Ejercicio de Extracción y Purificación

Rodriguez Cuasapaz María José

Carrera de Biotecnología, Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Santo Domingo

6964: Enzimología

En los efluentes de un frigorífico se descubrió una cepa bacteriana que produce y

secreta una enzima con actividad proteasa. La actividad de esta enzima puede determinarse
utilizando el medio del cultivo donde creció la bacteria como si fuera un extracto de enzima.
Si al medio de cultivo se le agrega BAPNA (N-benzoil-arginina-p-nitroanilida), se desarrolla
una coloración amarilla, típica de la p-nitroanilina (producto de la hidrólisis del BAPNA) que
puede medirse a 405 nm.

Dado que esta cepa bacteriana puede crecer a altas densidades en medios de cultivos
de muy bajo costo, se pensó que la bacteria podría utilizarse para la producción de esta
proteasa (una enzima de potencial interés industrial).

Para evaluar su potencial y caracterizar sus propiedades es primero necesario purificar

la enzima.

1. Proceso de Purificación de la Enzima con Actividad Proteasa

En el proceso de obtención de la proteína el primer paso es la ruptura del material

seguido de la obtención del extracto proteico, precipitación y concentración de la proteína y
finalmente un fraccionamiento cromatográfico. Los siguientes pasos se realizaron con base en
el tipo de proteína con métodos de separación secuenciales.

1.1. Obtención de Extracto Proteico

El medio de cultivo que contiene la cepa bacteriana después de su tiempo de

incubación se le realiza una centrifugación para separar el material celular del extracto que
contiene la enzima proteasa.

1.2. Precipitación Salina

Al extracto se le añade sulfato de amonio (NH4)2SO4 para precipitar las proteínas lo

que permite una separación diferencial debido a la especificidad de cada proteína, además de
no producir desnaturalización. Luego se somete la muestra a centrifugación para eliminar el
sobrenadante y obtener el precipitado que contiene la proteasa.
1.3. Fraccionamiento por Cromatografía de Columna

Se realiza cromatografía de columna para las muestras que contienen aminoácidos y

proteínas. Después de cada separación se realiza una prueba de espectrofotometría a cada
muestra obtenida para analizar la actividad enzimática de la proteasa.

1.3.1. Cromatografía de Intercambio Iónico. Las proteínas se separan según su

carga a un determinado pH, donde las proteínas con carga positiva se unen a la matriz
con carga negativa.

1.3.2. Cromatografía de Filtración en Gel. Las proteínas se separan según su

tamaño a través de una matriz de polímeros a la cual se le unen sólo las moléculas
pequeñas.

El mejor resultado de purificación de la proteasa se obtuvo con la cromatografía de

intercambio iónico con un factor de purificación de 222,22.

Tabla 1.

Datos del proceso de purificación

Datos:

- El coeficiente de extinción molar de la p-nitroanilina a λ 405 nm es ε = 10500 M‑1

cm‑1. Para simplificar los cálculos, se sugiere usar un coeficiente de extinción en unidades de
concentración µM, es decir ε = 0,0105 µM‑1 cm‑1.

- Una unidad de enzima (1 U) se define como la cantidad de enzima que permite la

formación de 1 µmol de producto en 1 minuto.