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RESUMEN
La contaminación en el Río Bogotá puede generar que los microorganismos originen
procesos adaptativos que se expresan como mecanismos de resistencia. Uno de los
problemas en la salud pública es que los genes de resistencia sean transferidos de bacterias
ambientales a patógenos de humanos. Dado que en Colombia no hay investigaciones
similares, se presenta este estudio tomando muestras en tres diferentes puntos del Rio
Bogotá en zona rural. Se utilizó la metodología de difusión por discos de Kirby-Bauer. A las
23 colonias aisladas se les determinó la resistencia a los antibióticos ampicilina, tetraciclina,
cloranfenicol y kanamicina. El 73,9% de las bacterias aisladas presentaron resistencia al
menos a un antibiótico. Del total de las cepas, 6 mostraron multirresistencia a dos y tres
antibióticos. Se logró realizar la identificación de dos cepas seleccionadas dando como
resultado Escherichia coli. Con esta investigación de espera el inicio de la estandarización
de este método en el contexto del país, ya que a nivel nacional no hay una guía o manual de
esta metodología por parte del ente regulador.
INTRODUCCION
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aumenta los costos de los tratamientos y de las largas estancias hospitalarias (Sussmann,
Mattos, & Restrepo, 2002).
Los cambios en las barreras de permeabilidad que generan resistencia son: la modificación
energética en la permeabilidad de la membrana interna, lo cual dificulta transportar el
antibiótico hacia el interior de la célula y mutación en las Porinas (canales de difusión que se
encuentran en la membrana externa de la bacteria) que genera la disminución del paso del
antibiótico (Sussmann, Mattos, & Restrepo, 2002).
En los humanos existen diferentes causas que podrían generar resistencia a los antibióticos,
como lo es la automedicación y el uso de tratamientos no requeridos. Actualmente se
presenta la problemática de la transferencia de la resistencia por medio de la comida, como
en el caso del uso de de los antibióticos como aditivos promotores de crecimiento en pollos
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de engorde. Dado el uso subterapéutico de los antibióticos, con frecuencia se ha dudado que
estas concentraciones bajas puedan generar resistencia transferible. Sin embargo, mediante
estudios realizados en Inglaterra, se demostró que la alimentación de pollos con
oxitetraciclina, generó en estos resistencia del la bacteria E. coli a la tetraciclina, y que había
transferencia de las cepas de E.coli resistentes al personal de la granja (Witte, 1999).
Hace aproximadamente tres decenios los microbiólogos emplean discos de papel para
determinar si un cultivo es susceptible o no a un antibiótico. Uno de los aportes de mayor
importancia fue de los científicos Bauer, Kirby, Sherris y Turck de la Universidad de
Washington, Seattle. Estos autores diseñaron una técnica de disco único que se interpreta en
forma cuantitativa. Ellos utilizaron diferentes variables del método, como el medio de
cultivo, la temperatura y el espesor del agar. En 1966 publicaran su estudio describiendo la
prueba que se utiliza en la actualidad (Thornsberry, 1976).
El concepto básico del método de Kirby-Bauer es que existe correlación ente el tamaño de la
zona de inhibición y la susceptibilidad clínica del microorganismo. Basados en esta
hipótesis, se genero un procedimiento para establecer un conjunto de diámetros con fines
interpretativos (Thornsberry, 1976).
En esta prueba se manejan muchos factores los cuales pueden afectar el resultado, como lo
es el uso de un agar distinto al Mueller- Hinton, el pH del medio de cultivo que puede variar
las interpretaciones de los tamaños de las zonas de resistentes a sensibles y la temperatura de
incubación, como lo es el caso de S. aureus el cual presenta resistencia a cefalotina a 35°C,
pero no se le ve nunca a 37°C (Thornsberry, 1976).
Las limitaciones de éste método se basan en que solo sirve para bacterias de desarrollo
rápido y no sirven para microorganismos que se aíslan raras veces. Los resultados de la
prueba de Kirby – Bauer no son valederos si los cultivos no son puros (Thornsberry, 1976).
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Los agentes antimicrobianos se dividen en el efecto que generan en las bacterias, siendo
bacteriostáticos o bactericidas. Los agentes bacteriostáticos inhiben el crecimiento y
multiplicación de las bacterias, pero, si el agente es retirado, las células vuelven a
multiplicarse. En cambio, los agentes bactericidas inhiben el crecimiento de las células y
además desencadenan mecanismos dentro de la célula que conllevan a la muerte celular, por
lo tanto su efecto es irreversible (Coyle, 2002).
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Estudios realizados en Turquía, utilizando la metodología del CLSI, en agua potable luego
de un tratamiento básico y proveniente de ríos, muestra la presencia de resistencia de E.coli a
antibióticos de interés para esta investigación, como lo son la ampicilina, tetraciclina y
cloranfenicol. El río descrito es similar al Rio Bogotá en los puntos de muestreo, ya que
pertenece a zonas rurales subdesarrolladas y agrícolas, y con aguas residuales de
asentamientos locales (Birol, Celik, & Alpay-Karaogly, 2007). Otra investigación realizada
en Venezuela también utilizó la metodología del CLSI. Se tomaron muestras de aguas
residuales de la PTAR que recibe aguas del sector industrial, en la cual se encontró
resistencia de E.coli a ampicilina y tetraciclina (Martínez & Villalobos, 2008).
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El uso de antibióticos para las investigaciones varía dependiendo de la frecuencia del uso
que se le da en cada país.
La mayoría de los países latinoamericanos utilizan como fuente principal las normas del
CLSI y además implementan algunas modificaciones a los métodos para contextualizarlos a
las características de cada país. Como ejemplo se encuentra Argentina, el cual su Ministerio
de Salud expide el Manual de los procedimientos para determinar la sensibilidad de las
bacterias a los antibióticos (Malbrán, Carlos; Instituto nacional de enfermedades infecciosas,
2001). Así mismo se encuentra Perú (Instituto Nacional de Salud de Perú, 2002) y Chile
(Instituto de Salud Pública de Chile), en los cuales sus Ministerios de Salud conjunto con los
Institutos de la Salud emiten los manuales que deben utilizar los laboratorios de estos países.
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METODOLOGÍA
Muestreo
Se escogieron cuatro puntos de muestreo del Rio Bogotá, en la Sabana de Bogotá. Para cada
muestra se tomo un volumen de 150ml en envases estériles. La recolección se realizó en el
agua superficial del río, con el fin de obtener bacterias aerobias.
La primera muestra 3 (M3) fue tomada en el cruce de la vía Cota – Suba con el Rio Bogotá.
La muestra 4 (M4) fue tomada en el mismo punto que la tercera muestra, con la diferencia
que ésta se recolecto en el desagüe de una tubería dirigida al río, posiblemente de aguas
residuales de las cercanías debido a su color y olor. La quinta muestra (M5) fue tomada en la
calle 193 con carrera 18 en el punto del canal (caño) Torca, Bogotá.
Métodos microbiológicos
Para cada muestra, se hicieron cuatro diluciones seriadas con solución salina al 0,85%. Se
realizó una siembra superficial en agar nutritivo, añadiendo 0,1 ml de cada dilución a la caja
de petri. Finalmente se incubó a 37,5°C por 24 horas.
Con el propósito de obtener cultivos puros se realizó el aislamiento de las colonias en agar
nutritivo (Becton, Dickinson and Company). Se incubó a 37°C durante 18 a 24 horas
(tiempo estándar de crecimiento de las bacterias). Se realizaron los pases necesarios hasta
comprobar que se tenía un cultivo puro (Ordoñez Smith, 1994).
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Cepario
Una vez obtenidos los cultivos puros, cada una de las cepas se almacenó en glicerol al 1% a -
80°C. Estas se encuentran en el laboratorio del Centro de Investigación en Ingeniería
Ambiental de la universidad.
Prueba de sensibilidad
Según el método de la NCCLS, los resultados del diámetro del halo de inhibición son
informados como sensibles, intermedios y resistentes. Esta interpretación proviene de las
tablas 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H ó 2I de las normas M2 – A7 del NCCLS de Enero de
2001, las cuales relacionan la bacteria, el antibiótico y el diámetro, para hallar su
interpretación (Instituto nacional de enfermedades infecciosasde Argentina, 2001). Pero, en
este caso, las bacterias utilizadas para realizar el antibiograma no han sido caracterizadas
previamente, por lo tanto, aquellas que no generaron un halo fueron consideradas resistentes,
y las que si generaron inhibición, fueron consideradas sensibles.
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Las cepas identificadas como resistentes fueron aisladas y sembradas en el medio Mueller-
Hinton. En el caso de algunas cepas que presentaron morfología distinta en una misma caja
de petri, fue necesario aislarlas y realizar nuevamente la prueba de sensibilidad.
Se realizó el procedimiento de tinción de Gram, con el fin de tener una primera evaluación
del tipo de bacterias presentes, además para comprobar la eficiencia del aislamiento y la
pureza del cultivo. Por lo tanto, las cepas que presentaron variación en los resultados de la
tinción, fue necesario realizarles nuevamente la prueba de sensibilidad. Esto es importante
para garantizar la identificación de la bacteria completamente aislada y no generar
problemas en los procedimientos moleculares.
Extracción de ADN
Se utilizaron diferentes métodos de extracción con el fin de encontrar el más óptimo para el
requerimiento y las características de cada bacteria. Se realizo el método de extracción Fenol
Cloroformo, basado en el protocolo estandarizado del Centro de investigaciones de
Ingeniería Ambiental (CIIA) de la Universidad de los Andes. También el método de
extracción de suelos PowerSoil® DNA Isolation Kit siguiendo los requerimientos del
fabricante MO BIO Laboratories, Inc.
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cual debía tener un valor menor a 1.8, ya que mide la posible contaminación del ADN; y se
tomó la concentración del ADN dada en ng/µL. De acuerdo con lo que se obtuvo, se
ajustaron las concentraciones de las muestras a un valor aproximado de 30ng/µL, cantidad
optima para el desarrollo de las pruebas moleculares.
La PCR es utilizada para generar varias copias de fragmentos específicos de ADN con el fin
de poder identificar las colonias aisladas. La PCR involucra dos oligonicleotidos o primers
los cuales permiten que la Taq Polimerasa inicie la reacción, además estos delimitan la zona
de ADN que se quiere amplificar. La reacción se realiza en un Termociclador que permite la
exposición de la reacción a una rampa de calentamiento y enfriamiento de los tubos de
reacción, con el fin de controlar la temperatura de cada etapa (McPherson & Moller, 2000).
Se realizó la amplificación 16S del ADN ribosomal. Los primers utilizados fueron 101F y
1392R.
PCR de gradiente
Se realizó una PCR de gradiente con el fin de encontrar la temperatura óptima para realizar
la PCR. El Termociclador evalúa la temperatura adecuada en la que se presenta el
anillamiento de los primers al ADN, teniendo en cuenta el rango de temperatura, el cual
divide en ocho partes, siendo para el primer 101 F 85,3°C y para el primer 1392 R 60,5°C.
Como resultado se obtuvo que la temperatura óptima de anillamiento sea de 64,7°C.
Estandarización de la PCR
Con el fin de buscar las mejores condiciones para la realización de la PCR, se realizaron
diferentes mezclas de reactivos, en los cuales se variaba la cantidad de ADN, de Primers y
de MgCl2. Como resultado se obtuvo la siguiente mezcla:
Tabla 2. Reactivos utilizados en al PCR
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Electroforesis
Purificación
Secuenciación
Después de obtener una secuencia limpia, se llevo a cabo una búsqueda en NCBI Blast para
encontrar el microorganismo que corresponde a la secuencia. Este programa compara los
nucleótidos o proteínas de la secuencia con secuencias presentes en la base de datos, y
realiza un cálculo estadístico de las coincidencias (Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST)).
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Métodos microbiológicos
Por medio de las diluciones seriadas se logró establecer la concentración bacteriana de cada
muestra y escoger las colonias a evaluar.
Tabla 3. Resultado diluciones
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Otro cambio que se realizó en esta investigación a la metodología estandarizada por el CLSI
es la interpretación del antibiograma. Dado que la prueba de CLSI contiene tablas que
relacionan la bacteria, el antibiótico y el diámetro, para hallar su interpretación (Instituto
nacional de enfermedades infecciosasde Argentina, 2001), fue necesario excluirlas debido a
que las cepas no se encontraban identificadas. Por tal razón se tomó la decisión de informar
los resultados sólo como sensibles o resistentes, excluyendo la clasificación de intermedios
como se muestra en la Ilustración 1. Aunque esta decisión generó una fácil interpretación del
antibiograma, fueron descartadas varias cepas intermedias que podrían presentar resistencia
a los antibióticos ya que formaban un diámetro aproximado a 0,8 cm. Por lo tanto se
recomienda tener en cuenta la clasificación de intermedio para la interpretación del
antibiograma.
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Prueba de sensibilidad
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10
10
Numero de Colonias
8
8
6
5
4
4
2 2
2
0
Resultados Sensibles R. Cloranfenicol R. Kanamicina R. Ampicilina R. Tetraciclina
inconsistentes
Dada la prueba de susceptibilidad, se obtuvo que 10 de las cepas aisladas fueran resistentes a
la ampicilina, 8 a tetraciclina, 5 a cloranfenicol y sólo 2 a kanamicina. Estos valores incluyen
multirresistencia por lo que la suma no genera las 23 cepas aisladas.
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Los resultados inconsistentes mostrados en la Gráfica 1 son aquellos en los que la prueba de
sensibilidad es diferente entre las replicas de la colonia. Es posible que esto ocurra debido a
la variedad de bacterias en la misma colonia y por lo tanto sería necesario realizar varios
aislamientos hasta obtener colonias puras. Aunque para estos casos se repitió la prueba una
segunda vez, los resultados obtenidos siguieron siendo diferentes entre replicas.
Las colonias sensibles son aquellas que presentaron halos de inhibición a los cuatro
antibióticos. Como se aclaró en la metodología, se calificó como resistente aquellas colonias
que no generaron halos de inhibición.
7
6
6
M5 M4 M3
5
Número de colonias
4
4
3
3
2 2 2
2
1 1 1 1
1
0
Un Antibiotico Dos Tres Resultados Sensibles
Antibioticos Antibioticos inconsistentes
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5
5
Número de colonias
4
4
3 3
3
2 2 2
2
1 1 1 1
1
0
Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5
Gráfica 3. Numero de colonias que presentan resistencia a antibióticos para cada muestra
Es importante resaltar que sólo 4 de las cepas aisladas son sensibles a los antibióticos y 17
presentan al menos resistencia a un antibiótico. Con esto se sustenta la existencia ambiental
de resistencia en un sistema acuático y se puede afirmar que la ocurrencia de resistencia
bacteriana a antibióticos es el reflejo de la influencia de los seres humanos en el medio
ambiente.
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M5C6. M3C1.
M5C1K. M5C3.
M4C4. M3C3.
Ilustración 4. Aislamiento en caja de petri de las colonias seleccionadas
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PCR
Por medio del ADN obtenido de la extracción Fenol Cloroformo, se realizó la PCR y se
lograron amplificar las colonias M3C3 y M3C1. Para las colonias M5C6 y M5C3 se logró la
amplificación por medio del ADN extraído por el Kit de suelo PowerSoil®.
Tabla 5. Valores de concentración y relación 260/230 de colonias amplificadas
En la ilustración 4 y 5 se muestran las bandas de ADN con algunas impurezas que son
necesarias remover. No se muestran todas las bandas de los productos de PCR y se evidencia
dímeros de primers.
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En la Tabla 5 se presentan los resultados de los métodos de extracción para las bacterias que
lograron ser amplificadas. Utilizando Fenol-Cloroformo se obtuvieron valores mayores en la
relación 260/230 en comparación con el kit de suelo. Pero, las concentraciones de ADN
obtenidas por la extracción de fenol- cloroformo son mayores y más óptimas para la
realización de la PCR que las concentraciones del kit de suelo. Es posible que estos factores
hayan generado que el ADN de las colonias M4C4 y M5C1K no fuera de buena calidad y no
se amplificaran.
Existen factores que influyen en los resultados del PCR como lo son la selección de los
reactivos, su uso y almacenamiento, la cantidad y la temperatura de anillamiento.
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Secuenciación
Ilustración 7. Resultados no adecuados de la secuenciación, visto del programa CLC Main Workbench 6
Para las muestras M3C3 y M3C1 se obtuvieron buenos resultados en la secuenciación, por lo
cual se realizó la búsqueda en Blast de la secuencia consenso. La Tabla 6 y 7 muestran los
primeros cinco resultados reportados en Blast de acuerdo con la mayor puntuación. Dado
que el valor E es muy cercano a cero para todas las muestras, los resultados son altamente
significativos en el puntaje y la alineación de la secuencia, por lo tanto son altas las
posibilidades de que los microorganismos aislados correspondan a los encontrados con el
análisis de Blast.
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Tabla 6. Resultados Blast de la secuencia consenso de M3C3
Por lo tanto, la muestra M3C3 corresponde al microorganismo Escherichia coli. Dado que
la muestra M3C1 presentó resultados de dos microorganismo, se revisó la coloración de
Gram hecha anteriormente, la cual presentó mayor similitud a la bacteria Escherichia coli.
Lo anterior representa que de las dos muestras, se obtuvo una misma bacteria.
Estos resultados se asemejan a los obtenidos en estudios realizados en Turquía, en los cuales
se aisló la bacteria E.coli de agua potable luego de un tratamiento básico y proveniente de
ríos en zonas rurales subdesarrolladas y agrícolas, y con aguas residuales de asentamientos
locales. Sus resultados presentaron que la bacteria generó multirresistencia a los antibióticos
ampicilina, tetraciclina y cloranfenicol (Birol, Celik, & Alpay-Karaogly, 2007). En otra
investigación realizada en Venezuela, también se identificó la bacteria E.coli, aislada de una
planta de tratamiento de aguas del sector industrial, la cual presento resistencia a ampicilina
y tetraciclina (Martínez & Villalobos, 2008).
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CONCLUSIONES
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Por medio de la prueba de difusión por discos se obtuvo que 17 de las bacterias aisladas
presentaron resistencia al menos a un antibiótico, siendo el más común ampicilina y el
menor kanamicina, debido a su uso médico. Además 6 de estas bacterias presentaron
multirresistencia a los antibióticos, hecho que se ha evidenciado en otras investigaciones.
Fue difícil realizar comparaciones de los resultados obtenidos con otros estudios, debido a la
falta de información en Colombia y al no tener identificadas las bacterias.
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AGRADECIMIENTOS
Ante todo a mis padres, quienes por su esfuerzo lograron que yo cumpliera la meta de
estudiar esta carrera en la mejor universidad. Gracias por su apoyo, enseñanzas y amor que
me han brindado.
A mi hermano por ser mi profesor personal, gracias por tu ayuda en todo, por tu compañía y
enseñanzas.
Gracias a Alejandro por ser mi mano derecha y mi apoyo. Por la colaboración en esta
investigación y ayudarme en todo lo de microbiología; además por estar a mi lado, hacerme
reír y vivir conmigo todos estos años de la universidad.
Gracias a Juliana Martínez por compartir conmigo sus conocimientos en microbiología, por
su paciencia, apoyo incondicional en la investigación y enseñarme el encanto del trabajo en
laboratorio.
Gracias a Johana Husserl por su asesoramiento y guía, por siempre ayudarme a enfocarme en
el pensamiento ingenieril del estudio.
Gracias a todos mis amigos, Diana, Laura, Luisa, María Camila y Alejandro, por su infinita
ayuda, acompañamiento y risas en estos años, por compartir conmigo la pasión de esta
carrera.
Gracias a mis amigas Estefanía, Any, Daniela y Catalina, por siempre estar pendientes de
estos años de universidad y por los ratos libres con ustedes para equilibrar la carga
académica.
Gracias a Estefanía Guzmán por hacerme conocer esta carrera, por su ayuda y por ser parte
de mi familia.
Gracias a todas las personas del laboratorio de ingeniería ambiental por su ayuda y por
generar el mejor ambiente de trabajo.
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ANEXO 1
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ANEXO 2
1. Objetivos
Detallar los pasos necesarios para realizar la prueba de difusión por disco.
Resaltar las variables que deben ser controladas en la prueba.
Interpretar los diámetros de la zona de inhibición, siguiendo las recomendaciones del
CLSI.
2. Diluciones seriadas
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3. Aislamiento
Para el método de difusión de disco es necesario que las cepas se encuentren aisladas.
1. Tome una porción del cultivo con el asa, haga un masivo (esparcir) en una parte de la
caja de Petri nueva.
2. Esterilice el asa en el mechero y enfríela insertándola en el agar al borde de la caja.
3. Esparza el cultivo dos veces, como se muestra en la ilustración 2, esterilizando el asa
cada una de las veces.
4. Haga un espiral en el centro.
Para lograr conservar los cultivos, se recomienda envolver las cajas de petri en papel wrap
(pelicula trasparente auto adherida), introducirlas en bolsas y guardarlas en la nevera. Es
importante realizar pases constantes a un nuevo medio con el fin de evitar la muerte del
cultivo.
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Preparación
1. Suspender las colonias en solución salina al 0,85% y agitar el tubo hasta que esté bien
mezclada. Se recomienda suspender poco a poco las colonias mientras se compara con el
estándar.
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2. Hacer el ajuste del inoculo a una turbidez equivalente al estándar de 0.5 de McFarland.
3. Comparar la turbidez del inoculo y el estándar ubicando los tubos frente a un papel
blanco o una tarjeta de líneas blancas y negras.
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Los sensidiscos deben ser almacenados en la nevera donde se encuentran los reactivos del
laboratorio y deben estar forrados con plástico. En el momento de su uso, es importante
retirarlos de la nevera aproximadamente con una hora de anterioridad, así se minimiza la
condensación.
Se invierten las placas y se incuban a una temperatura de 35°C a 37°C, por 18 a 24 horas.
Se recomienda hacer duplicados de una misma colonia, con el fin de tener mejores
resultados; así la colonia estaría expuesta dos veces a un mismo antibiótico y se esperaría
que los resultados sean los mismos.
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La lectura se debe realizar justo después de transcurridas las horas de incubación. Para esto
se mide con una regla o calibrador el diámetro de la zona o el halo de inhibición (zona en la
cual no se presenta crecimiento alrededor del disco). Se recomienda realizar este
procedimiento sobre una superficie de color negro, para facilitar la visión.
Según el método de la NCCLS, los resultados del diámetro del halo de inhibición son
informados como sensibles, intermedios y resistentes. Esta interpretación proviene de las
tablas 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H ó 2I de las normas M2 – A7 del NCCLS de Enero de
2001, las cuales relacionan la bacteria, el antibiótico y el diámetro, para hallar su
interpretación (Instituto nacional de enfermedades infecciosasde Argentina, 2001).
6. Bacterias resistentes
Las cepas identificadas como resistentes deben ser aisladas y sembradas en el medio
Mueller-Hinton. Si se presenta una morfología distinta en una misma caja de petri, es
necesario aislarlas y realizar nuevamente la prueba de sensibilidad.
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7. Variables de la prueba
Se presentan a continuación las variables de la prueba, las cuales deberán ser controladas en
el momento de realizar el procedimiento.
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