UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

MAESTRÍA BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOPROCESOS Y FERMENTACIONES

EXPERIMENTO 2
TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA

Prof. Deivis E. Luján Rhenals, Ph.D.

1. INTRODUCCIÓN:

El crecimiento microbiano se pude considerar como el incremento ordenado de

todos los constituyentes químicos de un organismo, lo cual, para los organismos
unicelulares, conduce a un aumento del número de individuos en la población.

Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una población

(ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento). El
crecimiento de las poblaciones celulares se puede subdividir en sistemas cerrados,
como el cultivo intermitente y en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por
lotes (Feed Batch) y el cultivo continuo.

Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de elección es el

recuento microscópico directo. Para células bacterianas y levaduras se usa
frecuentemente una cámara de Petroof-Hauser o una de Neubauer
(hemocitómetro). Es necesaria una ampliación de 100X a 400X para visualizar la
cámara de recuento y las células de Levaduras en suspensión, o una ampliación de
1000X para bacterias a causa de su pequeño tamaño. El recuento microscópico
directo tiene la ventaja de que permite observar directamente la morfología de las
células estudiadas; de esta forma, las morfologías aberrantes o atípicas podrían
indicar unas condiciones sub-óptimas de crecimiento o la presencia de un genotipo o
fenotipo alterados.

El método más usado para medir el crecimiento microbiano es secar volúmenes

conocidos de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se
trata de células que sedimentan rápidamente, como las levaduras, esto usualmente
implica centrifugación de muestras del cultivo en tubos de centrífuga prepesados.
Para células bacterianas difíciles de concentrar por centrifugación, las muestras de
cultivo se filtran a través de membranas hidrofílicas con un tamaño de poro de 0,2
m.
Otro método muy utilizado es el de determinación de biomasa por densidad óptica.
Se aprovecha la proporcionalidad de la densidad óptica con respecto a la masa
celular cuando no se tienen en el medio de fermentación otros sólidos en
suspensión. Este método se basa en la Ley de Beer y Lamberty; en este caso, se
asume que la absorción del rayo incidente es proporcional a la concentración de
células presentes.

2. OBJETIVO:

Desarrollar la habilidad y competencias para medición de la biomasa microbiana que

interviene en los bioprocesos a través de las técnicas de cámara de Neubauer, peso
seco, y densidad óptica.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:

a) Materiales
❖ Cámaras de Neubauer
❖ Microscopios
❖ Estufa
❖ Vortex
❖ Desecador
❖ Balanza analítica (6 cifras decimales)
❖ Espectrofotómetro
❖ Centrífuga
❖ Pipetas graduadas
❖ Pipetas automáticas
❖ Auxiliar de pipeteo
❖ Beakers
❖ Erlenmeyers
❖ Tubos para centrífuga
❖ Pinzas

b) Reactivos
❖ Cultivo de Levadura
❖ Agua destilada
❖ Solución salina isotónica estéril (0,85%)

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. Preparación del cultivo madre:

Disolver aproximadamente 0,5 gr. de levadura seca comercial (Saccharomyces

cerevisiae) en un erlenmeyer que contenga 200mL de agua destilada estéril.

4.2. Preparación de las soluciones problema:

En tubos de ensayo de 20 mL, previamente secos en estufa durante una noche a 95

ºC, preparar 6 diluciones de levadura a partir del cultivo madre, así:

TUBO 1 2 3 4 5 6
mL de agua 10 8 6 4 2 0
mL de cultivo 0 2 4 6 8 10

Cada dilución de levadura será medida con las siguientes técnicas:

4.3. Medición de la biomasa microbiana por conteo directo en cámara de

Neubauer:

Agitar en un vortex el cultivo de levadura. Tomar aproximadamente 0,5 mL de la

solución con un gotero desechable estéril. Depositar una alícuota de la solución en la
cámara de Neubauer (entre la superficie pulida de la cámara y el extremo del
cubreobjetos); la suspensión entrará en la cámara por capilaridad. Una cámara
adecuadamente llena contiene células sólo en el espacio contenido entre el cubre y
la cámara de recuento. No debería sobrar fluido que se deposite en los surcos.

Posteriormente se ubica la cámara en la platina de un microscopio compuesto y se

enfoca la cuadrícula con los objetivos de menos aumento (4X y después 40X) para
visualizar la cámara. Para contar las levaduras se utiliza el cuadro central (Ver
figura 1). El cuadro central está señalado con un círculo y contiene 25 cuadros, cada
uno rodeado por un borde de tres líneas. Cada uno de los 25 cuadros a su vez
contiene 16 cuadros pequeños. Se debe ajustar la intensidad de la luz de modo que
se hagan visibles las líneas y las células. Se deben contar las células que se
encuentren dentro de los 5 cuadros marcados con sombra en la figura 1 (los cuatro
de las esquinas y el del centro).

El cuadro central (marcado con el círculo) tiene un área de 1 mm2 y una

profundidad de 0.1 mm.

Tenga en cuenta los siguientes aspectos:

❖ Para aquellas células que estén tocando las líneas de los bordes, sólo cuente
aquellas que estén en dos de los cuatro bordes (superior e izquierdo); esto
evitará que se repita el conteo.
❖ Si cuenta más de 50 o menos de 20 células por cuadro, repita la toma de
muestra o cambie la dilución que esté usando.
❖ Al terminar, limpie la cámara con agua destilada estéril y séquela con papel
delicado después de cada lectura.
1 mm

1 mm

Figura 1. Cámara de Neubauer

4.4. Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica:

Tomar 1 mL de cada muestra problema, adicionarlo en tubos con tapa–rosca y

mezclarlos con 1 mL de agua destilada estéril. Agitar en vortex. Realizar la lectura
de absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm.

4.5. Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular:

Centrifugue los tubos, previamente pesados, que contienen las soluciones originales
de levadura (volumen restante conocido) a 4000 rpm durante 15 minutos. Con ayuda
de una pipeta evacúe cuidadosamente el sobrenadante. Posteriormente someta a
evaporación el agua restante en una estufa a 90ºC durante 20 horas. Pese los tubos
y vuelva a evaporar hasta que haya alcanzado un peso constante.

5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:

❖ Calcule y reporte la concentración de cada una de las diluciones problemas

(células/mL, Absorbancia y gr de célula/L).
❖ Elabore una gráfica de Nº Células/mL vs Absorbancia. Calcule el valor de R2
❖ Elabore una gráfica de gr de células/L vs Absorbancia. Calcule el valor de R2
❖ Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la biomasa
microbiana.
❖ Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las técnicas utilizadas en
este experimento.
❖ ¿Qué son los colorantes supravitales y para qué se usan?

6. REFERENCIAS:

Bayona, Martín. 1999. Microorganismos de Interés Industrial. Manual de

Laboratorio. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Dpto. de
Microbiología.
❖ Scragg, Alan. 2002. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en
procesos tecnológicos. México. D.F. Limusa. S.A.
❖ Wang, Nam Sun. 1999. Biochemical Engineering Laboratory Manual. University
of Maryland. Deparment of Chemical Engineering.