Chapter 2 - Analytical Approaches For The Identification of - 2019 - Quorum Sen

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CAPITULO 2
Enfoques analíticos para la identificación de
moléculas de detección de quórum
adela cutignano
Consejo Nacional de Investigación de Italia—Instituto de Química Biomolecular, Pozzuoli, Italia
1. Introducción
La detección de quórum (QS) es una estrategia de comunicación de célula a célula ampliamente
conservada del mundo bacteriano (Camilli, 2006; Hmelo, 2017; Taga y Bassler, 2003; Waters y Bassler,
2005). Se producen y liberan en el entorno local pequeñas sustancias químicas denominadas
autoinductores (IA), que se difunden a través de la membrana celular hacia las células adyacentes y regulan
la expresión génica en función de la densidad/concentración celular. La detección de quórum está
involucrada en varias actividades biológicas, como la formación de biopelículas, la bioluminiscencia, la
esporulación, la motilidad, el intercambio genético y la producción de antibióticos y factores de virulencia. En
particular, QS es un proceso clave bien documentado en patógenos e implicado en el inicio de la
patogenicidad bacteriana; por lo tanto, se ha considerado cada vez más como un objetivo alternativo para los
tratamientos con antibióticos.
Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas dependen de señales químicas para
coordinar el comportamiento de la población, aunque las moléculas QS que producen pertenecen a diferentes
clases químicas (Hawver et al., 2016) (Fig. 1): por lo general, son N acilLhomoserina lactonas (AHL) en la
mayoría de las especies Gramnegativas (AI1) (Fuqua et al., 1994; Fuqua y Greenberg, 2002; Papenfort
y Bassler, 2016) y péptidos autoinductores cortos (AIP) en Gram bacterias positivas (Bofinger et al., 2017;
Kleerebezem et al., 1997; Sturme et al., 2002; Verbeke et al., 2017).
Cada especie bacteriana produce y detecta un patrón específico de pequeñas IA. Los AHL producidos
por bacterias Gramnegativas de diferentes especies pueden variar en cuanto a la longitud y el
grado de instauración de la cadena lateral de Nacilo, normalmente entre 4 y 18 átomos de carbono, con solo
un informe de una longitud de cadena de 19 carbonos (Doberva et al . , 2017); el carbono 3 puede llevar
un grupo hidroxilo u oxo (Fig. 1). Sin embargo, las entidades moleculares específicas de las especies
circundantes pueden reconocerse mutuamente, y un grupo de moléculas derivadas de (S)4,5
dihidroxi2,3pentanodiona (DPD) y diésteres de boro de furanosilo conectados en equilibrio (AI2 ) son
sustancias químicas únicas, no específicas de especie, producidas por bacterias Grampositivas y Gramnegativas
La detección de quórum. https://doi.org/10.1016/B9780128149058.000022 Derechos de
autor # 2019 Giuseppina Tommonaro.
Publicado por Elsevier Inc. Todos los derechos reservados. 29
30 Capítulo 2
Fig.
1 Estructuras representativas y clases químicas de autoinductores.
y se sabe que median en la comunicación entre especies, constituyendo así una especie de
señal QS universal (Bassler et al., 1997; Schauder et al., 2001; Vendeville et al., 2005) (Fig. 1).
Además de estos tres grupos de autoinductores (AI1, AIP y AI2), se han descrito moléculas
QS menores de especies bacterianas y se informan en la Fig. 1 ( Bofinger et al., 2017; Deng et
al., 2011; He y Zhang, 2008; Pesci et al., 1999; Winans, 2011). El conocimiento de la diafonía
del huésped del microbioma también se está ampliando, y su importancia clínica se vuelve
cada vez más evidente. Una red de comunicación compleja mantiene bacterias simbióticas, agentes patógenos y
Enfoques analíticos para la identificación de moléculas de detección de quórum 31
su anfitrión se entrelazó, orquestando así la lucha entre la defensa y el ataque contra los microbios
invasores (Curtis y Sperandio, 2011; Goswami, 2017; Sperandio et al., 2003; Williams, 2007); un
ejemplo es el sistema de señalización de epinefrina/norepinefrina/autoinductor3 (AI3), que regula la
patogenicidad de ECEH de Escherichia coli en su huésped mamífero (Curtis y Sperandio, 2011;
Reading et al., 2007; Sifri, 2008; Sperandio et al. ., 2003). Para este grupo de autoinductores de tipo 3,
se ha planteado la hipótesis de una naturaleza aromática (Reading y Sperandio, 2006), pero hasta la
fecha no se ha informado de confirmación estructural en la literatura; por lo tanto, debe considerarse
indeterminado todavía.
El rasgo común de todas estas situaciones es que las moléculas de señal se producen a una
concentración muy baja (típicamente en el rango de nM) y su detección requiere técnicas altamente
sensibles. El desarrollo de biosensores ha permitido la detección rápida de microorganismos para la
producción de autoinductores; sin embargo, para la identificación y cuantificación específicas
de estos metabolitos bacterianos, la mejor opción son las metodologías basadas en espectrometría de
masas, junto con la cromatografía de gases (GCMS) o la cromatografía líquida (LCMS/MS). La
extracción, limpieza y preconcentración de muestras pueden mejorar en gran medida la identificación
de autoinductores a partir de matrices complejas, a la vez que permiten una cuantificación fiable.
El presente capítulo destacará las estrategias comunes adoptadas para el estudio de estos compuestos
con un enfoque especial en los AHL y las tendencias futuras de la investigación basada en tecnologías de punta.
2 Preparación de muestras
Uno de los cuellos de botella al abordar metabolitos naturales de muy baja abundancia es la elección
del protocolo correcto para limpiar y enriquecer la muestra biológica antes del análisis; este paso es
exigente para evitar la omisión de compuestos por cuestiones de dilución o por otros componentes
presentes en los sobrenadantes de los cultivos celulares (productos extracelulares o constituyentes
de los medios de crecimiento) o en otras matrices ambientales diferentes, que pueden enmascarar
o comprometer la correcta identificación de los metabolitos diana (Cutignano et al., 2015). Por otra
parte, el análisis directo de los medios que contienen moléculas QS se ve impedido por la presencia
de sales y macromoléculas (p. ej., proteínas y polisacáridos) que pueden obstruir la columna analítica
de un paso secuencial. Se pueden adoptar diferentes estrategias, incluida la extracción líquidolíquido
(LLE) y/o la extracción en fase sólida (SPE) (Sitnikov et al., 2016).
2.1 Extracción LíquidoLíquido (LLE)
LLE representa el método más inmediato, tradicional y relativamente simple para obtener una fracción
enriquecida de pequeñas moléculas QS. La fase acuosa constituida por el sobrenadante del medio de
cultivo o por muestras de agua ambiental se extrae mediante solventes orgánicos inmiscibles,
típicamente acetato de etilo o diclorometano (Feng et al., 2014; Kumari et al., 2008;
32 Capítulo 2
Ortori et al., 2007; Shaw et al., 1997; Wang et al., 2017). En esta etapa, se debe agregar un estándar
interno antes de continuar con la manipulación para corregir el sesgo instrumental y de recuperación en
vista del análisis cuantitativo. Una vez que el extracto se ha evaporado a sequedad, se puede volver
a disolver en un pequeño volumen de disolvente (es decir, acetonitrilo, 1–2 ml) y analizarse directamente,
por ejemplo, mediante cromatografía en capa fina (TLC); sin embargo, a menudo se somete a más
pasos cromatográficos para la preconcentración y la limpieza, que normalmente se llevan a cabo
mediante cromatografía de extracción en fase sólida (SPE) (AndradeEiroa et al., 2016).
2.2 Extracción en fase sólida (SPE)
SPE es una técnica ampliamente y cada vez más adoptada en las últimas dos décadas, especialmente
antes del análisis cuantitativo, para aumentar la concentración de analitos a nivel de trazas. Dos
grandes ventajas han contribuido a su amplia aplicación: la disponibilidad de cartuchos preempacados con
una variedad de sorbentes químicamente diferentes, extendiendo así su campo de uso a una amplia gama
de sustancias químicamente diversas; y la posibilidad de realizar este paso mediante un proceso
automático, evitando así la variabilidad debida a operadores humanos. Además, SPE otorga altas
tasas de recuperación, lo que es particularmente significativo cuando se manejan componentes químicos
que se encuentran en cantidades traza en matrices biológicas, con fines cuantitativos. De hecho,
SPE puede ganar una sensibilidad de detección de al menos dos hasta diez veces con respecto a LLE (Schupp et al., 2005).
Se ha probado una serie de sorbentes para la extracción de AHL con detección de quórum mediante
cromatografía SPE, incluidos sílice, octadecilo (RP18), alúmina, diol, fenilo, intercambio iónico, estireno
divinilbenceno polimérico (PSDVB), aminas primarias y secundarias (PAS ) y resinas a base de poliamida
(PA) (Li et al., 2006; Schupp et al., 2005; Wang et al., 2017). Los mejores resultados se obtuvieron con
columnas de fase reversa, mientras que los materiales de fase normal y los adsorbentes con actividad
de intercambio iónico no fueron aconsejables ya que siempre se retuvo una fracción alta de la cantidad
cargada (Li et al., 2006). En general, ningún sorbente fue adecuado para recuperar e identificar todos los
compuestos. De hecho, Schupp et al. (2005) informaron sobre una excelente recuperación con resina de
poliamida (DPA) solo para AHL de cadena corta y parte de cadena media, mientras que para AHL
con longitud de cadena de C6 a C12, la recuperación fue superior al 90% con RP18 y resinas basadas
en PSDVB modificadas (HLB) con peores resultados con C4HSL y C14HSL (Li et al., 2006; Wang et al.,
2017).
En consecuencia, se han informado diferentes protocolos para la elución de SPE (Fekete et al., 2007;
Gould et al., 2006; Li et al., 2006; Schupp et al., 2005; Wang et al., 2017). Normalmente, las columnas
basadas en sílice se eluyen con mezclas secuenciales de disolventes apolares (es decir, nhexano con
cantidades crecientes de acetato de etilo), y se han detectado AHL en la fracción que eluye con nhexano/
acetato de etilo 65:35 (Schupp et al . al., 2005); por otro lado, un protocolo optimizado en columnas de
octadecilo con tapa final se basa en el lavado inicial con metanol/agua (15:85, v/v) y nhexano/isopropanol
(25:75, v/v) elución de AHL (Fekete et al . al., 2007; Li et al., 2006). En 2017, Wang y sus colaboradores
describieron el fraccionamiento en un adsorbente HLB, que combina lipofílico y
interacciones hidrófilas equilibradas. Después de los pasos de lavado con metanol/agua (5:95, v/v), los
compuestos objetivo se eluyeron con excelentes recuperaciones con metanol que contenía ácido acético al 2 %.
3 Detección, identificación y cuantificación de moléculas QS
3.1 Enfoques analíticos para la detección de AHL
3.1.1 Biosensores
El mecanismo que sustenta la respuesta celular a los autoinductores de AHL se reconoció hace más de
20 años en Vibrio fischeri y está mediado por dos proteínas de la familia LuxILuxR (y otras proteínas
homólogas), a saber, una sintasa LuxIAHL y una LuxRAHL activador transcripcional (Fuqua et al.,
1994) (Fig. 2).
Las proteínas de tipo LuxR son receptores citoplasmáticos que detectan y se unen a las AHL producidas por
una sintasa de tipo LuxI afín y se asocian con secuencias de ADN cortas, llamadas cajas lux, que
desencadenan la expresión de cientos de (hasta 600) genes. Ejemplos de señalización célulacélula mediada
por AHL son aquellas implicadas en la autoinducción de bioluminiscencia en las bacterias marinas
Photobacterium (Vibrio) fischeri y Vibrio harveyi (Fuqua et al., 1994) y en la regulación de la producción de
pigmento violaceína en la bacteria Chromobacterium violaceum (McClean et al., 1997). El desarrollo
de biosensores bacterianos que no producen AHL pero que son capaces de reconocer y responder en
presencia de AHL impulsó el descubrimiento de una gran cantidad de sistemas QS basados en AHL.
Fig. 2
Representación esquemática del sistema LuxI/LuxR QS en V. fischeri. Modificado de Galloway et al., 2011.
34 Capítulo 2
en bacterias Gram negativas. Estos biosensores se pueden obtener mediante la clonación de una proteína
de tipo LuxR funcional junto con un promotor adecuado, por ejemplo, el promotor de la luxI sintasa afín, que
regula positivamente la transcripción de un gen informador, por ejemplo, producción de violaceína,
bioluminiscencia o galactosidasa (Steindler y Venturi, 2007). En otras palabras, el evento de reconocimiento
se acopla a un elemento transductor que lo convierte en un resultado legible y eventualmente medible,
mediante el uso de bacterias modificadas genéticamente o, alternativamente, mediante la explotación de
reporteros expresados constitutivamente. Las proteínas LuxR se unen preferentemente a los AHL
producidos por la sintasa LuxI afín, pero en cierta medida responden a análogos de AHL estrechamente
relacionados que exhiben diferentes tipos de cadenas laterales; por lo tanto, cada biosensor está hecho a
medida y se puede aplicar a la pantalla para la producción de una gama limitada de autoinductores de la
familia AHL. Por otro lado, mediante el uso de un panel de biosensores, se puede detectar un espectro más amplio de AHL.
Los biosensores basados en células se pueden usar de diferentes maneras. Uno es el cruce de placas
del productor bacteriano y la cepa del biosensor: el punto más cercano entre las dos cepas mostrará la
respuesta más intensa. Otro es la superposición de cromatografía de capa fina (TLC). Los extractos y/o las
fracciones cromatográficas obtenidas del bioproductor se cargan en una placa de TLC junto con los
estándares químicos y se les permite resolverse en los componentes moleculares en una cámara
cromatográfica. La detección de los AHL se puede apreciar sucesivamente mediante la superposición de
TLC con una suspensión de agar de la cepa del biosensor. El factor de retardo cromatográfico (Rf) de los
puntos detectados resultantes, en comparación con los estándares AHL, puede ayudar a asignar
tentativamente la longitud de la cadena y la sustitución del autoinductor (McClean et al., 1997; Shaw et al.,
1997). Además, la intensidad de la lectura del indicador puede interpretarse en un ensayo cuantitativo. Aunque
son fáciles y robustos, estos sistemas de biodetección basados en células presentan algunos inconvenientes,
incluida la respuesta lenta, la interferencia química de los componentes de las células bacterianas y la
variabilidad de un lote a otro. Por ello, en las últimas dos décadas se han propuesto herramientas alternativas
para detectar AHL basadas en plásmidos que contienen genes que codifican la proteína verde fluorescente
gfp (Andersen et al., 2001); estos sensores, que aprovechan la maquinaria biológica dentro de las células,
tienen la gran ventaja de que pueden usarse a nivel de una sola célula para la detección de la producción de
AHL. Muy recientemente, se desarrolló y propuso una forma de biosensores "sin células", donde el circuito de
ADN diseñado y la maquinaria celular flotan libremente en una solución, para analizar muestras clínicas de
Pseudomonas aeruginosa (Wen et al., 2017) . En el estudio presentado, las moléculas de detección de
quórum que se encuentran en el esputo de pacientes con fibrosis quística se midieron
cuantitativamente a nivel nanomolar, con resultados comparables a los obtenidos con otras técnicas sensibles
basadas en espectrometría de masas en tándem, pero posiblemente a un costo menor.
3.1.2 Ensayos radiomarcados
La biosíntesis del esqueleto de acil homoserina lactona se asigna a dos categorías de lactona sintasas: acil
CoA que utiliza sintasa y acilACP que utiliza sintasa. Sin embargo, ambos utilizan SadenosilLmetionina
(SAM), que por lo tanto es un sustrato conservado (Fig. 3).
Fig. 3
Esquema biosintético de AHL subyacente al uso de (carboxil14C)metionina para ensayos radiomarcados.
El ensayo de radiomarcado 14CAHL se basa en la absorción de [114C]Lmetionina por células vivas y la
conversión en Sadenosil metionina radiomarcada. Este último intermedio metabólico se incorpora a su vez a
los metabolitos de señalización de AHL mediante una enzima AHL sintasa. Una vez extraída con solventes
orgánicos, la radiactividad asociada con los AHL se puede revelar fácilmente por medio de un detector de
centelleo, sin ningún sesgo por la longitud específica de la cadena o el estado de oxidación.
En el pasado, los ensayos radiomarcados se aplicaron a la detección de AHL en bacterias de biopelícula: de
hecho, la cantidad muy baja de material biológico disponible y la cantidad de pruebas requeridas para detectar
los diferentes tipos de AHL impidieron el uso de bioensayos en este contexto (Greenberg y Parsek , 2001;
Jones et al., 1993; Schaefer et al., 2001, 2002). Sin embargo, a pesar de su simplicidad y sensibilidad,
este enfoque está siendo reemplazado actualmente por metodologías basadas en espectrometría de masas
más rápidas y seguras.
3.1.3 Ensayos colorimétricos
En un intento por desarrollar un método barato y fácil de usar, Yang et al. (2006) propusieron un ensayo
colorimétrico modificando un procedimiento anterior utilizado para el análisis de compuestos de éster.
El método se propuso originalmente para la detección de compuestos de lactona y actividad de lactonasa y
se redujo a un tamaño de placa de 96 pocillos, lo que requería una cantidad mínima de muestra (20–50 μL) y
presentaba un límite de detección de 1 nmol de molécula de lactona. El ensayo colorimétrico se basa en la
conversión de los ésteres carboxílicos/lactonas en los correspondientes ácidos hidroxámicos; estos últimos,
en presencia de iones férricos, forman complejos de color rojo a púrpura que se pueden medir
espectrofotométricamente. Aunque los métodos colorimétricos son muy sensibles, la escasa
especificidad de los sugeridos anteriormente para la detección de AHL puede conducir a la
sobreestimación o identificación errónea de las moléculas QS.
36 Capítulo 2
3.2 Enfoques analíticos para la identificación y cuantificación de AHL
3.2.1 Cromatografía de gasesespectrometría de masas (GCMS)
La cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (GCMS) es una técnica analítica con
guión que combina el poder de alta resolución de la separación cromatográfica de gases con la detección
sensible distintiva de un espectrómetro de masas. Es adecuado para la separación de moléculas volátiles y
térmicamente estables que pueden identificarse mediante la interpretación de espectros de masas obtenidos de
cada especie de ion detectada en virtud de su valor de relación masacarga (m/z). Al tratar con moléculas
conocidas, la disponibilidad de estándares y/o bases de datos espectrales permite una rápida
identificación de las desconocidas mediante la comparación de tiempos de retención y patrones de fragmentación.
De hecho, GCMS se basa en una técnica de ionización dura que utiliza el impacto de electrones (EI) o la
ionización química (CI) para la generación de un ion molecular, que se detecta y registra junto con los iones de
fragmentos que se originan en la fuente a partir de la escisión de enlaces químicos. Por lo tanto, GCMS representa
una técnica confiable y muy sensible para identificar y cuantificar lactonas de NacilLhomoserina en extractos
bacterianos (Osorno et al., 2012). Todos los compuestos de la serie CnAHL exhibieron un patrón típico de
fragmentación, con la presencia de iones de diagnóstico en m/z 143 y 102 que surgen de la escisión del anillo de
lactona (Thiel et al., 2009a) (Fig. 4). En cambio, los espectros de masas de los 3hidroxiAHL están dominados por
el fragmento am/z 172 que resulta de la escisión α junto al grupo hidroxilo (WagnerD€obler et al., 2005)
(Fig. 4). Por lo tanto, cuando el analizador espectrométrico de masas es de tipo cuadrupolo, como se encuentra a
menudo en las plataformas GCMS, el diseño experimental más apropiado contemplará la adquisición de
datos espectrales tanto en el modo de barrido completo como en el modo de monitoreo de iones
seleccionados (SIM) usando el
Fig. 4
Fragmentación por impacto de electrones esquemática de moléculas de AHL que generan iones de
diagnóstico am/z 143 y 102 para CnAHL no sustituido saturado y am/z 172 y 102 para 3OHAHL.
fragmento prominente en m/z 143 y/o 172. Este último modo de adquisición explota una característica electrónica
única del analizador de masas basado en cuadrupolo que funciona como un filtro de masas. Los iones formados en
la fuente se acumulan en el analizador y solo aquellos que presentan una relación m/z definida se seleccionan y se
les permite llegar al detector. Solo se muestra un pico cuando el ion m/z preestablecido está por encima de un umbral
de sensibilidad, pero dado que no se monitorean otros iones, todo el tiempo de adquisición se dedica a los iones
enumerados, con una mejora sustancial de la relación señalruido; este hecho, junto con la velocidad de
exploración rápida, proporciona un aumento de cien veces en la sensibilidad en SIM en lugar de en el modo de
adquisición de exploración completa.
Se han informado métodos para el análisis GCMS específico de 3oxoAHL lábiles después de su conversión en
los correspondientes derivados de pentafluorobenciloxima (PFBO) más estables (Charlton et al., 2000); sin embargo,
en algunos protocolos, todos los AHL se analizaron sin emplear ninguna derivatización química y monitoreando los
fragmentos más abundantes y diagnósticos en modo SIM (Cataldi et al., 2004, 2007; Celio et al., 2006; Chi et al.,
2017; Pomini y Marsaioli, 2008; Ran et al., 2016; Rani et al., 2011). Las AHL ramificadas muestran espectros de
masas similares a los de las correspondientes homoserina lactonas lineales, aunque muestran un tiempo de elución
más corto que sus contrapartes no ramificadas. Sin embargo, su identificación se puede lograr a través del análisis
GCMS usando un modelo empírico que fue desarrollado para calcular la posición de la rama metilo en una cadena
alquílica larga en diferentes lípidos usando un valor de índice de retención (Schulz, 2001) .
Según este modelo, por primera vez se identificaron isoC9HSL y 3OHisoC9HSL en Aeromonas culicicola. Además,
una inspección minuciosa de la región de mayor masa reveló la presencia de un ion [M43]+ , diagnóstico de una
cadena de alquilo ramificada en metilo en la posición ω1 (Thiel et al., 2009a). Las separaciones cromatográficas
generalmente se llevaron a cabo en una columna capilar de sílice fundida de 20 a 30 cm de largo utilizando helio
como gas portador y gradientes de temperatura de 100 a 300 °C. En algunos casos, la cuantificación se realizó
utilizando C7HSL como estándar interno (Cataldi et al., 2007), pero se ha documentado la aparición de AHL de
cadena impar en pocas especies bacterianas (Dickschat, 2010), lo que da como resultado un resultado definitivo.
análogo deuterado más adecuado como referencia estándar interna (Gould et al., 2006). El campo de aplicación
abarcó desde estudios ecológicos sobre la actividad alguicida de la bacteria marina Ponticoccus sp. asociados con
microalgas (Chi et al., 2017), al cribado biomédico para la identificación del marcador AHL de Pseudomonas
aeruginosa en muestras de esputo (Rani et al., 2011), a la caracterización química de nuevas variantes estructurales
de lactonas homoserina (Thiel et al. ., 2009a).
El análisis GCMS también se ha utilizado para asignar la configuración absoluta de los carbonos quirales en los AHL.
Todas las moléculas de este grupo comparten un centro estereogénico representado por el C3 del anillo de lactona,
mientras que los derivados de 3OHAHL exhiben un centro asimétrico adicional en la posición hidroxilada de la
cadena lateral de alquilo. El análisis quiral fue abordado por GC con análisis de detector de ionización de llama (FID)
en una columna quiral que contenía βciclodextrina no polar, en comparación con estándares sintéticos (Pomini y
Marsaioli, 2008; Malik et al., 2009). Curiosamente, se encontraron acil lactonas Dhomoserina junto con
derivados L en la cepa Burkholderia cepacia LA3 (Malik et al., 2009) mediante el uso de una nueva técnica de
microextracción de una sola gota,
38 Capítulo 2
lo que sugiere que se necesitan tecnologías analíticas quirales para diferenciar enantiómeros con
actividades biológicas supuestamente diferentes. Por otra parte, la configuración absoluta en C30
se determinó mediante metanólisis ácida del 3OHAHL y liberación del éster metílico del ácido
graso correspondiente; Se llevó a cabo un análisis cromatográfico en la misma fase quiral de GC en
comparación con estándares sintéticos racémicos y enantioméricamente puros para asignar la
estereogenicidad de carbono de los compuestos naturales (Thiel et al., 2009a). La localización
del doble enlace en análogos monoinsaturados y diinsaturados menos comunes se logró mediante
análisis GCMS de sus derivados de dimetilsulfuro (DMDS) (WagnerD€obler et al., 2005; Thiel et al.,
2009a): el α preferencial La escisión entre los grupos metiltio permite asignar la posición del doble
enlace directamente (Fig. 5). La geometría de olefina de la insaturación distal se asignó por
comparación con estándares E/Z preparados por síntesis selectiva, asumiendo una configuración
trans en C2 como se encuentra comúnmente en ácidos similares de origen biológico.
Fig. 5
Espectros EIMS de: A) C16:2AHL, y B) aducto DMDS de C16:2AHL para localización de doble
enlace interno. Modificado de Thiel et al. 2009a.
3.2.2 Cromatografía líquidaespectrometría de masas (LCMS)
En comparación con otras técnicas analíticas, la cromatografía líquida en línea a la
espectrometría de masas (LCMS) ha demostrado ser el enfoque más confiable y sensible para la
detección, identificación y mediciones cuantitativas de moléculas QS. Bajo la definición general de
metodologías LCMS se engloban diferentes y peculiares soluciones tecnológicas, que ofrecen
diferentes grados de sensibilidad, resolución de masa y precisión. Así podrán atender y satisfacer
diferentes requerimientos científicos según el campo de aplicación. Los dos bloques analíticos con
guión (es decir, el sistema cromatográfico y el instrumento de espectrometría de masas) se pueden
configurar, adaptar e interconectar para un análisis objetivo de acuerdo con el resultado que se espera
recibir. Hasta 2004, la conversión de cromatografía líquida a espectrómetros de masas se realizaba
únicamente mediante sistemas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La HPLC es una
técnica bien conocida y ampliamente difundida para la separación de una mezcla compleja en sus
componentes individuales, en virtud de su diferente afinidad entre una fase líquida móvil sobre una fase
sólida estacionaria y medida como tiempo de elución. La fase sólida generalmente se empaqueta en
columnas de acero de diferentes longitudes y diámetros, y desde su primera aplicación ahora permite
resolver una impresionante variedad de analitos que pertenecen a muchas clases químicas. Aunque se
han introducido muchas modificaciones tecnológicas, todas las fases estacionarias se pueden atribuir
a uno de estos tres tipos de interacción: (1) exclusión por tamaño, (2) intercambio iónico y (3)
cromatografía de adsorción. Esta última puede realizarse en fase normal (NP) o en fase inversa (RP). En
la cromatografía NP, el lecho estacionario es sílice de polaridad superior o composiciones basadas en
sílice, y la fase eluyente está constituida predominantemente por un disolvente no polar (p. ej., n
hexano). Es apropiado para la separación de compuestos lipofílicos.
Por el contrario, la cromatografía RP se basa en una fase estacionaria no polar eluida por una mezcla de
disolventes polares, incluidos metanol, acetonitrilo y agua. Esta fase adecuada para la separación de
compuestos polares a polares bajos se eligió típicamente para el análisis AHL, mediante el uso de fases
móviles de metanol/agua o acetonitrilo/agua en programas de elución isocráticos o en gradiente.
Al igual que el componente LC, la pieza MS también está disponible en varias soluciones
tecnológicas diferentes. El componente que más afecta el emparejamiento de LC con MS es la interfaz,
que es el lugar donde las moléculas se transforman en iones. Normalmente, en LCMS, la interfaz se
calienta y permite que se produzca la ionización en un campo eléctrico a presión atmosférica (API).
Esto se puede obtener de dos maneras: por ionización química (APCI) y por ionización por electropulverización (ESI).
ESI es, con mucho, el modo más extendido, siendo adecuado para una gran variedad de sustancias
químicas, incluidas las acil homoserina lactonas. Es una ionización suave, lo que significa que solo se
forma el ion molecular en la fuente; por lo tanto, por un lado, la masa molecular y la fórmula (en mediciones
de masa precisas) se calculan fácilmente, pero por otro lado, para obtener información estructural es
necesario dar un paso más de fragmentación de masa (tandem MS o MS/MS) , que generalmente ocurre
en un lugar distinto y en un momento diferente durante el análisis espectrométrico de masas, aunque
también es posible forzar la fragmentación en la fuente (CID).
40 Capítulo 2
El núcleo de un espectrómetro de masas lo constituye el analizador. Los analizadores más comunes son los
basados en cuadrupolo, tiempo de vuelo y trampa de iones. Sin entrar en una descripción técnica más
profunda, para la mayoría de los enfoques específicos y cuantitativos y en todos los casos en que la
sensibilidad es el punto crucial, como para la detección de QS, los analizadores basados en cuadrupolo son
la opción preferida, especialmente cuando tres unidades de cuadrupolo se acoplan en serie (QqQ , triple cuadrupolo).
Además, QqQ ofrece una alta velocidad de análisis debido a su escaneo extremadamente rápido, aunque la
resolución de masa es generalmente baja (una unidad de masa). El mejor acoplamiento LCMS se obtuvo con
la introducción en 2004 de la cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC). La tecnología UPLC, basada
en partículas de menos de 2 μm, allanó el camino hacia una nueva era en las separaciones
cromatográficas, lo que permitió acortar el tiempo de las corridas analíticas, pero manteniendo la resolución
máxima óptima. Un ejemplo de aplicación de UPLC en análisis QS fue proporcionado por el trabajo de Fekete et al. (2007).
En la estrategia adoptada para el análisis AHL, incluyeron un paso de prepurificación del sobrenadante
bacteriano mediante cartuchos RP18 SPE, seguido de análisis UPLC en una columna BEH C18 eluida con
una mezcla de agua y acetonitrilo. El gradiente utilizado fue muy rápido, de 10% a 100% ACN en solo 1min,
manteniéndose en 100% ACN en elución isocrática; sin embargo, la resolución entre los miembros
homólogos de AHL saturadas y no sustituidas fue apreciable. Además, los tiempos de retención para la
mayoría de los AHL se predijeron debido a sus valores teóricos de logP.
Sin embargo, para confirmar la identidad de AHL en un extracto bacteriano, siguieron un enfoque fuera de
línea integrado que resultó en mediciones adicionales de FTICRMS (espectrometría de masas de resonancia
de ciclotrón de iones transformados de Fourier) de los iones moleculares [M + H]+ protonados . FTICRMS es
una técnica de espectrometría de masas de ultra alta resolución que puede otorgar una resolución de
1 000 000 FWHM (ancho completo a la mitad del máximo) y una resolución de masas inferior a 0,5 ppm. Esto
significa que los metabolitos conocidos y desconocidos pueden caracterizarse químicamente de forma
sencilla en mezclas complejas; Por lo tanto, FTICRMS se utilizó para identificar el principal producto AHL de
la bacteria Acidovorax sp. N35 (p. ej., 3OHC10AHL). Sin embargo, dado que el acoplamiento con
FTICRMS no es técnicamente factible debido a las diferentes velocidades de escaneo, desarrollaron un
acoplamiento en línea para una detección rápida basada en un chip para una ionización por nanoelectrospray
(Li et al., 2007) . Sin embargo, el mismo método UPLC se aplicó con éxito mediante el uso de una
plataforma en línea UPLCQqQ más fácil de administrar (Abbamondi et al., 2016), aprovechando el modo de
escaneo de adquisición MRM para la detección de AHL. La monitorización de reacciones múltiples (MRM) es
uno de los enfoques basados en masas en tándem más potentes para la identificación de metabolitos
diana con un alto nivel de sensibilidad y especificidad. En un análisis MRM, la adquisición de datos
se activa solo cuando se produce una fragmentación seleccionada. Así, el primer y el tercer
cuadrupolo funcionan como filtros de masa, seleccionando el ion molecular y el ion producto
esperado, respectivamente; el segundo cuadrupolo intermedio sirve como cámara de colisión y es el
espacio donde tiene lugar una fragmentación controlada del ion original molecular. Solo cuando se genera un
ion de producto a partir de un ion principal como se estableció previamente, el detector adquiere y registra
una señal; este comportamiento, junto con las propiedades de escaneo rápido del analizador de
cuadrupolo, se refleja en un aumento impresionante de la selectividad y la sensibilidad para las transiciones
de pares iónicos monitoreadas.
En el artículo de Abbamondi et al. (2016), las transiciones de diagnóstico para el análisis AHL fueron aquellas
que generaron el fragmento de lactona de homoserina en m/z 102 y, en consecuencia, se procesaron series
homólogas de derivados estándar sintéticos, incluidos los hidroxilo y oxoAHL no sustituidos, en las
condiciones UPLC informadas por Fekete . et al. (2007) (Fig. 6, Grauso y Cutignano, datos no publicados).
Sobre la base de un enfoque combinado que se basa en el uso de biosensores y espectrometría de masas,
se detectó actividad QS relacionada con AHL en los medios de cultivo de la bacteria halófila Halomonas
smyrnensis AAD6 mediante superposición de TLC y se identificó inequívocamente y se adscribió a una C16HSL
de cadena larga inusual. mediante análisis UPLCMS/MS (MRM) (Abbamondi et al., 2016).
De acuerdo con el mismo principio básico, los análisis de masas de triple cuadrupolo en el modo de adquisición
MRM se emplearon en varios otros trabajos de investigación, mediante el uso de soportes cromatográficos
UPLC similares de diferentes fabricantes pero con dimensiones de columna y longitudes de ejecución
cromatográfica variables (Chan et al., 2014, 2016 ) o por HPLC tradicional en RP18 (Kumari et al., 2008; Morin
et al., 2003; Tan et al., 2014) o fases más polares, como Atlantis T3 (Sun et al., 2018).
Una alternativa al triple cuadrupolo se presenta en forma de configuraciones híbridas, como los
espectrómetros de masas con trampa de iones lineales de cuadrupolo (QqQLIT). Estos instrumentos ofrecen la
ventaja de combinar en una sola serie de LC las ventajas de los analizadores convencionales de triple cuadrupolo
y de trampa de iones lineal (LIT). Por lo tanto, además de los modos de escaneo habituales de triple
cuadrupolo, incluido MRM pero también modos de escaneo de iones de producto (PI), iones precursores (PC) y
pérdida neutra (NL), la alta capacidad de almacenamiento de iones, velocidad de escaneo y resolución de
lineal se aprovechan las trampas iónicas, lo que permite obtener información estructural incluso de compuestos
desconocidos. De hecho, cuando los terceros cuadrupolos funcionan como LIT, es posible adquirir espectros de
iones de productos de alta calidad útiles para la identificación estructural. Esta técnica de HPLCQqQLIT se aplicó para determin
Fig. 6
Perfiles representativos de UPLCESI+ MS/MS (MRM) de AHL estándar mediante el uso de una
columna BEHC18 con gradiente de agua/acetonitrilo. (A) Grupo de cinco oxoAHL y tres CAHL; (B) grupo
de siete OHAHL.
42 Capítulo 2
perfil y la abundancia relativa de 24 AHL en Yersinia pseudotuberculosis que, por lo tanto, resultó ser la bacteria
con el espectro más amplio de AHL producido por una sola especie (Ortori et al., 2007).
3.2.3 Electroforesis capilarespectrometría de masas (CEMS)
La electroforesis capilar (CE) en capilares de sílice fundida sin recubrimiento junto con la espectrometría
de masas es una técnica analítica que ofrece algunas ventajas atractivas: eficiencia de separación, sensibilidad
de detección e identificación química. Sin embargo, un inconveniente importante lo representa la compatibilidad
de las soluciones tampón requeridas para la separación electroforética con el proceso de ionización espectrométrica
de masas por ESI. De hecho, las separaciones por electroforesis se basan intrínsecamente en la migración
diferencial de especies cargadas en un campo eléctrico y, como tal, el medio tampón utilizado para la separación
cromatográfica tiene una gran influencia en la estabilidad del pH y la diferencia de movilidad. Por otro lado,
los tampones comunes utilizados en CE (p. ej., tampones de fosfato y TRIS) no son compatibles con
ESI que impone solo tampones volátiles. Además, una alta molaridad generalmente mejora la capacidad de
amortiguación del sistema, pero nuevamente ESI funciona mejor con una concentración de tampón de
aproximadamente 10 mM. Para complicar aún más las cosas, los AHL no exhiben grupos cargables, siendo la
amina secundaria estabilizada por el enlace amídico.
Así, se propuso una forma de superar este aspecto mediante la cromatografía electrocinética micelar
(MEKC) (Frommberger et al., 2003). Los mejores resultados se obtuvieron utilizando dodecilsulfato de sodio
(SDS) 10 mM para la formación de micelas con llenado parcial del capilar con la solución micelar (PFMEKC). Se
detectaron dos AHL en Burkholderia cepacia en un análisis de tiempo relativamente corto (20 min), pero no se
pudieron obtener datos cuantitativos con la herramienta analítica propuesta. Luego se lograron mejoras
técnicas analizando AHL en sobrenadantes de cultivo de Pseudomonas fluorescens por CEMS después de
la hidrólisis básica del anillo de lactona. Las separaciones se realizaron en tampón de carbonato de amonio 20
mM para preservar la interfaz MS, y las mediciones cuantitativas se obtuvieron a través del estándar interno
C7HSL y la preconcentración de la muestra por intercambio aniónicoSPE (Frommberger et al., 2005).
3.2.4 Espectrometría de masas de ionización y desorción láser asistida por matriz (MALDIMS)
Los métodos basados en MALDIMS se han aplicado tradicionalmente a la identificación de
biomoléculas (péptidos/proteínas, oligo/polisacáridos, ácidos nucleicos), que se revelan como iones moleculares
sin que se produzca fragmentación durante el proceso de ionización. Desde un punto de vista técnico, la muestra
se mezcla con una cantidad definida de una matriz [p. ej., ácido αciano4hidroxicinámico (αCHCA) y
ácido 2,5dihidroxibenzoico (DHB)] y se deja co cristalizar en un plato. La ionización tiene lugar por irradiación
con una luz láser que calienta rápidamente la matriz, que a su vez se vaporiza junto con la muestra. Se acepta
comúnmente que MALDI no se diseñó originalmente para la ionización de moléculas pequeñas (por debajo de
500 Da) debido a la interferencia debida a los picos de la matriz. Para abordar este problema, se han informado
varios métodos (Zhang et al., 2010). Sin embargo, se identificaron moléculas de 3oxoAHL
por MALDITOFMS como tal en extractos bacterianos de Pantoea agglomerans (Jiang et al., 2015) o cuantificados
tras derivatización con reactivo de Girard en P. aeruginosa (Kim et al., 2015).
3.2.5 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear
La resonancia magnética nuclear (RMN) es la técnica principal utilizada para dilucidar estructuras orgánicas.
Desafortunadamente, su límite de detección está en la escala mM; por lo tanto, está en un rango de
concentración mucho más alto que las técnicas basadas en MS. La consecuencia es que probablemente requiera
grandes volúmenes de cultivo bacteriano para la extracción y purificación de AHL antes de la adquisición de
espectros de RMN del compuesto puro aislado (Pearson et al., 1994). Aunque fundamental al comienzo de la
historia para caracterizar estructuralmente las señales QS y reconocer nuevos esqueletos moleculares (Doberva
et al., 2017; Shen et al., 2016), su papel pasa a un nivel secundario en los enfoques analíticos destinados a
identificar y cuantificar autoinductores conocidos.
3.3 Enfoques analíticos para la identificación y cuantificación de otras moléculas QS
Los péptidos autoinductores (AIPs) de Staphylococcus aureus Gram positivo virulento controlan la secreción de
enterotoxinas pertenecientes a la familia de los superantígenos: estas toxinas proteicas desencadenan una
activación anormal de las células T, produciendo una serie de síntomas clínicos que van desde la dermatitis
atópica hasta los síndromes de shock tóxico. En particular, los AIP de un grupo inhiben de forma cruzada
la expresión génica en cepas de otros grupos, por lo que un método para la detección y diferenciación de AIP
resultó de relevancia clínica en la infección y se esperaba que fuera de utilidad diagnóstica. Así, en un estudio
realizado por Kalkum et al. (2003), se desarrolló un método de espectrometría de masas multietapa con un
instrumento de trampa de iones cuadrupolo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI), que
implementa un enfoque tradicional para estudiar moléculas peptídicas que se basan en fuentes de iones MALDI
(Chaurand et al., 1999) . En un primer caso, se utilizó siguiendo un enfoque basado en hipótesis. De hecho, los
AIP se sintetizan como propéptidos grandes y se hidrolizan sucesivamente para formar péptidos QS
maduros durante la excreción (Sturme et al., 2002); así, el conocimiento de la secuencia de ADN permite predecir
todas las posibles secuencias de aminoácidos de péptidos más cortos que se originan a partir de la
escisión del precursor biosintetizado; los valores m/z de estos péptidos putativos pueden buscarse mediante
cribado de objetivos en los sobrenadantes bacterianos y enumerarse para experimentos de confirmación de MS2
(MS/MS) y MS3 (MS/MS/MS). En un segundo caso, se aplicó para asignar la estructura desconocida de AIP de
Staphylococcus intermedius como una lactona nonapeptídica.
En ambos casos, se aprovechó al máximo la capacidad de una trampa de iones MALDI para aislar iones
específicos de matrices ruidosas y convertirlos en fragmentos registrados con una menor interferencia de fondo
mediante el uso de una pequeña cantidad de muestras en poco tiempo. Sin embargo, el límite de la espectrometría
de masas MALDI convencional está en su información cualitativa para la identificación de compuestos, no siendo
tan fiable como otras plataformas de espectrometría de masas para fines cuantitativos. Para superar este aspecto,
recientemente se ha propuesto para el análisis de péptidos la aplicación de una configuración híbrida
constituida por una combinación de analizadores de masas cuadripolares o lineales con trampa de iones y orbitrap
en línea con UPLC para garantizar tiempos cortos (10 minutos o menos) para las corridas cromatográficas.
44 Capítulo 2
(Junio et al., 2013; Olson et al., 2014; Todd et al., 2016). Por lo tanto, se predijeron una serie de AIP putativos
maduros de cepas de Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina
(MRSA) en función de la secuencia del gen del péptido precursor putativo más largo (gen agrD), y luego sus
iones m/z correspondientes, coincidiendo con el masa exacta, se buscaron en las fracciones activas, las cuales
fueron seleccionadas por cepa reportera de bioensayo. Usando esta estrategia, se detectaron diferentes AIP y
se estableció su secuencia de aminoácidos mediante experimentos de EM en tándem y también por síntesis
(Olson et al., 2014). Esta metodología se utilizó para monitorear la producción dependiente del tiempo de AIPI de
S. aureus y para comparar sus niveles en diferentes cepas (Junio et al., 2013) , así como para evaluar la inhibición
de la producción de AIP mediante la medición cuantitativa de la péptido en el filtrado bacteriano bajo diferentes
tratamientos con antibióticos (Todd et al., 2016).
Se han informado dipéptidos cíclicos pequeños (dicetopiperazinas, DKP) con la capacidad de activar un biosensor
AHL basado en LuxR de bacterias Gram negativas, especialmente del ambiente marino ( Abbamondi et al., 2014;
Holden et al., 1999; Tommonaro et al. ., 2012). Su identificación molecular se puede realizar mediante análisis
GCMS llevado a cabo en moléculas no derivatizadas y confirmado por síntesis química, según lo informado por
Gu et al. (2013).
GCMS y HPLCMS/MS en una plataforma de triple cuadrupolo se aprovecharon para la cuantificación directa o
posterior a la derivatización de las señales AI2. Teniendo en cuenta la naturaleza química de esta clase de
autoinductores, constituidos por una mezcla de moléculas boradas y no boradas interconvertidas, la identificación
de los componentes activos de la piscina ha sido siempre difícil. Además de su baja abundancia, una de las
principales complicaciones fue la naturaleza hidrofílica de estos compuestos que impidió tanto el uso de extracción
con solventes orgánicos para la concentración de muestras como la reacción química en medios lipofílicos para
convertirlos en derivados menos polares. Por lo tanto, se desarrollaron estrategias alternativas para derivatizar
dihidroxi pentanodiona (DPD) por reacción con 1,2fenilendiamina en tampón acuoso para obtener su
derivado (3metilquinoxalin2il)etano1,2diol (De Keersmaeckert et al . , 2005). Este producto se identificó
originalmente directamente por HPLCMS/MS (Hauck et al., 2003) o, después de una mayor derivatización de los
restos de diol con NmetilN(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA), por GCMS ( Thiel et al., 2009b).
Este último paso fue necesario para hacer que el derivado de quinoxalina diol fuera volátil y adecuado para el
análisis GCMS. Aplicando este procedimiento y usando un análogo estándar marcado isotópicamente, se
desarrolló y validó una metodología cuantitativa en Vibrio harveyi BB152 y Streptococcus mutans UA159,
exhibiendo una sensibilidad comparable a los sistemas de biosensores.
Recientemente, también se han propuesto métodos mejorados para la determinación cuantitativa de AI2 posterior
a la derivatización mediante HPLC acoplada a espectrometría de masas en tándem en QqQ (Campagna et al.,
2009; Xu et al., 2017).
Las moléculas QS de la familia de las quinolonas (alquil quinolona, AQ), incluida la 4hidroxi 2
alquilquinolina y sus Nóxidos, han sido identificadas tanto por GCMS con captura de electrones como por LCMS
(Lepine et al., 2004; Taylor et al . al., 1995; Vial et al., 2008). Debido a la inestabilidad térmica
y poca volatilidad en las condiciones experimentales, la metodología GCMS requería la conversión de los
compuestos naturales en derivados de bistrifluorometilbenzoilo, que se han utilizado durante mucho
tiempo para identificar y cuantificar una gama de compuestos hidroxilados y nitrogenados, y para los N
óxidos, reducción adicional a la hidroxiquinolina original. Se reveló una relación lineal entre la longitud de la
cadena alquílica y el tiempo de retención, lo cual fue conveniente cuando se buscaban
compuestos de baja abundancia. Como de costumbre, los métodos analíticos de LCMS informados no
requirieron ninguna derivatización. Ambos enfoques se han utilizado para la cuantificación de AQ con
estándares internos deuterados. Curiosamente, se desarrolló una identificación simultánea de
componentes de las familias AQ y AHL en P. aeruginosa mediante un procedimiento HPLCESIMS/MS
(MRM) específico (Ortori et al., 2011). Sin duda, esto es una ventaja cuando el interés radica en una amplia
gama de señales QS, que ofrecen un perfil claro de la respuesta de señalización bacteriana. Recientemente,
se propuso una plataforma miniaturizada para la identificación y cuantificación de AQ, basada en
microextracción líquidolíquido dispersivo y MALDI MS con matrices líquidas iónicas (ILM) (Leipert et al.,
2018). Esta última constituye una matriz alternativa para las preparaciones de muestras MALDI que permite
superar la distribución no homogénea de analitos y matrices en muestras sólidas convencionales, lo
que da como resultado mediciones cuantitativas más confiables (ZabetMoghaddam et al., 2004). Aunque
no es capaz de detectar AHL, se presenta como un método rápido, reproducible y sencillo para la
identificación simultánea de diversas moléculas de señalización, toxinas y factores de virulencia
(por ejemplo, AQ y piocianina) en muestras clínicas y validado en pacientes con fibrosis quística.
'muestras biológicas como herramienta para la investigación básica o fines de diagnóstico.
4 Observaciones finales
La comunicación de detección de quórum (QS) en bacterias es uno de los descubrimientos más intrigantes
de las últimas dos décadas. A pesar de la química simple que impulsa el mensaje molecular entre los
microorganismos y entre estos y el huésped, se requiere un gran esfuerzo analítico para la detección,
identificación y medición de los niveles de todos estos diferentes metabolitos de bajo peso molecular. El
tremendo progreso de los últimos años en las plataformas tecnológicas, especialmente en el campo de la
espectrometría de masas, ha abierto las puertas a una nueva era en los estudios químicos y bioquímicos
para una comprensión más profunda de los mecanismos que subyacen a las interacciones entre
organismos y su regulación. De hecho, QS provoca un reajuste metabólico global que induce la biosíntesis
de metabolitos secundarios normalmente codificados por grupos de genes silenciosos que, en última
instancia, pueden conducir al descubrimiento de nuevos productos naturales. La metabolómica basada
en MS como enfoque analítico es una forma de monitorear estos cambios bajo la influencia de
diferentes señales QS moleculares, tanto en la comunicación intraespecies como entre especies.
Hasta el momento se han informado pocos estudios, pero se espera que más aborden este tema (Davenport
et al., 2015; Tang et al., 2018). La importancia de la regulación de la red metabólica mediada por QS
radica en el hecho de que puede cruzar los límites del reino microbiano e involucrar una conversación
cruzada entre reinos, dando forma a las interacciones bacteriahuésped tanto patógenas como no patógenas. Un profundo
46 Capítulo 2
cómo las células huésped responden a señales externas como las moléculas QS puede allanar el camino para
diseñar nuevas terapias basadas en células (McNerney y Styczynski, 2018). En general, una identificación
más profunda y amplia de la base química de la señalización QS no solo en bacterias sino también en otros
microorganismos (p. ej., hongos y microalgas) promete tener un gran impacto en la ecología, la agricultura y
la medicina.
Glosario
La electroforesis capilar (CE) es una técnica analítica que se basa en capilares de calibre estrecho (20–200 μm
de DI) para separar con alta eficiencia tanto moléculas pequeñas como grandes. Las separaciones se logran
mediante la aplicación de altos voltajes, que promueven el flujo electroosmótico y electroforético de soluciones
tampón y especies iónicas dentro del capilar.
La ionización por electropulverización (ESI) es una técnica de ionización "suave" utilizada en la espectrometría de
masas para producir iones moleculares mediante la nebulización de un líquido bajo altos voltajes sin o con
poca fragmentación.
La espectrometría de masas por resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier (FTICRMS) es un
analizador de masas basado en la frecuencia de ciclotrón de los iones colocados en un campo magnético fijo.
Se caracteriza por una alta resolución y una precisión de masa de 1 a 2 ppm.
La cromatografía de gasesespectrometría de masas (GCMS) es una técnica analítica con guión que combina el
alto poder de resolución de la cromatografía de gases con la detección sensible de la espectrometría de
masas. Es adecuado para la separación de moléculas volátiles y térmicamente estables detectadas en virtud
de su valor de relación masacarga (m/z).
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica analítica utilizada para separar, identificar y
cuantificar componentes individuales en mezclas complejas. Requiere un aparato de bombeo para permitir
que el solvente que contiene la muestra pase a través de una columna rellena con un material adsorbente.
Diferentes composiciones de solventes (fase móvil) y materiales adsorbentes (fase estacionaria) permiten la
separación de diferentes componentes, eluyendo de la columna en diferentes tiempos según sus propiedades
químicas y su interacción específica con la fase estacionaria.
La cromatografía líquidaespectrometría de masas (LCMS) es una técnica analítica en la que la cromatografía
líquida está en línea con la espectrometría de masas. Representa uno de los enfoques más fiables y sensibles
para la detección, identificación y mediciones cuantitativas de moléculas. Bajo la definición general de
metodologías LCMS se engloban diferentes soluciones tecnológicas, que ofrecen diferentes grados de
sensibilidad, resolución de masa y precisión. Cuando la cromatografía líquida se acopla a un analizador de
masas multietapa (LCMS/MS), permite la detección de iones de producto generados por fragmentación
inducida por colisión.
La desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) es una técnica de ionización "suave" utilizada en
espectrometría de masas para obtener iones a partir de macromoléculas con una fragmentación mínima.
Utiliza un láser pulsado para irradiar la muestra mezclada con una matriz adecuada.
La espectrometría de masas (MS) es una poderosa técnica analítica que se utiliza para medir la relación
masacarga (m/z) de los iones. Su configuración instrumental básica abarca una fuente de iones, un
analizador y un sistema detector. Se utiliza para identificar compuestos desconocidos dentro de una
muestra, para dilucidar la estructura y las propiedades químicas de diferentes moléculas y para
cuantificar materiales conocidos.
La monitorización de reacciones múltiples (MRM) es un diseño experimental de varias etapas que se utiliza
con un analizador de masas de triple cuadrupolo (QqQ) para detectar específicamente y cuantificar
simultáneamente cientos de analitos objetivo en una mezcla con alta sensibilidad. Requiere un preajuste
de iones precursores y fragmentos vinculados en una reacción de fragmentación para detectar y registrar
una señal.
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica espectroscópica que explota H y
1
magnéticas estructurales de algunos núcleos (es 13C), lo que permite recopilar las propiedades
decir, información sobre moléculas orgánicas midiendo la absorción de radiación electromagnética
cuando una muestra se coloca en un fuerte campo magnético.
El monitoreo de iones seleccionados (SIM) es un experimento de masa de una sola etapa en el que se
monitorean uno o más iones con proporciones específicas de masa a carga (m/z). En el modo de
adquisición SIM, los iones formados en la fuente se acumulan en el analizador, que actúa como filtro y
permite que solo aquellos con la relación m/z seleccionada se transfieran al detector.
La extracción en fase sólida (SPE) es un proceso de preparación de muestras mediante el cual los
compuestos de una mezcla se disuelven o suspenden en una fase líquida y se separan entre sí mediante
el uso de un material adsorbente, de acuerdo con sus propiedades físicas y químicas. Se utiliza para
extraer o concentrar y purificar muestras para análisis de una amplia variedad de matrices, incluidos
fluidos biológicos (orina, sangre), medios de cultivo bacterianos, tejidos vegetales y animales y suelo.
La cromatografía en capa fina (TLC) es una técnica cromatográfica tradicional utilizada para separar
compuestos no volátiles en una mezcla. Se lleva a cabo sobre una placa de vidrio o lámina de aluminio
cubierta con una fase estacionaria (típicamente sílice), cargada en un punto base con la muestra y
revelada en una cámara cromatográfica que contiene una mezcla de elución (fase móvil). El diferente
factor de retardo (Rf), es decir, la distancia recorrida con respecto al disolvente, de los distintos
componentes depende de sus propiedades químicas y afinidad por la fase móvil.
El Triple Cuadrupolo (QqQ) es un analizador de masas configurado con tres cuadrupolos en serie. Es
adecuado para el análisis cualicuantitativo altamente sensible y específico de metabolitos en mezclas
mediante la aplicación de diferentes diseños experimentales, incluido MRM.
La cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC/UHPLC) es una técnica moderna que mejora el
rendimiento de la HPLC con respecto a la velocidad, la resolución y la sensibilidad. Se basa en columnas
llenas de partículas de menos de 2 μm de diámetro y requiere una presión más alta (15–18 kpsi) que la
HPLC. Es especialmente adecuado para el acoplamiento con espectrómetros de masas modernos.
48 Capítulo 2
abreviaturas
AHL Lactonas de NacilLhomoserina
Péptido autoinductor de AIP
AQ alquil quinolona
Electroforesis capilar CE
Ionización por electropulverización ESI
FTICRMS Espectrometría de masas por resonancia de ciclotrón de iones con transformada de Fourier
FWHM ancho completo a la mitad del máximo
GCFID cromatografía de gasesdetector de ionización de llama
GCEM cromatografía de gasesespectrometría de masas
HPLC cromatografía líquida de alta resolución homoserina
LGV lactona
CLEM cromatografía líquidaespectrometría de masas
LCMS/MS cromatografía líquidaespectrometría de masas en tándem
LLE extracción líquido/líquido
Desorción/ionización láser asistida por matriz MALDI
Supervisión de reacciones múltiples MRM
espectrometría de masas MS
resonancia magnética nuclear RMN
Triple cuadrupolo QqQ
Trampa de iones lineal de triple cuadrupolo QqQLIT
Detección de quórum QS
factor de retención de radiofrecuencia
Supervisión de iones seleccionados por SIM
Extracción en fase sólida SPE
TOF tiempo de vuelo
cromatografía de capa fina TLC
Cromatografía líquida de ultra rendimiento UPLC
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