TECNICAS PARA MEDICION DE BIOMASA.

Universidad de Sucre. Facultad de Ingeniería. Programa de Ingeniería

Agroindustrial. Biotecnología.
Marcela González Santos
COD: 224-90122464031

Palabras Claves: Biomasa, Cámara de Neubauer, Levadura.

RESUMEN

Los métodos de recuento de células determinan directamente las células vivas y

muertas presentes en una muestra; esto puede lograse utilizando una cámara
especial para recuentos como la de Petroff-Hauser, la Cámara de Neubauer,
siendo estos los mas conocidos puesto existen otros tipos de métodos de
cuantificación como los son el UFC, membrana de filtración, Epifluorescencia
directa, Coulters, Técnica del numero mas probable (NMP). Para el desarrollo de
esta experiencia se realizo la medición de la biomasa microbiana en un cultivo
madre a partir de levadura, hechos por conteo directo en cámara de Neubauer,
tomando dos muestras de la misma a distintas concentraciones. Los resultados
arrojados en la aplicación de este método, indicaron que por cada 6.25x10 -2
milímetros cuadrado había un promedio de seis levaduras, lo cual indica que la
dilución preparada a partir de la muestra madre, cumplió con los aspectos
necesarios para un buen conteo de la biomasa, pero esta técnica no permite
distinguir las células vivas de las muertas, por consiguiente no es muy útil en un
recuento de poblaciones con altas o bajas concentraciones de microorganismos.

ABSTRACT:

Methods directly determine cell count live and dead cells present in a sample, this
can be achieved using a special camera to count as the Petroff-Hauser, the House
of Neubauer, these being the best known because there are other types of
methods quantification as are the UFC, membrane filtration, direct
Epifluorescence, Coulters, most probable number technique (MPN). For the
development of this experiment was conducted measuring the microbial biomass
from a stock culture of yeast, made by direct counting in Neubauer chamber, taking
two samples from the same at different concentrations. The results obtained in
applying this method, indicated that for every square 6.25x10-2 mm had an
average of six yeast, indicating that the dilution prepared from the mother sample,
met the necessary features for a good count biomass, but this technique can not
distinguish live cells from dead, therefore not very useful in populations with high
counts or low concentrations of micro-organisms.

INTRODUCCION
Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la
cantidad de células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos que
cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar
organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o
actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los
hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales.

Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra

de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan un
volumen conocido (por microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de
partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de
particulas en la suspensión de origen. Existen distintas cámaras para el recuento
directo de microorganismos, para microscopios de campo claro, entre estas
tenemos, la cámara de petroof-hauser y cámara de neubauer.

La primera cámara consiste en una lámina con una depresión en la cual un

volumen conocido se deposita sobre un área que esta divida en cuadros. La
cámara se llena con la muestra o con una dilución de esta, se cuenta el número de
bacterias en 20 cuadros y se calcula el promedio de las mismas por cuadro. Para
calcular el número de bacterias/ml se debe multiplicar el número de bacterias por
cuadro por 2 x 107 debido a que la cámara tiene un volumen de 0.02 mm 3 y un
total de 400 cuadros. La segunda es una cámara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fase. Se trata de un portaobjeto
con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda
de un diamante la cuadricula. Es un cuadrado de 3x3 mm con una separación
entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada
corresponde a 1 mm cuadrado.

Para el conteo de células por la cámara de neubauer se realiza cuadro por cuadro
y se hace un total. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas
que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que
definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo.
Las células que no tocan la segunda línea son contables, si la tocan o están
encima de ella no se incluyen. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta
de conteo. Las células que tiene una X son las que no se deben contar.

MATERIALES Y METODOS

ESTERILIZACION DEL LUGAR DE TRABAJO

Para la adecuada esterilización se era necesaria preparar una solución de

hipoclorito de Sodio (NaOCl), a partir de una concentración de 5.25% para un
volumen de 200 ml a una concentración de 125 ppm, con el fin de esterilizar el
área de trabajo.

5.25 ------------------ 100 gr

X-------------------- 1000 gr

X= 52.5 gr x 1000 mg/gr = 52500 mg/L= 52500 ppm

V1: Volumen de NaOCl

C1: Concentración de NaOCl
V2: Volumen de la solución a preparar
C2: Concentración de la solución a preparar

V1* C1 = V2* C2
V1 = 200ml x 125 ppm/ 52500 ppm = 0.47 ml

Estos 0.47 ml de NaOCl fueron los necesarios para obtener una solución de 200
ml a una concentración de 125 ppm. Para después de preparar esta limpiar el sitio
de trabajo, para crear las condiciones de esterilización necesarias en el área de
trabajo.

PREPARACION DE CULTIVO MADRE

Para la preparación del cultivo madre se pesaron aproximadamente 0.4 gr de

levadura seca comercial, adicionándola en un Erlenmeyer que contenía 200 ml de
agua destilada estéril, agitándola y tapándola con un vidrio de reloj, dejándola
reposar.

Cultivo madre
0.4 gr de levadura + 200 ml de agua
destilada

Para la preparación de las soluciones problemas, se determino en primera

instancia la concentración de la solución madre de la siguiente forma:

1. Convertir los gramos de levadura a miligramos

0.4 gr x 1000 mg/gr = 400mg

2. Para obtener la concentración en unidades de ppm se divide el peso de la

levadura entre el volumen de agua en litro, obteniendo asi la concentración
madre

Cm = 400 mg/0.2 L= 2000 ppm

El cultivo madre tenia una concentración de 2000ppm.

Posteriormente de este cultivo madre tomamos dos muestras que fueron

depositadas en dos tubos de ensayo las cuales tenían diferentes concentraciones
 C2 : 100 ppm
V2:10ml

C2 : 120 ppm
V2:10ml
2000ppm
En el primer tubo de ensayo preparamos la solución 10 ml a una concentración de
100 ppm, determinando el volumen que debe tomarse de la solución madre, con
los siguientes cálculos:

V1* C1 = V2* C2

V1: Volumen Madre

C1: Concentración Madre
V2: Volumen de la solución a preparar
C2: Concentración de la solución a preparar

V1 = 10ml x 100 ppm/ 2000 ppm ; V1= 0.5 ml

Tomando así el cultivo madre un volumen de 0.5ml de la solución y completamos

con agua destilada hasta un volumen de 10ml (volumen de agua: 9.5ml)

Para la preparación de la segunda solución se utilizo el mismo procedimiento,

teniendo en cuenta que su concentración fue de 120 ppm y su volumen de 10 ml,

V1* C1 = V2* C2

V1 = 10 ml x 120 ppm/ 2000 ppm ; V1= 0.6 ml

A este tubo también se le adiciono agua destilada (9.4 ml)

MEDICION DE LA BIOMASA MICROBIANA POR CONTEO DIRECTO EN

CAMARA DE NEUBAUER

Para preparar la solución problema se toma una alícuota de un volumen

aproximado de 0.1 ml y se deposito en la superficie pulida de la cámara de
neubauer, cubriéndola con un portaobjeto. Luego se llevo al microscopio y se hizo
un conteo directo teniendo en cuenta el campo de conteo de la misma.

18 16
 12

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RESULTADOS Y ANALISIS

De acuerdo al resultado obtenido se puede afirmar que la cámara de Neubauer

permite hacer un recuento superficial de las células de levadura, sin embargo no
permite distinguir las células viables de las no viables, como se muestro en la
anterior imagen.

Las levaduras se encuentran inactivas al no estar en contacto con el agua es decir

en estado de latencia, mientras que al estar en contacto con ella pasan a la fase
exponencial, ya que estas células han sufrido un proceso de liofilización, por lo
que hace necesario diluirlas permitiendo así el conteo de las mismas.

Teniendo en cuenta que en esta técnica, uno de los factores que afecta la
observación de las células de levadura es la correcta dilución de la muestra
empleada, se puede decir que si durante el conteo se observan aproximadamente
69 células la muestra se encuentra muy concentrada, mientas que si se observan
menos de 20 células, la muestra se encuentra muy diluida. Por tanto, de acuerdo a
los resultados obtenidos la muestra se encuentra en último rango.

CONCLUSION

El método de conteo por cámara de neubauer permite un análisis cuantitativo de

las células en estudio, por medio del depósito de la alícuota en la superficie de la
Cámara para ser observada en el microscopio. Este método permite contabilizar
las células sin distinción de viabilidad, lo cual se convierte en una desventaja para
la aplicación de este en el conteo de poblaciones con baja concentración.

Esta técnica está fundamentada en aspectos cuya buena aplicación permiten un

óptimo proceso de conteo, como son una dilución adecuada, la precisa
concentración de la muestra y los instrumentos indicados.

CUESTIONARIO

1. Consulte ventajas y desventajas de cada una de las tecnnicas utilizadas en el

experimento
Las ventajas de este tipo de recuentos son el equipo sencillo y escaso que se
requiere, la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la
morfología de los microorganismos presentes. Sus desventajas se dan porque no
se diferencian los microorganismos vivos de los muertos, es tedioso y no es útil
para recuento de poblaciones con baja concentración de bacterias.

2. ¿Que son los colorantes supravitales y para que se usan?

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos
vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden.

3. ¿cuales son los métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana?

 Método de placa (standard plate count),
 Turbidimetría
 Contaje por laminilla Petroff-Hauser
 Bioluminicencia.
Los métodos más utilizados son el método de placa y el de turbidometría.

BIBLIOGRAFIA

 CARPENTER. Microbiología. Editorial Interamericana. 1969.

 FRAZIER. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia. 1981

 SCAGG. Biotecnología para Ingenieros. Editorial Limusa. 1997

 Baumgarten, E.; Nagel, M.; Tischner, R. 1999. Reduction of the nitrogen

and carbon content in swine waste with algae and bacteria. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 52: 281-284
 Walker, J.M. Biología Molecular y biotecnología. Editorial Acribia. Zaragoza
España. 475 pg.