GUIA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO, Código de documento:

TALLER O CAMPO DCVI-GUI-V1-2020-010

CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☐ Ing. Biotecnología

DEPARTAMENTO:
PERIODO
ASIGNATURA: BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL
LECTIVO:
SII OCT 22- MAR 23 NIVEL: 7

DOCENTE: ING. CHRISTIAN CAMACHO NRC: 9583 PRÁCTICA N°: 1

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA: LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL Y ALIMENTARIA

TEMA DE LA
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PROCEDENTES DE SISTEMAS AMBIENTALES CONTAMINADOS.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:

Las bacterias son organismos procariotas unicelulares, que se encuentran en casi todas las partes de la Tierra (NIH, 2022). Estos organismos crecen en la
superficie de los medios de cultivo para producir colonias. Las distintas bacterias producen colonias con diferentes características, lo que permite una identificación
presuntiva temprana y una fácil identificación de los cultivos mixtos. Para ello, se utiliza como gelificante el agar al que se le añade una variedad de nutrientes (por
ejemplo, sangre, peptona y azúcares) y otros factores (por ejemplo, tampones, sales e indicadores).

Algunos medios de cultivo no son selectivos (por ejemplo, el agar sangre o el agar nutritivo) y en ellos crece una gran variedad de bacterias, los medios pueden
hacerse aún más selectivos mediante la adición de antibióticos u otras sustancias inhibidoras, y los sofisticados sistemas indicadores pueden permitir la fácil
detección de bacterias definidas a partir de poblaciones mixtas (Lagier et al. 2015).

Las bacterias juegan un papel muy importante en los suelos ya que producen enzimas que liberan a sus alrededores y descomponen macromoléculas como la
celulosa, proteínas, almidones entre otros, aportando a la eliminación de contaminantes en el suelo y siendo capaces de degradar hidrocarburos.
El término “contaminación del suelo” se refiere a la presencia en el suelo de un químico o una sustancia fuera de sitio y/o presente en una concentración más alta
de lo normal que tiene efectos adversos sobre cualquier organismo al que no está destinado. (FAO y GTIS. 2015). También las bacterias aportan a la degradación
de contaminantes en el agua, una agua contaminada es aquella cuya composición ha sido modificada de modo que no reúne las condiciones de su estado natural
o para su uso, debido a la presencia de componentes químicos o de otra naturaleza. El deterioro tanto del agua como el suelo se han convertido en motivo de
preocupación a nivel mundial debido a la expansión de la actividad industrial y agrícola (ONU, 2014)..

OBJETIVOS:

● Identificar microorganismos presentes en suelos y aguas contaminadas.

EQUIPOS: MATERIALES E INSUMOS:

● Espátula
● Pipetas de 10 ml
● Vidrio reloj o aluminio
● Autoclave
● Cajas de Petri
● Cámara de flujo laminar
● Juegos de micropipetas
● Balanza analítica
● Asa de siembra
● Agitador magnético
● Mechero
● Planchas de calentamiento
● Portaobjetos
● Incubadora
● Pipetas pasteur
● Refrigerador
● Papel filtro
● Microscopios
● Cajas Petri bifásicas de 90 x 15 mm
REACTIVOS: MUESTRAS / OTROS:
● Agua destilada
● Agar bacteriológico
● Extracto de levadura
● Agua peptona estéril
● Alcohol al 70%
● Agua destilada
● Peptona de caseína
● Lodo (de una PTAR)
● Dextrosa
● 1 kg de Suelo contaminado (con pilas, aceite usado, petróleo, etc).
● Fosfato de potasio
● 1 L de agua contaminada
● Sulfato de magnesio
● Sulfato de manganeso monohidratado
● Sulfato de hierro II heptahidratado
● Cloruro de calcio
● Lugol
● Safranina
● Aceite de inmersión
● Cristal violeta
● Reactivo Kovacs

Código de proceso: FRM 6.2 Rev. UPDI: 2020-jul-14

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● Suero Fisiológico 58
● Cristal violeta

PRECAUCIONES / INSTRUCCIONES:

● Se debe utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio, mandil y zapatos cerrados.
● Evitar el uso de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares, etc.). y cabello recogido.
● Se debe utilizar guantes y mascarilla.
● Las mesas de trabajo deben estar limpias.
● Cuidado con los bordes y puntas cortantes de tubos u objetos de vidrio. Alisarlos al fuego. Mantenerlos siempre lejos de los ojos y de la boca.
● El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes, será conveniente envolverlo en papel y ubicarlo en cajas resistentes.

PROCEDIMIENTO / ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

Se verifica que el material de cristalería esté limpio y sin daños; colocar las cajas de Petri, tubos de ensayo, etc; envolver adecuadamente y sellar los materiales.

Aislamiento
Tomar la muestra representativa del suelo o agua contaminada.
Identificar el contaminante que se va a utilizar en la práctica.

Medio de cultivo:

1. Agar Método Estándar (STD): Medio rico en nutrientes recupera la mayor cantidad de colonias bacterianas posibles del suelo o agua.

Tabla 1. Composición Agar para métodos estándar

Compuesto Cantidad
Extracto de Levadura 2,5 g/L
Peptona de Caseína 5,0 g/L
Dextrosa 1,0 g/L
Agar Bacteriológico 15,0 g/L
pH 7,0 ±0,2

2. Medio de Fosfatos, amonio y sales (PAS): Medio líquido usado para aislar bacterias que degradan contaminantes.

Añadir Bacto Agar al 2% como agente solidificante

Tabla 2. Composición del Medio mínimo

(Fosfatos y amonio) K2HPO4, 56,8;

PA (g/L) KH2PO4, 22,0;
NH4Cl, 27,7
Sales (g/L) MgSO4,19,5;
MnSO4*H20, 5,0;
FeSO4*7H2O, 1,0;
CaCl2, 0,3.
Las sales deben ser
acidificadas a un PH de
2,5 con HCl
Extracto de levadura 5% (p/v)

3. Mm + contaminante puro: Constituido por elementos del medio PAS (Tabla 2) sin adicionar extracto de levadura, el cual le provee como fuente de
carbono. Al suprimirse la levadura sea reemplazada por el contaminante objetivo en estado puro, para garantizar su consumo.

4. Mm: Para la siembra, utilizar placas con Mm para comparar el crecimiento de estas placas con las placas de Mm + Contaminante, y analizar el
contaminante objetivo puro en el crecimiento bacteriano.

Recuento en placas de bacterias

Escriba su nombre en la parte posterior de la placa junto con el lugar de donde obtuvo la muestra, la fecha de inoculación y el medio de cultivo empleado.

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Preparación del medio de cultivo

1. Preparación de 120 mL de agua de peptona: Disolver 15 g de Agua de peptona en 1000mL de agua destilada.
2. Preparación de 250 mL de Agar para métodos estándar: Disolver 23.5 g de Agar en 1000 mL de agua destilada.
3. Extender en cada caja el medio de cultivo.
4. Colocar 9mL de agua de peptona en cada tubo de ensayo etiquetado y esterilizarlos a 121°C, durante 15 minutos.
5. Se esterilizó el contaminante a 121°C, durante 15 minutos.
6. Disolver 10 g de suelo en 90 mL de agua de peptona y agitar suavemente.
7. Realizar diluciones de -1,-2,-3 y -4, en los tubos de ensayo y dejar reposar por 15 minutos.
8. Tomar 25µL de cada dilución y sembrar por extensión en las cajas Petri preparadas con los medios y etiquetados con cada dilución.
9. Realizar una siembra por duplicado de cada dilución.
10. Incubar las placas por 24 horas a 30 °C.
11. Pasado este periodo, realizar el recuento de colonias de cada placa para determinar la cantidad de microorganismos iniciales en el suelo o agua.

Reportar el resultado con la siguiente fórmula

Dónde,
UFC/g: Unidades Formadoras de Colonia por gramo de inóculo.
NC: Número de colonias por caja.
Se contaron las colonias mediante observación directa y si el NC >300, entonces

A: Área de la caja Petri en cm2

𝑿̅: Para obtener este valor, se dividió la caja Petri en cuadros de 1cm x 1cm, se contaron las colonias de al menos cinco cuadros representativos y se obtuvo el
promedio de microorganismos presentes.
n: Número de cuadros seleccionados.
F: Factor de dilución
V: Volumen de la alícuota
P: Peso del suelo en gramos (g)

A. Aislamiento de colonias de diferente morfología

Realizar el aislamiento en placas con tres medios: STD, PAS y Mm con cada uno de los contaminantes, extendido en toda la superficie de la placa

Procedimiento
1. Diferenciar visualmente las colonias de las placas sembradas, según su tamaño, forma y color y enumerar cada colonia.
2. Preparar las placas con medio STD, PAS y Mm.
3. Extender el contaminante en cada placa con los medios correspondientes, con el fin de convertir a las placas en medios selectivos.
4. Dividir cada placa en cuadrados de 1cm x 1cm y se etiquetó cada partición con números arábigos.
5. En la cámara de flujo y con ayuda de un asa, tomar un inóculo de cada colonia diferenciada y colocar en un cuadro con su número correspondiente.
6. El procedimiento se debe realizar en las tres placas con medios diferentes, el inóculo se debe picar primero en la placa de Mm, después en la placa de
PAS (sin que el asa toque otra vez la colonia original) y por último en la placa de STD.
7. Incubar las placas por 24 horas a 30 °C.
8. Registrar el crecimiento de las colonias por tres días.

Estabilización de las colonias:

1. Preparar 2 cajas con medio STD y una placa con medio PAS y Mm.
2. Extender el contaminante en todas las placas.
3. Se dividieron las cajas Petri en cuadrados de 1cm x 1cm y se etiquetaron las particiones con números arábigos.
4. En la cámara de flujo, se procede a tomar una pequeña muestra de la colonia y sembrarla en la cuadrícula correspondiente. (Primero en el medio STD,
después en el medio PAS y por último en el medio Mm)
5. Incubar por 24 horas a 30°C
6. Reportar el crecimiento de las colonias, a las 24 horas.
7. Repicar las colonias bacterianas tres veces hasta observar un crecimiento uniforme y constante.
8. Para asegurar el crecimiento de todas las colonias aisladas en el paso anterior, el repique Nº1 debe realizarse únicamente en medio STD.

Resistencia al contaminante:

1. Someter las colonias a la mitad de concentración permisible de contaminante dosificándolo en cada placa. Incubar a una temperatura de 30°C y
observar su crecimiento a las 24 horas.
2. Someter las colonias al doble de la contratación inicial de contaminante dosificado en volúmenes adecuados a una temperatura de 30°C y observar su
crecimiento a las 24 horas, repetir el proceso hasta llegar al doble del límite ambiental permisible.
3. Todos los resultados deben ser reportados

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Purificación

Usar la técnica de estriado para purificar cada una de las colonias que hasta ese momento se han adaptado adecuadamente y superado los ensayos a los que
se las sometieron.
Este paso es importante para la correcta caracterización de las colonias tanto macroscópica como microscópica y para identificar mediante pruebas bioquímicas.
La purificación de las colonias debe realizarse únicamente en medio STD y sin el contaminante para facilitar el proceso

1. Dividir las cajas Petri en dos cuadrantes.

2. Etiquetar cada cuadrante con los números correspondientes a las colonias bacterianas resistentes al contaminante.
3. En la cámara de flujo, con ayuda de un asa estéril proceder a tomar una muestra de cada colonia y se sembró en uno de los cuadrantes de la placa
mediante la técnica de estriado.
4. Incubar las placas por 24 horas y a 30°C. Al siguiente día, en la cámara de flujo se deberá tomar una colonia aislada de cada cuadrante
5. y colocar respectivamente en una placa con medio STD, dividida en cuadros de 1x1cm y enumerados de acuerdo con las colonias

B. Caracterización de las cepas puros

La evaluación de la caracterización macroscópica de las cepas se debe llevar a cabo mediante la observación visual del crecimiento de las cepas en una placa
de agar STD, debido a que la forma y aspecto de las colonias suelen ser constantes para cada género o especie, ayudando a su posterior identificación, para este
proceso se consideran parámetros como forma, elevación, margen, coloración y pigmentación del medio.

Procedimiento:

Con ayuda de una imagen de referencia caracterizar macroscópicamente las colonias, respondiendo a los parámetros de: forma, elevación, margen y coloración.

A. Tinción Gram de las cepas (Caracterización microscópica)

Colocar una gota de suero fisiológico en un portaobjetos.

Con el asa estéril tomar una pequeña muestra de una cepa purificada.
Colocar la muestra sobre la gota de suero fisiológico.
Proceder a frotar la muestra hasta mezclarla homogéneamente con la gota de suero.
Dejar secar a temperatura ambiente.
Fijar la muestra con calor, flameando sobre el mechero aproximadamente tres veces.
Proceder a realizar la tinción de la muestra siguiendo los pasos:
● Coloración con cristal violeta durante un minuto.
● Lavado inmediato con agua (no directamente sobre la muestra)
● Teñido con lugol durante un minuto.
● Lavado con agua inmediatamente.
● Decoloración con alcohol cetona por 30 segundos.
● Lavado con agua inmediatamente.
● Teñido con safranina durante un minuto.
● Lavado con agua inmediatamente.
● Eliminación del agua de la muestra.
● Colocar una gota de aceite de inmersión en la muestra.
● Observar la placa con un lente de 100x.

Identificación de la especie de las cepas

Prueba de oxidasa

Procedimiento:

1. Tomar con un palillo de madera estéril, una muestra de la bacteria.

2. Poner en contacto la muestra con la tira de papel.
3. Observar el cambio o no de coloración (a morado) en un lapso no mayor a 30 segundos.

Prueba de catalasa

Procedimiento:
Colocar un pequeño inóculo sobre una placa portaobjetos.
Añadir una gota de agua oxigenada.
Observar el desprendimiento o ausencia de gas inmediatamente.

RESULTADOS OBTENIDOS:
Los estudiantes están en la capacidad de identificar microorganismos obtenidos de sistemas ambientales contaminados.

Código de proceso: FRM 6.2 Rev. UPDI: 2020-jul-14

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CONCLUSIONES:
Se ha aportado al aprendizaje del estudiante mediante la identificación y búsqueda de soluciones viables para la solución de varios problemas de contaminación
tanto en suelos y aguas por varios contaminantes

RECOMENDACIONES:
Mantener asepsia durante la práctica.
Tener cuidado con la cámara de flujo laminar.
Estar al pendiente de los mecheros cuando se utilice dentro de la cámara de flujo

FIRMAS

F: ………………………………………. F: ………………………………………………. F: ……………………………………………………

Nombre: Ing. Christian Camacho Nombre: PhD. Renato Inca Nombre: PhD. Juan Neira
DOCENTE COORDINADOR ÁREA DE CONOCIMIENTO COORDINADOR/JEFE DE LABORATORIO

Código de proceso: FRM 6.2 Rev. UPDI: 2020-jul-14