Manual de técnicas Laboratorio de Bioquímica

PROTOCOLO PARA PCR EN BACTERIAS

Los primers a utilizar son:

No°. De Nombre Tamaño Volumen Tm Peso Concentración Concentración OD

oligonucleótid (µl) molecular (µg/µl) (µM) totales
o

14-336 E786F 18 250 45.8 5619.23 2.4 439.72 20.3

14-337 E1541R 20 250 51.8 6200.69 2.7 443.85 20.85

El volumen total para la reacción de PCR es de 50µL en total por cada Tubo Eppendorf, siguiendo la
siguiente tabla:

Tabla 1: Reactivos, volúmenes y concentraciones para PCR.

Reactivo Orden de Concetración del Vol para PCR Concentración en

adición Stock (µL) mix de PCR

Agua libre de 1 33.5

ADNasas

Primer F 2 10µM 2 0.4µM

Primer R 3 10µM 2 0.4µM

DNTp´s 4 10mM 1 c/u 0.2 mM c/u

Buffer Mg2+ Taq 5 20mM 5 2mM

Taq polimerasa 6 5 U/µL 2.5 0.25 U/µL

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ADN´s 7 50µg/ml 1 1µg/ml

Vol total. 50

Las soluciones stock se deben preparar, para ello se emplea la fórmula:

C1V1 = C2V2

- Stock dNTP´s

Los dNTP´s se preparan por separado (A, G, T y C) como sugerencia se preparan 200µL de cada
uno (V2) y deben estar a una concentración de 10mM (C 2), los viales de dNTP´s suelen venir con una
concentración de 100mM (C1), entonces para preparar el stock:

V1(100mM) = (200µL) (10mM)

V1 = (200*10) /100 = 20µL

Es decir, se deben añadir 20µL de cada dNTP y 180µL de agua libre de ADNasas.

- Stock Primers

Los primers se preparan por separado (Primer F y Primer R), como sugerencia se preparan 100µL
de cada primers (V2) y deben tener una concentración de 10µM (C2), los viales de primers suelen
venir preparados y su concentración µM se indica para cada uno de ellos, en este caso se emplean
los primers E786F y E1541R, entonces:

----- Primer E786F

En la descripción del primer se indica que tiene una concentración de 439.72µM (V 1), por lo tanto,
para preparar el Stock:

V1(439.72µM) = (100µL) (10µM)

V1 = (100*10) /439.72 = 2.3µL

Entonces se deben añadir 2.3µL del Primer E786F y 97.7µL de agua libre de ADNasas.

----- Primer E1541R

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En la descripción del primer se indica que tiene una concentración de 443.85µM (V 1), por lo tanto,
para preparar el Stock:

V1(443.85µM) = (100µL) (10µM)

V1 = (100*10) /443.85 = 2.3µL

Entonces se deben añadir 2.3µL del Primer E1541R y 97.7µL de agua libre de ADNasas.

- Stock de muestras de ADN

Es necesario calcular la concentración de ADN en la muestra, para ello se emplea la f´órmula:

C1 = Abs (50)(50)

Donde 50 es el % promedio de ADN en la célula y 50 es el factor de dilución de la muestra en la

celda.

Una vez conocida la concentración se recomienda preparar 200µL de cada muestra (V 2) a una
concentración de 50µg/ml (C2), se debe despejar V1 y agregar el agua para aforar a V 2.

Una vez preparadas las muestras de 50µL en los Tubos Eppendorf se procede a programar el
termociclador de la siguiente manera:

Tabla 2: Condiciones finales de tiempo y temperatura para PCR.

Temperatura Tiempo

94°C 3 minutos

94°C 30 segundos

52°C 30 segundos

72°C 1:30 minutos

Repetir pasos anteriores (desde el Paso 2) 30 ciclos

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72°C 10 minutos