UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FA C U LTA D D E C I E N C I A S B I O L Ó G I C A S

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PARÁSITOS

PRÁCTICA 3.
Diagnóstico diferencial de filariasis mediante PCR-RFLP

DR. LUCIO GALAVIZ SILVA. TITULAR DE LA MATERIA

M.C. GABRIEL CÁZARES JARAMILLO. MAESTRO ASOCIADO

 OBJETIVO

-Reconocer e identificar la calidad y cantidad del producto de

extracción para filariasis y los blancos moleculares para
amplificación por PCR y el uso de enzimas de restricción para
RFLP.
INTRODUCCIÓN
I
N
T
R
O
D
U
C
C
I
Ó
N
INTRODUCCIÓN
EXTRACCIÓN DE ADN
MASTER MIX CON AMPLI TAQ GOLD DNA
POLYMERASA
1. DESCONGELAR ELAmpliTaq Gold® 360 Buffer, 10✕, 25 mM
Magnesium Chloride, dNTP mix, primers, template, and (optional) 360
GC Enhancer, y vortex
2. Combine los components de acuerdo a los volumenes de la Tabla 1.
Multiplique el vol de una reacción por el numero total de reacciones y
agregue a cada tubo

Tape el tubo y vortexe por 5 seg

3. Centrifuge en “spin” para bajar el contenido y eliminar las burbujas. Distribuya igual volume del
PCR reacción mix a los tubos.
4. Prepare los primers y el ADN a su apropiada dilución de trabajo (Tabla 2) y agregue a los tubos.

5. Centrifuge para colectar el líquido en la base. Coloquelos en el termociclador.

6. Inicie la corrida del PCR (START).
6. Al terminar la corrida, conserver a 4°C o -20 °C/Correr el gel de agarose al 1 %
 P R E PA R A C I Ó N D E P R I M E R S L I O F I L I Z A D O S

TS1-F (50 -GGTGAACCTGCGGAAGGATC-30) 50.6 nmol

ITS1-R (50 - CTCAATGCGTCTGCAATTCGC-30) 52.5 nmol
Solución de trabajo (hija) Para el PCR se requieren 100 pmol
Solución stock (madre) En Vol final de 50 uL de reacción
Preparar 100 uL a 5 nmol

1 uL

V1C1 = V2 C2 V1 = (50 uL) (100 pmol)

Solución stock (madre)
1. Agregar 1,000 uL agua bd V1 = (100 uL) (5nmol)
50000 pmol
2. Conc= 50.6 nmol/mL 50.6 nmol V1 = 1 uL
V1 = 9.88 uL
 FUNDAMENTO RFLP
Enzima de restricción:
Muestra AseI
sanguínea
PCR AseI

Secuencias
ADN ATTAAT

TAATTA

ITS1-F y ITS1-R
TS1-F (50 -GGTGAACCTGCGGAAGGATC-30) and ITS1-R (50 -
CTCAATGCGTCTGCAATTCGC-30)

Extracción de ADN

Lectura en
espectrofotómetro
Relación 260/280 nm
Fragmentos de restricción
A260nm = 1 = 50 μg/mL
 ACTIVIDAD
PRÁCTICA
AseI discrimina entre las
cinco especies de
Relación filarias: W. bancrofti,
Brugia malayi Brugia Calidad de muestras
260/280 nm pahangi, Dirofilaria
inmitis y Dirofilaria
repens
¿Cuáles es el
Extracción
fragmento(s)
ADN
generados?

Investigación
Muestra
(colocar gel
sangre x
de agarosa y
equipo
referencia)
 CUESTIONARIO
Contestar lo siguiente:

1. ¿Cuál es el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para esta práctica? Anote secuencia
y número de pb
2. Tipo de corte y extremos generados por parte de la enzima de restricción
3. Nombre del organismo (género y especie) del cual se obtuvo la endonucleasa de restricción
mencionada.
4. Calcula cuantos uL de primers a 0.2 uM se agregan a un vol final de 50 uL de PCR . Los oligos
comerciales tienen PM = +6520.2 y tubo contiene 312.9 ug. A) ¿Cual es la concentración de la
solución stock a 1 mL. B) ¿Cuantos uL se le agregan a la sln de trabajo si la necesitas a 5 uM?
5. DISCUSION: CONSULT DOS TIPOS DIFERENTES DE EXTRACCIONES Y PCRS.