mientras
otros la lisis química o enzimática. Todas estas aproximaciones tienen como punto final
romper eficientemente la compleja pared celular de las bacterias y liberar un DNA íntegro
para ser utilizado en análisis genéticos y moleculares.
Después de liberar los ácidos nucleicos el objetivo de los pasos siguientes de purificación
es separar el ADN de materiales contaminantes, como ARN y proteínas, estas son
desnaturalizadas para removerlas por centrifugación junto con otros residuos celulares. La
eliminación de polipéptidos remanentes se logra mediante la extracción con solventes
orgánicos. La precipitación de los ácidos nucleicos con etanol, también permite eliminar
polisacáridos, iones y otros compuestos solubles en agua. El ARN es eliminado por
degradación enzimática con ARNsa.
Durante el proceso de extracción se evita la degradación por ADNsas usando agentes
desnaturalizantes de proteínas como el SDS y quelantes de iones divalentes como el
EDTA. El procedimiento descrito para el desarrollo de esta práctica puede ser usado con
éxito para la obtención del ADN total de una gran variedad de especies microbianas. Sin
embargo al igual que otros procedimientos descritos en la literatura científica para este fin,
no pueden ser utilizados de manera generalizada debido a los diferentes grados de
dificultad para romper la pared celular; al contenido de polisacáridos capsulares y
cubiertas lipídicas que son difíciles de eliminar y al grado de asociación ADN-proteínas
que puede influir en la purificación.
Cuando no se conoce el microorganismo es conveniente hacer un ensayo de
susceptibilidad a la lisis con varios detergentes y con diferentes enzimas como la lisozima
y la lisostaphina.
Para la extracción de DNA genómico a partir de bacterias existen diferentes
procedimientos, algunos pueden iniciar con una lisis enzimática de las células,
posteriormente la remoción de proteínas y contaminantes celulares y finalmente la
precipitación y recuperación del DNA. En otros se inicia con una lisis celular llevada a
cabo con detergentes iónicos o aniónicos según el caso y se sigue con la
desproteinización y la precipitación del DNA.

4. Materiales, Equipos e Insumos: Micropipetas P-1000, P-100, P-20, Tubos eppendorf,

centrífuga refrigerada, puntas azules, puntas amarillas y puntas blancas.

5. Reactivos: Proteinasa K, SDS, CTAB y Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico, Etanol

absoluto, Etanol al 70%, Buffer TE, Acetato de Na 3M pH 5,2.

6. Procedimiento:
1:. Centrifugar el cultivo bacteriano a 3000 rpm por 5 minutos. Disolver el pellet bacte-
riano en 400 ul de buffer TE. Dependiendo de la bacteria, después de disolver el
pellet en buffer TE, se procede a la lisis, aquí se puede usar lizosima (20 mg/ml),
SDS, CTAB, Lauril sulfato de sodio, etc.

2:. Adicione un volumen igual de fenol ‘saturado’, mezcle invirtiendo el tubo suave-
mente, varias veces durante 5 minutos. Al mezclar suavemente se evita el fraccio-
namiento excesivo del ADN debido a las fuerzas de cizalla que se generarían en
un vórtex o al agitar bruscamente. Centrifugue a temperatura ambiente durante 5
minutos a 10.000 rpm para separar las fases.

3:. Transfiera el mayor volumen posible de fase superior acuosa a un nuevo tubo. Evi-
te transferir material de la interfase; para este fin transfiera la fase acuosa fraccio-
nada en pequeños volúmenes (por ejemplo cada vez 150µl).

Para mayor eficiencia de recuperación, se puede re-extraer la fase orgánica in-

ferior, adicionando un volumen apropiado de TE. Se mezcla por inversión suave
del tubo durante un minuto, se centrifuga como en el paso 2, se recupera el vo-
lumen de fase acuosa adicionado y se combina con la primera fase acuosa.
 4:. Adicione a la fase acuosa un volumen de mezcla ‘fenol-cloroformo-isoamilico’,
mezcle suavemente durante 5 minutos. Luego separe las fases por centrifugación
a 10.000 rpm durante 5 minutos.

5:. Transfiera la fase acuosa y adicione un volumen de mezcla ‘cloroformo- isoamilico’,

mezcle durante 5 minutos y luego separe las fases por centrifugación durante 2 mi-
nutos a 10.000 rpm. Transfiera la fase superior a un nuevo tubo. Al final del proce-
so de extracción deberá obtener por lo menos un volumen de 300 µl.

Concentración de ADN por precipitación:

6:. Para la precipitación con alcoholes de bajo peso molecular (como el isopropanol o
etanol) es necesario ajustar la fuerza iónica de la solución de ácidos nucleicos.
Generalmente se utilizan las siguientes sales: acetato de amonio, acetato de sodio,
cloruro de sodio (1/10 parte de la solución de sales se adiciona a la fase acusa ob-
tenida en el paso anterior). Adicione dos volúmenes (o 2.5 volúmenes) de etanol
absoluto frío. Utilice etanol almacenado a –20°C.

7:. Mezcle invirtiendo el tubo dos o tres veces e incube en hielo durante 10 minutos. Si
se desea una mayor eficiencia almacenar a 4°C durante varias horas o también
durante toda la noche a -200C.

8:. Centrifugue a 14.000 rpm durante 10 o 20 minutos a 4°C.

9:. Elimine el sobrenadante y tenga cuidado de no desprender el “pellet” de ADN.

10:. Para lavar el ADN, adicione 1000 µl de etanol al 70%. Invierta el tubo varias veces
o agite suavemente en vórtex y centrifugue durante 5-10 minutos a 14.000 rpm a
temperatura ambiente.

11:. Elimine el sobrenadante. (Tenga cuidado, el pellet queda más suelto después del
lavado con etanol). Invierta el tubo sobre un papel absorbente, para retirar el exce-
so de alcohol. Deje invertido para que se evaporen los residuos de etanol. Las tra-
zas del solvente pueden eliminarse más rápido en un desecador a vacío o en una
centrifuga con vacío.

12:. Disuelva el ADN en 50-100 µl de buffer TE y prepare diluciones para evaluación

electroforética y espectrofotométrica. Conserve el DNA a -20 0C. Recuerde marcar
el tubo apropiadamente.

Extracción de ADN a partir de aislados de Rhizobium sp

1. Recoger una cantidad de células aproximadamente del tamaño de un grano de arroz,
resuspender en 500 μl de agua destilada estéril y precipitar el “pellet” a 10,000 rpm / 5
min. Retirar el sobrenadante.
2. Añadir 200 μl de sarcosyl (0.1% en agua destilada) y resuspender suavemente.
3. Centrifugar a 10-12,000 rpm / 5 min. Retirar el sobrenadante.
4. Añadir 100 μl de NaOH (0.05 M), resupender las células y calentar a 100°C durante
4-5 minutos.
5. Añadir 700 μl de agua MiliQ estéril.
6. Resuspender (invirtiendo suavemente el tubo Eppendorf) y centrifugar 4,000 rpm / 3
min.
7. Recoger 400 μl de sobrenadante y guardar a -20°C.
 8. PCR

7. Nivel de Riesgo: Nivel de Bioseguridad 1.

8. Bibliografía: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory

Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

9. Anexos