Universidad de Guadalajara

Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías

Lic. Químico Farmacéutico Biólogo

Laboratorio de Biología Molecular y Genética

Reporte de Práctica No.6
Sección D03

“Detección de polimorfismo: PCR y RFLP”

Mendizábal Ruíz Adriana Patricia

Quintero Flores Aurora Denisse

Fecha: 3/noviembre/2023
Procedimiento parar RFLP:

1. Marcar con su nombre o número el tubo con la mezcla de enzima Hae III
2. Transferir 5 μl del producto de PCR (el de la practica 4) en el tubo que
contiene la enzima.
3. Centrifugar las muestras a 14,000 rpm durante 10 segundos
4. Colocar los tubos en el baño o termoblock a 37º C
5. Incubar de 30 a 60 minutos

Reporte de la práctica:

Calcule las condiciones finales de la reacción de amplificación con un volumen

final de 20 μl

Reactivo [Inicial] Volumen Volumen [Final]

final
Buffer 10x 2l 20l 1x
MgCl2 50mM 0.6l 20l 1.5 mM
Iniciadores 10M 0.4l 20l 0.2 mM
dNTPs 10mM 0.4l 20 l 0.2 mM

V 1 C1=V 2 C 2

V 1C1
C 2=
V2

( 2 μL ) (10 X )
Buffer C 2= =1 X
20 μL

(0.6 μL) (50 mM )

Mg Cl 2 C 2= =1.5 mM
20 μL

( 0.4 μL ) (10 μM )
Iniciadores C 2= =0.2 mM
20 μL

( 0.4 μL )(10 mM )
dNTPs C2 = =0.2mM
20 μL

Anote el programa de amplificación:

Desn. Inicial 95ºC 1 min

Desnaturalización 95ºC 30 seg #Ciclos: 30
Alineamiento 60ºC 45 seg
 Extensión 72º 45 seg
Extensión Final 72º 5 min

Flujograma:
Procedimiento para PCR

Procedimiento para RFLP

Observaciones:

El amplificador para PCR es un dispositivo que permite la amplificación de un fragmento

de ADN específico en un laboratorio. Este proceso se realiza mediante una reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), que es una técnica que permite copiar un fragmento de
ADN en millones o miles de millones de copias. Para el uso del amplificador debemos
tomar en cuenta la temperatura adecuada para la desnaturalización, hibridación y
extensión del ADN, la concentración adecuada de los reactivos de la PCR y una agitación
adecuada para garantizar que los reactivos se mezclen uniformemente. Al colocar las
muestras en el amplificador, vemos que se necesitan una gran cantidad de ciclos, además
de las altas temperaturas a las que se somete para que el proceso sea exitoso.

Conclusiones:

El próposito de la práctica era que a partir de los enjuages bucales, se extraiga ADN,
realizar posteriormente la digestión y a partir de un amplificador poder analizar si gen del
individuo era homocigoto o heterocigoto, esto fue ya que al iniciar la practica, se nos
 mostraron unas tiras que contenian el sabor amargo,
esto con el fin de que el individuo a estudiar, pudiera detectar o no el sabor amargo, la
amyoria de los participantes si tenian consigo el gen que

detecta el sabor amargo. La PCR puede amplificar pequeñas cantidades de ADN, lo que
permite detectar polimorfismos incluso en muestras con baja concentración de ADN.
Además, la PCR es un método específico, lo que significa que puede detectar diferentes
tipos de polimorfismos.

Actividades

Para contestar las siguientes preguntas tendrá que buscar la secuencia que se
amplifico utilizando Blast.

1. Mencione cual es el gen que se está amplificando (responsable de la

detección del sabor del PTC) y en que cromosoma se localiza
El gen que se esta amplificando es en el TAS2R38 y se localiza en el cromosoma
7

2. Mencione de qué tamaño es el producto amplificado

220 bp

3. Investigue y anote ¿Cuál es el sitio que reconoce la enzima Hae III? La

enzima Hae III es una enzima de restricción de tipo II que reconoce la secuencia
palindrómica GG^CC, donde ^ indica que la base se puede repetir una o dos veces. El
corte se produce entre las bases G y C, generando dos fragmentos de ADN con extremos
romos.
Cuestionario:

1.¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa?

La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que

amplifi ca millones de veces una secuencia específi ca de ADN durante varios
ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fi elmente. Para ello, la
reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la
capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células.

2. En la técnica,¿Qué ion divalente se utiliza comúnmente y cuáles su función en el

proceso?

En la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el ion divalente más

comúnmente utilizado es el magnesio (Mg2+). El magnesio es un cofactor esencial
para la actividad de la ADN polimerasa, ya que ayuda a estabilizar la enzima y a
facilitar la unión de los nucleótidos al molde de ADN. El magnesio también es
necesario para la desnaturalización del ADN, ya que ayuda a romper las
interacciones entre las bases nitrogenadas.

3. ¿Cuál es la característica y función de los cebadores?

Los cebadores son oligonucleótidos cortos, de 18 a 24 nucleótidos, que se utilizan

en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para iniciar la síntesis de nuevas
hebras de ADN. Los cebadores se complementan con las secuencias de ADN que
se desea amplificar, y se unen a las hebras de ADN separadas en la etapa de
anillamiento de la PCR.

Características de los cebadores

 Deben ser complementarios a las secuencias de ADN que se desea
amplificar.
 Deben tener una longitud suficiente para unirse de forma estable a las
hebras de ADN separadas.

 Deben ser específicos para evitar la amplificación de secuencias de ADN

no deseadas.

Función de los cebadores

 Inician la síntesis de nuevas hebras de ADN. Los cebadores se unen a las
hebras de ADN separadas en la etapa de anillamiento de la PCR. La ADN
polimerasa se une a los cebadores y comienza a sintetizar nuevas hebras
de ADN a partir de ellos.
  Especifican la secuencia de ADN que se va a amplificar. Los cebadores se
unen a secuencias específicas de ADN, lo que permite que la PCR se
centre en la amplificación de una sola secuencia.

4.- Mencione al menos 4 tipos de PCR y en qué consisten

 PCR convencional: Es el tipo de PCR más básico. Se utiliza para

amplificar cualquier secuencia de ADN, independientemente de su longitud
o posición en el genoma.
 PCR cuantitativa (qPCR): Se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN
objetivo presente en una muestra.
 PCR en tiempo real: Se utiliza para monitorizar la amplificación del ADN
en tiempo real.
 PCR en sitio: Se utiliza para amplificar el ADN directamente en una
muestra de tejido o célula.
 PCR múltiple: Se utiliza para amplificar simultáneamente varias
secuencias de ADN.

5.- ¿Cuál es el principal objetivo de la PCR?

El principal objetivo de la PCR es amplificar una secuencia específica de ADN.

Esto se consigue mediante la repetición de un ciclo de tres pasos:
desnaturalización, anillamiento y extensión.

6.- ¿Cuáles son los tipos de microorganismos de los que son extraídos las DNA
polimerasas que son utilizadas para realizar la PCR?

Las DNA polimerasas que se utilizan para realizar la PCR se extraen de una
variedad de microorganismos, incluyendo:
 Thermus aquaticus. Esta bacteria termófila se encuentra en aguas
termales y fuentes hidrotermales. La ADN polimerasa de T. aquaticus es
muy estable al calor, lo que la hace ideal para la PCR.
 Escherichia coli. Esta bacteria gramnegativa es una de las más comunes
en el mundo. La ADN polimerasa de E. coli es relativamente barata y fácil
de obtener.
 Pyrococcus furiosus. Esta bacteria hipertermófila se encuentra en aguas
a alta temperatura y presión. La ADN polimerasa de P. furiosus es aún más
estable al calor que la de T. aquaticus.
 Bacillus subtilis. Esta bacteria grampositiva es una fuente común de ADN
polimerasa.
 Arthrobacter luteus. Esta bacteria grampositiva es una fuente de ADN
polimerasa que es resistente a la inhibición por inhibidores de ADN
polimerasa comunes, como los detergentes y los alcoholes.
7.- ¿Cuál es el fundamento de la técnica PCR?

El fundamento de la técnica PCR es la amplificación exponencial de una

secuencia específica de ADN. Esto se consigue mediante la repetición de un ciclo
de tres pasos: desnaturalización, anillamiento y extensión.

 En la desnaturalización, el ADN se calienta a una temperatura elevada (95-

98 °C) para separar las dos hebras de la doble hélice.
 En el anillamiento, se añaden oligonucleótidos cebadores, que son
secuencias cortas de ADN que se complementan con las secuencias de
ADN que se desea amplificar. Los cebadores se unen a las hebras de ADN
separadas, formando un molde para la síntesis de nuevas hebras de ADN.
 En la extensión, se añade una enzima llamada ADN polimerasa, que
sintetiza nuevas hebras de ADN a partir del molde formado por los
cebadores. La ADN polimerasa se mueve a lo largo del molde, añadiendo
nucleótidos para formar una nueva hebra complementaria.

8.- Mencione 7 usos de la PCR en el ámbito de la medicina y la Biología Molecular

1. Diagnóstico de enfermedades infecciosas:La PCR se utiliza para

detectar la presencia de ADN de patógenos en muestras biológicas, como
sangre, saliva o tejidos. Esto es útil para diagnosticar infecciones causadas
por virus, bacterias, hongos o parásitos.
2. Identificación de microorganismos: La PCR se utiliza para identificar
especies de microorganismos a partir de su ADN. Esto es útil para la
investigación y el diagnóstico de infecciones.
3. Estudios de genética: La PCR se utiliza para estudiar la estructura y
función del ADN. Esto es útil para la investigación básica y aplicada en
biología, medicina y otras ciencias.
4. Análisis forense: La PCR se utiliza para identificar individuos a partir de su
ADN. Esto es útil para la investigación de crímenes y la identificación de
personas desaparecidas.
5. Terapia génica: La PCR se utiliza para introducir ADN en células para
corregir mutaciones genéticas. Esto es una posible terapia para
enfermedades hereditarias.
6. Clonación de genes: La PCR se utiliza para clonar genes. Esto es útil para
la investigación y el desarrollo de nuevas terapias.
7. Secuenciación del ADN: La PCR se utiliza para preparar muestras de
ADN para su secuenciación. Esto permite determinar la secuencia de
nucleótidos de una región de ADN.
 9.- Mencione los pasos básicos de esta técnica e
incluya una breve descripción:

El procedimiento de la PCR se puede dividir en los siguientes pasos:

 Preparación de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se prepara
mezclando los materiales y reactivos necesarios.
 Adición de la muestra de ADN. La muestra de ADN se añade a la mezcla
de reacción.
 Incubación en el termociclador. La mezcla de reacción se incuba en el
termociclador durante un ciclo de desnaturalización, anillamiento y
extensión.
 Repetición de los ciclos. Los ciclos de desnaturalización, anillamiento y
extensión se repiten varias veces, lo que da lugar a una amplificación
exponencial del ADN objetivo.
 Análisis del producto de la PCR. El producto de la PCR se puede analizar
mediante electroforesis en gel o técnicas de secuenciación del ADN.

10.- ¿Qué se necesita para hacer una PCR?

Para realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se necesitan los

siguientes materiales y reactivos:
 Muestra de ADN. La muestra de ADN puede ser cualquier tipo de material
biológico, como sangre, saliva, tejidos, etc.
 Cebadores. Los cebadores son secuencias cortas de ADN que se
complementan con las secuencias de ADN que se desea amplificar.
 ADN polimerasa. La ADN polimerasa es una enzima que sintetiza nuevas
hebras de ADN a partir de un molde.
 Buffer de reacción. El buffer de reacción proporciona los iones y cofactores
necesarios para que la ADN polimerasa funcione correctamente.
 Nucleótidos. Los nucleótidos son los bloques de construcción del ADN.
 Termociclador. El termociclador es un aparato que calienta y enfría la
mezcla de reacción a las temperaturas adecuadas.

Además de estos materiales y reactivos, también se pueden utilizar los siguientes:

 ADN estándar. El ADN estándar se utiliza para calibrar el termociclador y
garantizar que la PCR se realice correctamente.
 Marcadores fluorescentes. Los marcadores fluorescentes se utilizan para
visualizar el producto de la PCR mediante electroforesis en gel.
Bibliografía consultada por el alumno para responder el cuestionario:

• Mullis, K. B., Faloona, F. A., Scharf, S. J., Saiki, R. K., Horn, G. T., & Erlich,
H. A. (1986). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase
chain reaction. Science, 237(4812), 877-880.

• Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A

laboratory manual (2nd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• White, T., B., Bruns, R., Lee, M., & Taylor, J. (1990). PCR protocols: A guide
to methods and applications. Academic Press.
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (artículo) | Khan Academy.
(s. f.). Khan Academy. https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-
expression-and-regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-pcr