EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS.

Materiales:
- 2 tubos de ensayo de 12 x 75 mm.
- 2 portaobjetos y cubreobjetos.
- Aplicador de madera.
- Micropipetas de 5 a 50 uL y de 100 a 1000 Ul.
- Cámara de Neubauer.
- Balanza digital o probeta graduada de 5 Ml.

Equipo:
- Microscopio.

Reactivos:
- Semen.
 PROCEDIMIENTO.

1. EXAMEN MACROSCÓPICO.
El análisis del semen debe comenzarse con una simple inspección poco
después de la licuefacción, preferiblemente a los 30 min, pero no después de
una hora de la eyaculación, para evitar deshidratación o cambios en la
temperatura que afecten la calidad del semen.
1.1 LICUEFACCIÓN
Método:
1.- Inspeccionar la muestra dentro de los primeros minutos después de la
eyaculación realizando movimientos circulares para observar la licuefacción.
Recordar que inmediatamente después de la eyaculación el semen es una
masa coagulada semisólida. Dentro de unos minutos a temperatura
ambiente, por lo general comienza a licuarse. La licuefacción completa se
observa cuando el semen se vuelve más homogéneo y muy acuoso, y en la
fase final sólo pequeñas áreas de coagulación permanecen.
2.- Anotar el tiempo en que se llevó a cabo este proceso. La licuefacción
completa de la muestra, usualmente ocurre dentro de los 15 min a
temperatura ambiente, aunque rara vez puede tardar 60 min o más. Si no
ocurre la licuefacción completa a los 60 min esto debe ser reportado. Las
muestras de semen recogidas en casa o por condón, normalmente se licúan,
en su trayecto al laboratorio.
Nota: Es normal que las muestras de semen licuadas, contengan gránulos
gelatinosos (cuerpos gelatinosos) que no se licúan, lo cual no tiene
importancia clínica. Para muestras con licuefacción tardía y/o viscosidad
aumentada.
Ocasionalmente, las muestras de semen no se licúan, pudiendo dificultar el
análisis. En estos casos, es necesario un tratamiento adicional como mezcla
mecánica o digestión enzimática.
Mezcla mecánica: Pasar suavemente la muestra (6-10 veces) a través de una
aguja calibre 18 (diámetro interno 0,84 mm) o 19 (diámetro interno de 0,69
mm). Utilizar una jeringa de 3 ml.
1.2 VISCOSIDAD
Método:
1.- Después de la licuefacción. Estimar la viscosidad aspirando suavemente
con una pipeta de plástico desechable de gran calibre (aproximadamente 1.5
mm de diámetro), permitiendo que el semen caiga por gravedad y se observe
la longitud de cualquier filamento. Una muestra normal sale de la pipeta en
pequeñas gotas discretas.
2.- Observar el filamento que se forma después de que la gota caiga. Si la
viscosidad esta aumentada, la gota forma un filamento de más de 2 cm de
largo. Alternativamente, la viscosidad puede ser evaluada introduciendo una
varilla de vidrio.
1.3 ASPECTO
1. anotar el aspecto de la muestra siguiendo la siguiente lista de opciones:

1.4 VOLUMEN
Medir el volumen por diferencia de pesadas:
1. Recoger la muestra en un recipiente, pre-pesado, limpio y desechable.
2. Pesar el recipiente con la muestra.
3. Calcular el volumen a partir de la diferencia de pesos, suponiendo que la
densidad del semen es 1 g/ml. La densidad del semen varía entre 1.043 y
1.102 g/ml.
NOTA: Se puede realizar de igual forma usando una probeta graduada de 5
mL.
 1.5 pH
Para las muestras, se debe utilizar el papel pH en el rango de 6.0 a 10.0
(precisión de una décima)
1. Mezclar bien la muestra de semen.
2. Aplique una gota de semen uniformemente en el papel de pH.
3. Espere a que el color de la zona impregnada sea uniforme (menos de 30 s).
4. Comparar el color con la tira de calibración para leer el pH.
5. Anote sus resultados
2. ANÁLISIS MICROSCÓPICO
El examen microscópico inicial implica una exploración de la preparación, con
una magnificación de 100x (objetivo de 10x con ocular de 10x). Esto
proporciona una visión general de la muestra:
- Formación de filamentos de moco.
- Aglutinación de espermatozoides.
- Presencia de otros elementos celulares, por ejemplo, células epiteliales,
células redondas (leucocitos y células germinales inmaduras) y cabezas o
colas aisladas de espermatozoides.
A continuación, la preparación, debe observarse con aumento de 200x o
400x (objetivo de 20x o 40x con ocular de 10x). Esto permite:
- Evaluación de la movilidad espermática.
- Determinación de la dilución necesaria para una evaluación exacta del
número de espermatozoides.
2.1 ELABORACIÓN DE LA PREPARACIÓN HÚMEDA
Mezclar la muestra, tomar inmediatamente una alícuota de 10 μL de manera
que no dé tiempo a que los espermatozoides sedimenten, y colocarla en un
portaobjeto limpio y cubrirla con un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm,
evitando la formación de burbujas de aire. La preparación debe examinarse
rápidamente.
2.2 AGLUTINACIÓN DE ESPERMATOZOIDES
Observar la preparación húmeda con el objetivo de 10x. Debe reportarse
cualquier espermatozoide móvil que se pega el uno al otro por sus cabezas,
colas o piezas intermedias. Se debe registrar el tipo principal de aglutinación
Grado 1: aislado (menos de 10 espermatozoides aglutinados, muchos
espermatozoides sueltos).
Grado 2: moderado (10-50 espermatozoides aglutinados, espermatozoides
sueltos).
Grado 3: abundante (más de 50 espermatozoides aglutinados, algunos
espermatozoides sueltos).
Grado 4: denso (todos los espermatozoides están aglutinados y las
aglutinaciones están interconectadas).
La presencia de aglutinación no es evidencia suficiente para deducir una
causa inmunológica de infertilidad, sin embargo, es sugestivo de la presencia
de anticuerpos anti espermatozoides, por lo que se requiere de exámenes
adicionales.
La aglutinación severa puede afectar la evaluación de la movilidad y
concentración espermática.
2.3 DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE ESPERMATOZOIDES
1. Examinar con objetivo 40x una preparación bien mezclada de semen
licuado sin diluir, entre cubreobjetos y portaobjetos, para determinar la
dilución apropiada y cámara adecuada a usar. Se puede utilizar la misma
preparación elaborada para la evaluación de la aglutinación: 15
espermatozoides por campo dilución 1:5; 15-40 espermatozoides, dilución
1:10; 40-200 espermatozoides, dilución 1:20; 200 espermatozoides, dilución
1:50 (vea el siguiente cuadro).
2. Mezcla la muestra y preparar las diluciones con el diluyente. Limpie el
semen de la parte exterior de la punta de la pipeta, teniendo cuidado de no
tocar la abertura de la punta y dispensar el semen en la solución diluyente.
3. Mezclar nuevamente la muestra de semen y preparar un duplicado,
siguiendo los pasos descritos arriba.
4. Cargar el hemocitómetro transfiriendo aproximadamente 10 μL de la
muestra diluida y mezclada. Toque la punta de la pipeta con cuidado contra
el borde inferior de una de las cámaras en el surco en forma de V.
Presione el émbolo de la pipeta lentamente, permitiendo que la cámara se
llene por capilaridad. El cubreobjetos no debe moverse durante el llenado, y
la cámara no debe quedar demasiado llena (se puede ver que el cubreobjetos
se mueva) o poco llena (se nota cuando el aire ocupa algunas de las áreas de
la cámara). Permitir que los espermatozoides se asienten, dejándolo reposar
aproximadamente entre 3 a 5 minutos.
5. Mezclar la segunda dilución y tome de inmediato una alícuota de 10 μl.
Cargue la segunda cámara del hemocitómetro siguiendo los pasos anteriores.
6. Contar y comparar la cuenta de los duplicados, para determinar si son
aceptables. En caso afirmativo, proceder a los cálculos, en caso contrario,
preparar las dos diluciones nuevamente.
6. Calcular la concentración de espermatozoides por ml y el número total de
espermatozoides por eyaculado. Para poder determinar la concentración de
espermatozoides en la muestra de semen original en millones /mL, el
promedio de los espermatozoides se divide por el factor de conversión
adecuado, como se muestra en el cuadro de arriba. Por ejemplo, para un
contaje promedio de 230
en una dilución 1:20 y con diez cuadrados contados por cámara, el factor de
conversión es 2 y la concentración espermática es 115 x 106/mL.

2.3.1. PROCEDIMIENTO PARA EL CONTAJE DE LOS ESPERMATOZOIDES

El cuadrado central de la rejilla del hemocitómetro de Neubauer mejorado
contiene 25 cuadrados grandes, cada uno de los cuales contiene 16
cuadrados más pequeños. Para las muestras que contienen menos de 10
espermatozoides por cuadrado grande se debe contar toda a rejilla, es decir,
25 cuadrados; para los que contienen de 10 a 40 espermatozoides por
cuadrado pueden estudiarse 10 cuadrados, y para los que contienen más de
40 espermatozoides por cuadrado es suficiente analizar 5 cuadrados. Si un
espermatozoide está en la línea que divide a dos cuadrados adyacentes, solo
se debe contar si está en el lado superior o izquierdo del cuadrado que se
estudia.
RESULTADOS