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Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa

(PCR, por sus siglas en inglés) es una de las
herramientas tecnológicas más innovadores
para el estudio de los ácidos nucleicos. Fue
desarrollada por Kary Mullis y revoluciono
la biología molecular y la forma en cómo se
estudiaban los ácidos nucleicos en ese
momento. Es una técnica de alta
sensibilidad, reproducibilidad y eficiencia,
que genera resultados confiables en poco
tiempo y fáciles de analizar. Se ha
convertido en el método de elección de
muchos investigadores para los estudios
genéticos y de biología molecular.

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 1. Condiciones de la PCR.

o Volumen final de la mezcla de reacción para una PCR: 25 μl.

o Concentración final de MgCl2: 1,5 mM.
o Concentración final de dNTPs: 200 μM cada uno.

Para poder trabajar, necesitamos medir los compuestos con la misma unidad, en este caso,
yo voy a pasar todas concentraciones a milimolar.

Dado que 1 micromol (μM) es igual a 0,001 milimolar(mM):

La concentración final de dNTPs será de 0,2 mM.

o Concentración final de cada cebador (F y R): 200nM.

Dado que 1 nanomolar (nM) = 0,000001 milimolar (mM).

La concentración final de cada cebador será de 0,0002 mM.

o Taq ADN polimerasa: 1 U.

2. KIT de PCR:
o Tampón de reacción 10x.
o MgCl2 25 mM.
o Solución de dNTPs con una concentración total de 10 mM.
o Cebadores F y R con una concentración de 10 pmol/μl cada uno.

Dado que 1 pmol/uL es igual a 0,001 mM:

Los cebadores del KIT tendrán una concentración de 0,01 milimolar.

o Taq ADN polimerasa con una concentración de 2 U/μl.

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 3. Volumen de los reactivos

Para averiguar el volumen que debemos de coger de cada uno, aplicamos la fórmula de

En términos numéricos, la relación entre el volumen y la concentración de la disolución

inicial y los que obtenemos después de incorporarle más disolvente es la siguiente:

!"·$"
Al despejar V1, tendríamos la siguiente ecuación: 𝑉1 = !%

Por tanto:
%·"&
Para el tampón: %(
= 2,5 µL

%,&·"&
Para el MgCl2m "&
= 1,5 µL

(,"·"&
Para los dNTPs %(
= 0,5 µL

((((" ·"&
Para los cebadores: (,(%
= 0,5 µL

Para la Taq Polimerasa, utilizamos la lógica: Si en un microlitro hay 2 U, en medio

microlitro habrá 1 U.

Reactivo C1 V1 C2 V2
Tampón 10X 2,5 µL 1X 25 µl
MgCl2 25 mM 1,5µL 1,5 mM 25 µl
dNTPs 10mM 0,5µL 0,2 mM 25 µl
cebador F 0,01 mM 0,5 µL 0,0002 mM 25 µl
cebador R 0,01 mM 0,5 µL 0,0002 mM 25 µl
Taq ADN 2U 0,5 µL 1U 25 µl
polimerasa
H2 O x 18 µL x x
ADN molde x 1 µL x X

Tabla de cantidades. Elaborada por la autora.

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 4. Volumen de agua.

Para averiguar el volumen de agua necesario sumamos todos los ingredientes más 1 µL
de ADN molde, y se lo restamos al volumen final, 25 µL. El resultado nos muestra que
deberemos echar 18 µL de agua en cada tubo.

5. Volumen para 10 tubos (9 + 1)

Calculamos cuánto volumen necesitaremos de cada reactivo para 9 tubos + 1, ya que

normalmente al pipetear se pierde algunas cantidades de liquido en las paredes del tubo.

Reactivo V1 (para 1 tubo) Para 10 tubos

Tampón 2,5 µL 25 µL
MgCl2 1,5 µL 15 µL
dNTPs 0,5 µL 50 µL
cebador F 0,5 µL 50 µL
cebador R 0,5 µL 50 µL
Taq polimerasa 0,5 µL 50 µL
H2O 18 µL 180 µL
Muestra ADN genómico 1 µL 10 µL
Volumen total 25 µL 430 µL

Tabla nº2. Suma de los volúmenes para cada tubo y para 10 tubos en total.
Elaborada por la autora.

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Imagen 1 y 2. Termociclador (1) y preparación de la mezcla de reactivos

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 6. Bibliografía

[1] A.C.I.D.E.P. Biología Molecular y Citogenética. Altamar Editorial.