GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO, Código de documento:

TALLER O CAMPO DCVI-GUI-V1-2020-010

DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

PERÍODO
ASIGNATURA: NANOCIENCIA SII NOV 23- MAR24 NIVEL: 8
LECTIVO:
DOCENTE: CHRISTIAN CAMACHO NRC: 16704 PRÁCTICA N°: 2

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA: Laboratorio de Biotecnología Industrial y Alimentaria

TEMA DE LA PRÁCTICA: Aplicación de Nanopartículas de Plata obtenidas mediante síntesis verde

INTRODUCCIÓN:
La síntesis verde o síntesis por química verde de nanopartículas, es un método que emplea organismos vivos como bacterias, hongos o plantas
para la producción de este nanomaterial. Este enfoque es simple, de bajo costo y efectivo, además de tener el potencial de reemplazar a los
químicos tóxicos usados en los métodos de síntesis convencionales (Narayanaswamy, Athimoolam, Ayyavoo, 2015).

Este proceso implica la reducción de iones de plata (Ag+) presentes en una solución acuosa, mediante el poder reductor de los componentes del
organismo vivo, como enzimas, metabolitos, azucares reductores, flavonoides, terpenoides, entre otros. Generalmente se emplean plantas para
la síntesis de nanopartículas debido a la gran cantidad de fitoquímicos presentes en estas y su fácil adquisición (Singh, Hano, Nath, y Sharma,
2021).

Las nanopartículas de plata tienen diversas aplicaciones en campos como la medicina, la industria de la energía, la electrónica y la agricultura.
Este nanomaterial ha sido ampliamente estudiado y usado como agente bactericida, inhibiendo el crecimiento y proliferación de una amplia gama
de bacterias Gram-Positivas y Gram-Negativas. Suele incorporarse en recubrimientos y textiles, o en el tratamiento de agua. Se ha valorado el
uso de las AgNPs como un antibiótico de amplio especto en el campo médico, sin embargo, aún se requieren estudios sobre la interacción de las
nanopartículas con las células del cuerpo, así mismo se han realizado estudios en el área de la Biotecnología Vegetal, como un antibiótico que
evite la contaminación durante la micropropagación de especies (Parzymies, 2021; Singh, Hano, Nath, y Sharma, 2021).

OBJETIVOS:

● Sintetizar nanopartículas de plata a partir de extractos vegetales.

● Evaluar el poder antimicrobiano de las nanopartículas en un medio de cultivo.
● Evaluar las propiedades bactericidas de las nanopartículas en la micropropagación de explantes.

EQUIPOS: MATERIALES E INSUMOS:

● Vasos de precipitación 50 mL
● Pipetas de 10 mL
● Probetas de 50 mL
● Embudo Bünchner
● Balanza Analítica ● Matraz Erlenmeyer 100 mL
● Plancha de Calentamiento ● Espátula
● Agitador Magnético ● Papel Filtro
● Láser ● Frasco ámbar
● Cámara Digital ● Cajas Petri
● Autoclave ● Algodón
● Centrífuga ● Gasas
● Incubadora ● Tubos de Ensayo
● Micropipeta de 2 – 20 uL ● Frascos de Vidrio
● Micropipeta de 10 – 100 uL ● Mechero de alcohol
● Micropipeta de 100 – 1000 uL ● Equipo de disección (Pinzas y bisturí)
● Tubos de Microcentrífuga
● Puntas para Micropipeta (200 uL y 1000 uL)
● Papel aluminio

REACTIVOS:

Código de proceso: FRM 6.2 Rev. UPDI: 2020-jul-14

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● Nitrato de Plata 0.01 M (AgNO3)

● Hipoclorito de Sodio 0.5%
● Clorox 40% (v/v)
● Hipoclorito de Calcio 4%
● Agua Jabonosa 1%
● Agua destilada estéril
● Etanol 70 %
● Medio de Cultivo – Agar Nutriente
● Medio de Cultivo – MS (Murashige Skoog)

MUESTRAS:

● Hojas de Té verde
● Hojas de planta (Una diferente por grupo)
● 10 esquejes jóvenes de clavel (10 – 15 cm)
● 5 tallos de rosa

PRECAUCIONES / INSTRUCCIONES:

● Mantener el orden durante la práctica.

● Mantener el área de trabajo limpia y ordenada.
● No utilizar herramientas y equipos sin conocer su uso, funcionamiento y normas de seguridad específicas.
● Use guantes, mascarilla y bata de laboratorio en todo momento mientras esté en el laboratorio.
● Evitar el uso de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares, etc.), y recoger el cabello largo.
● Manipular correctamente el material de vidrio, y objetos con bordes y puntas cortantes.
● Descartar adecuadamente el material de vidrio roto. Envolver el material cortopunzante en papel y depositarlo en el respectivo
contenedor de descarte.

PROCEDIMIENTO / ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

Preparación de Nanopartículas a partir de Extractos de Planta/Hojas:

1. Pesar 5 g del material vegetal. Colocar en un mortero junto con 50 mL de agua destilada y moler usando un pistilo.
2. Filtrar el extracto en un frasco ámbar y almacenar.
3. Colocar 10 mL del extracto en un tubo de ensayo, añadir 2 mL de AgNO3 0.1M, y homogeneizar.
4. Con la ayuda de un puntero láser, visualizar el fenómeno de dispersión de luz en la solución en el tiempo cero, a los 15, 30, 45 y 60
minutos. Comparar el efecto de dispersión con la solución de AgNO3 y el extracto preparado.
5. Registrar los resultados obtenidos.

Preparación de Nanopartículas a partir del Extracto o Infusión de Té Verde:

1. Pesar 10 g de hojas de té verde y llevar a ebullición con agitación constante en 50 mL de agua destilada. Una vez que la solución
hierva, dejar enfriar y almacenar en un frasco ámbar.
2. Colocar 10 mL del extracto en un tubo de ensayo, añadir 2 mL de AgNO3 0.1M, y homogeneizar.
3. Con la ayuda de un puntero láser, visualizar el fenómeno de dispersión de luz en la solución en el tiempo cero, a los 15, 30, 45 y 60
minutos. Comparar el efecto de dispersión con la solución de AgNO3 y el extracto preparado.
4. Registrar los resultados obtenidos.

Evaluación de las Propiedades Bactericidas en un Medio de Cultivo:

1. Preparar 50 mL de medio de cultivo – Agar Nutriente y realizar la siembra con algún contaminante.
2. Centrifugar las AgNPs durante 20 min a 4000 rpm.
3. Descartar el sobrenadante y recuperar el pellet.
4. Lavar con acetona al 50% y dejar secar a 80C por una hora.
5. Resuspender en agua destilada estéril de modo que se obtenga una concentración final de 10 mg/mL. (Usar la Balanza Analítica para
estimar el peso de las nanopartículas obtenidas).
6. Preparar soluciones las siguientes soluciones:
a. 1mL de AgNPs 1 mg/mL

Código de proceso: FRM 6.2 Rev. UPDI: 2020-jul-14

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b. 1mL de AgNPs 2 mg/mL

c. 1mL de AgNPs 3 mg/mL
7. Embeber discos de papel filtro de 5mm de diámetro en las soluciones preparadas.
8. Colocar los discos en un medio previamente sembrado a modo de antibiograma.
9. Comparar los resultados con discos de antibiótico a la misma concentración que las soluciones y con un blanco.

Evaluación de las Propiedades Bactericidas en la Micropropagación de Explantes:

1. Clavel:
a. Preparar 100 mL de medio de cultivo – MS acidificarlo a un pH de 5,8 y dispensar 20 mL en frascos de vidrio estériles.
b. Añadir 1 mg, 2 mg, y 3 mg de AgNPs en el medio dispensado en los frascos y utilizar un frasco como blanco.
c. Eliminar las hojas superiores y parte del tallo para obtener ápices de aproximadamente 5 cm de longitud.
d. Lavar los esquejes en Povidin durante 2 minutos.
e. Enjuagar 3 veces con agua destilada eliminando los residuos del compuesto.
f. Sumergir los explantes en una solución de clorox 1% durante 1 minuto.
g. Enjuagar 3 veces con agua destilada eliminando los residuos del compuesto.
h. Lavar con ácido cítrico 0,05% por 1 minuto.
i. Enjuagar 3 veces con agua destilada eliminando los residuos del compuesto.
j. Extraer los meristemos (con 1-2 primordios de hoja) y sembrar en frascos de vidrio con el medio de cultivo MS.
k. Incubar los explantes a 24°C con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.
l. Observar los cambios cada 3 días.

2. Rosa:
a. Preparar 100 mL de medio de cultivo – MS acidificarlo a un pH de 5,8 y dispensar 20 mL en frascos de vidrio estériles.
b. Añadir 1 mg, 2 mg, y 3 mg de AgNPs en el medio dispensado en los frascos y utilizar un frasco como blanco.
c. Obtener secciones de tallo con yema de 3-4 cm de longitud.
d. Lavar los esquejes en Povidin durante 5 minutos.
e. Enjuagar 3 veces con agua destilada eliminando los residuos del compuesto.
f. Sumergir los explantes en una solución de clorox 1% durante 2 minutos.
g. Enjuagar 3 veces con agua destilada eliminando los residuos del compuesto.
h. Lavar con ácido cítrico 0,05% por 1 minuto.
i. Enjuagar 3 veces con agua destilada eliminando los residuos del compuesto.
j. Cortar los extremos del tallo dejando una sección de 1 cm de longitud con la yema al centro y sembrar un explante en cada
frasco de vidrio con el medio de cultivo MS.
k. Incubar los explantes a 24°C con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.
l. Observar los cambios cada 3 días.

RESULTADOS OBTENIDOS:

Los estudiantes están en la capacidad de preparar adecuadamente nanopartículas de plata de forma ecológica utilizando plantas con poder
antioxidante, además de explotar sus propiedades antimicrobianas en distintas aplicaciones.

CONCLUSIONES:

Se han preparado nanopartículas de plata mediante síntesis verde y se ha evaluado su poder antimicrobiano.

RECOMENDACIONES:

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Narayanaswamy, K., Athimoolam, R., y Ayyavoo, J. (2015). Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Leaf Extracts of Clitoria ternatea and
Solanum nigrum and Study of Its Antibacterial Effect against Common Nosocomial Pathogens. Journal of Nanoscience, 2015. Doi:
https://doi.org/10.1155/2015/928204

Parzymies, M. (2021). Nano-Silver Particles Reduce Contaminations in Tissue Culture but Decrease Regeneration Rate and Slows
Down Growth and Development of Aldrovanda vesiculosa Explants. Applied Sciences 11(8).
https://doi.org/10.3390/app11083653

Singh, R., Hano, C., Nath, G., y Sharma, B. (2021). Green Biosynthesis of Silver Nanoparticles Using Leaf Extract of Carissa carandas L. and
Their Antioxidant and Antimicrobial Activity against Human Pathogenic Bacteria. Biomolecules, 11(2), 299.

Código de proceso: FRM 6.2 Rev. UPDI: 2020-jul-14

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https://doi.org/10.3390/biom11020299

FIRMAS

Firmado electrónicamente por:

Firmado electrónicamente por:
CHRISTIAN ORLANDO Firmado electrónicamente por: JUAN ALEJANDRO
CAMACHO LOPEZ ANABELL DEL ROCIO NEIRA MOSQUERA
URBINA SALAZAR
F: ………………………………………. F: ………………………………………………. F: ……………………………………………
Nombre: Ing. Christian Camacho Nombre: PhD. Anabell Urbina Nombre: PhD. Juan Neira
DOCENTE COORDINADOR ÁREA DE CONOCIMIENTO COORDINADOR/JEFE DE LABORATORIO

Código de proceso: FRM 6.2 Rev. UPDI: 2020-jul-14