UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA PESQUERA

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES

VIVAS E INERTES

DOCENTE: CÉSAR JULIO CÁCEDA QUIROZ

 INTRODUCCIÓN

• La limpieza de las áreas donde se manejan los alimentos deben

mantenerse limpios y desinfectados,

➢ Por tanto los operarios deben mantener el correcto saneamiento

de estas áreas.

• Es de importancia determinar la carga microbiana de las

superficies inertes (áreas donde se manipulan los alimentos),
como las superficies vivas (manos de los operarios).
 INTRODUCCIÓN

• Para el proceso de muestreo de las áreas a analizar y el protocolo

aplicado para el procesamiento de las muestras, se han
estandarizado de acuerdo a la ley ministerial N° 461-2007/MINSA.

• Estos procedimientos dan a conocer el protocolo de la toma de

muestras, dependiendo de la superficie a muestrear, para así
mantener la calidad sanitaria de las superficies.
 INTRODUCCIÓN

• Es de suma importancia no solo conocer el protocolo de muestreo

sino también el fundamento teórico de los medios empleados para
el análisis y aislamiento de muestras.

• Esto dará lugar al correcto diagnóstico, no solo en trabajos de

investigación (ausencia o presencia de los M’os), sino identificar
los M’os, con pruebas bioquímicas para su correcta identificación.
 OBJETIVOS

• Generales:

➢ Establecer los criterios microbiológicos destinados a evaluar las

condiciones higiénicas sanitarias de las superficies vivas e
inertes que entran en contacto con los alimentos y bebidas.
 OBJETIVOS

• Específicos:

➢ Determinar la carga microbiana en las superficies inertes

uniformes, mesa de trabajo para las muestras, utensilios, etc.

➢ Determinar la carga microbiana en las superficies vivas, manos

del operario.
 MARCO TEÓRICO

• Definiciones generales:

➢ Análisis microbiológico.-

✓ Proceso para determinar los microorganismos de una

superficie.
 MARCO TEÓRICO

• Definiciones generales:

➢ Calidad Sanitaria.

✓ Conjunto de requisitos que deben pasar los alimentos para el

consumo humano.
 MARCO TEÓRICO

• Definiciones generales:

➢ Criterios Microbiológicos.

✓ Criterios en el cual se acepta la sanidad de superficies para

determinar la presencia o ausencia de M’os en el área
muestreada.
 MARCO TEÓRICO

• Definiciones generales:

➢ Hisopo.

✓ Material con punta de algodón para usarlo en la recuperación

de microorganismos de una superficie.
 MARCO TEÓRICO

• Definiciones generales:

➢ Vigilancia sanitaria.

✓ Son actividades de observación que se dan por parte de la

autoridad sanitaria el cual supervisan las condiciones
sanitarias que deben tener las superficies.
MEDIOS DE CULTIVO
 MEDIOS DE CULTIVO

• Caldo Lauril Sulfato

➢ Fundamento.

✓ Rico en nutrientes en el cual se desarrollan bacterias

fermentadoras de lactosa, empleado para crecimiento de
Coliformes en aguas, alimentos.

✓ Las sales de fosfato le dan características de tampón al

medio para que no varíe el pH del medio.
 MEDIOS DE CULTIVO

• Caldo Lauril Sulfato:

➢ Fundamento.

✓ El Lauril sulfato de sodio es capaz de inhibir la flora

bacteriana acompañante.

✓ La fermentación de la lactosa por parte de las bacterias

produce gas (capturado por la campana de Durham) y ácido.
Fuente: BritaniaLab, S.F.
Tabla 01.
Composición del medio Lauril sulfato de sodio

Componente Cantidad (g/L)

Triptosa 20,0

Lactosa 5,0

Cloruro de sodio 5,0

Lauril sulfato de sodio 0,1

Fosfato di potásico 2,75

Fosfato mono potásico 2,75

pH final 6,8 ± 0,2

Fuente: BritaniaLab, S.F.
 MEDIOS DE CULTIVO

• Caldo Lauril sulfato:

➢ Interpretación del medio.

✓ Se observa como resultado positivo cuando hay desarrollo de

los microorganismos (turbidez del medio) y la producción de
gas, capturado por la campana de Durham.

Fuente: BritaniaLab, S.F.

Figura 01: Caldo Lauril sulfato (derecha gas positivo E. coli ATCC-25922)
Fuente: Manual Básico de Microbiología Cultimed I.C.T, S.L, S.F: .
 MEDIOS DE CULTIVO

• Control de Calidad del medio:

➢ Para determinar el control calidad del medio empleado en la

prueba se debe saber que cepas son capaces de crecer en el
caldo Lauril Sulfato y que cepas son inhibidas.

Fuente: BritaniaLab, S.F.

Tabla 02.
Control de calidad del medio Lauril sulfato de sodio

Microorganismo Crecimiento Producción de gas

Escherichia coli Satisfactorio Positivo

(ATCC 28922)

Escherichia coli Satisfactorio Positivo

(ATCC 8739)

Enterobacter cloacae (ATCC 13047) Satisfactorio Positivo

Salmonella tiphymurium (ATCC 14028) Satisfactorio Positivo

Staphylococcus aureus (ATCC 6538) Inhibido Inhibido

Medio sin inocular Sin cambios

Fuente: Britania Lab, S.F.

 MEDIOS DE CULTIVO

• Agar Rojo violeta y bilis (VRBA):

➢ Fundamento.

✓ Empleado para investigación presuntiva y conteo de

Coliformes, las sales biliares y el cristal violeta inhiben el
crecimiento de bacterias Gram positivas.

✓ El rojo neutro es el indicador del pH del medio.

 MEDIOS DE CULTIVO

• Agar Rojo violeta y bilis (VRBA):

➢ Fundamento.

✓ Las colonias de Coliformes en este medio crecen de color

rojo púrpura,

✓ Con un diámetro aproximado de 1 a 2 mm de diámetro

rodeadas de una zona rojiza (precipitado de bilis).
Fuente: BritaniaLab, S.F.
Tabla 03
Composición química del agar VRBA

Componente Cantidad (g/L)

Extracto de levadura 3,0

Peptona 7,0

Sales biliares 1,5

Lactosa 10,0

Cloruro de sodio 5,0

Rojo neutro 0,03

Cristal violeta 0,002

Agar 15,0

pH Final 7,4 ± 0,2

Fuente: BritaniaLab, S.F.
 MEDIOS DE CULTIVO

• Agar Rojo violeta y bilis (VRBA):

➢ Interpretación.

✓ Bacterias fermentadoras de lactosa: colonias de color rojo

púrpura, rodeadas por un halo de precipitación rojizo.

✓ Bacterias no fermentadoras de lactosa: colonias incoloras o

toman color del medio. Fuente: BritaniaLab, S.F.
 MEDIOS DE CULTIVO

Figura 02: Ejemplo de Agar VRBA con colonias de Coliformes

Fuente: Manual Básico de Microbiología Cultimed I.C.T, S.L, S.F:
 MEDIOS DE CULTIVO

• Agar Baird Parker:

➢ Fundamento.

✓ Crecimiento sólo de estafilococos, ya que el telurito de

potasio y el cloruro de litio inhiben la flora acompañante.

✓ Los estafilococos coagulasa (+) reducen el telurito a teluro,

observándose crecimiento de colonias color negro-grisáceo.
 MEDIOS DE CULTIVO

• Agar Baird Parker:

➢ Fundamento.

✓ La yema de huevo en el medio demuestra la capacidad de

producir la enzima lecitinasa por parte de estafilococos,
formando un halo claro alrededor de las colonias.

Fuente: Manual Básico de Microbiología Cultimed I.C.T, S.L, S.F:

.
Tabla 03
Composición química del agar Baird Parker

Componente Cantidad (g/L)

Peptona de caseína 10,0

Extracto de carne 5,0

Extracto de levadura 1,0

Cloruro de litio 5,0

Glicina 12,0

Piruvato de sodio 10,0

Agar 17,0

pH final 6,8 ± 0,2

Fuente: Manual Básico de Microbiología Cultimed I.C.T, S.L, S.F: .
 MEDIOS DE CULTIVO

Figura 03: Ejemplo de Agar Baird Parker con S. aureus ATCC-25923

Fuente: Manual Básico de Microbiología Cultimed I.C.T, S.L, S.F: .
 MEDIOS DE CULTIVO

• Caldo bilis al 2% y verde brillante:

➢ Fundamento.

✓ El bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que

inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram
negativas a excepción de Coliformes.

✓ El grupo Coliforme fermenta la lactosa con producción de

ácido y gas.
 OPERACIONES DE CAMPO

• Proceso para seleccionar muestras de superficies que

dependerán del tipo de superficie y del tipo de alimento que se
procesa en dicha área.
 OPERACIONES DE CAMPO

• En fabrica de alimentos y bebidas:

➢ Superficies inertes.

✓ Se seleccionan áreas donde tienen contacto directo con los

alimentos, el cual se caracteriza por no ser sometido a
temperaturas elevadas que disminuyan la carga microbiana.
 OPERACIONES DE CAMPO

• En fabrica de alimentos y bebidas:

➢ Superficies vivas.

✓ Se trata de tomar muestras de las manos de los operarios

que manipulan los alimentos.

✓ Pueden ser con guantes o sin ellos.

Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA
 OPERACIONES DE CAMPO

• En establecimientos de elaboración y expendio:

➢ Superficies inertes.

✓ Son aquellas superficies que tienen contacto con los

alimentos para el consumo humano.

✓ Superficies donde están en contacto:, utensilios, superficies

de corte de carnes, vajillas entre otros.
 OPERACIONES DE CAMPO

• En establecimientos de elaboración y expendio:

➢ Superficies vivas.

✓ Las manos de los manipuladores directos con los alimentos

que están destinados al consumo humano.

Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA

SELECCIÓN DEL MÉTODO DE MUESTREO
Tabla 05
Métodos de muestreo según el tipo de superficie

Método de muestreo Superficies a muestrear

• Se utiliza para superficies inertes regulares e irregulares, tales como

tabla de picar, bandejas, mesas de trabajo, utensilios, cuchillas de
Método del hisopo equipos, cortadora de embutidos, cortadora de pan de molde, fajas
transportadoras, tolvas, mezcladoras, pisos, paredes y otros.

Método de la esponja • El método de la esponja se utiliza preferentemente para muestrear

superficies de mayor área.

• Se utiliza para superficies vivas (manos) y para objetos pequeños o

Método del enjuague: para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas
de plástico, etc.

Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA

OPERACIONES ANALÍTICAS
Tabla 06
Tipos de microorganismos importantes, según la superficie a analizar

Superficies vivas Superficies inertes

Indicadores de Higiene Coliformes Coliformes

Patógeno (*) Staphylococcus aureus

Salmonella sp
Salmonella sp

(*) Se podrán considerar otros patógenos según sea la superficie a analizar.

Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA

LÍMITES PERMISIBLES EN SUPERFICIES VIVAS
 Tabla 07
Carga microbiana mínima en superficies vivas

Ensayo Superficies vivas

Coliformes <100 ufc / manos (*)

Staphylococcus aureus <100 ufc / manos (*)

Salmonella sp. Ausencia / manos

(*) En las operaciones analíticas, estos valores son indicadores de ausencia y están en concordancia con los criterios
microbiológicos establecidos para alimentos de consumo directo.

Fuente: (RM N°363-2005/MINSA).

LÍMITES PERMISIBLES EN SUPERFICIES
INERTES
 Tabla 08
Carga microbiana mínima en superficies inertes

ENSAYO SUPERFICIES INERTES

Coliformes < 1 ufc / cm2 (*)

Salmonella sp. Ausencia / 100 cm 2

Fuente: (RM N°363-2005/MINSA).

(*) Ver "Procedimiento para el control microbiológico con aplicación del método del hisopo".
MATERIALES Y MÉTODOS
 MATERIALES

• Superficies vivas.

✓ Frascos con tapa hermética de boca ancha de 250 ml de

capacidad, con 100 ml de solución diluyente estéril (Agua
peptonada).

✓ Bolsas de polietileno de primer uso.

 MATERIALES

• Superficies vivas.

✓ Pinzas estériles.

✓ Guantes descartables de primer uso.

✓ Protector de cabello.
 MATERIALES

• Superficies vivas.

✓ Mascarillas descartables.

✓ Plumón marcador para vidrio.

✓ Caja térmica (en caso de llevar las muestras).

 MATERIALES

• Superficies vivas.

✓ Refrigerante (en caso de llevar las muestras y mantenerlas).

Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA

 MATERIALES

• Superficies inertes.

✓ Hisopos de algodón u otro material equivalente, de largo

aproximado de 12 cm.

✓ Tubo de ensayo con tapa hermética conteniendo 10 mL de

solución diluyente estéril (Agua peptonada).
 MATERIALES

• Superficies inertes.

✓ Plantilla estéril, con un área en el centro de 100 cm2 (10 cm x 10

cm) o alternativamente, plantilla estéril, con un área en el centro de
25 cm2 (5 x 5 cm).

✓ Gradillas

✓ Guantes descartables de primer uso.

✓ Protector de cabello.
 MATERIALES

• Superficies inertes.

✓ Mascarillas descartables.

✓ Plumón marcador para vidrio.

✓ Caja térmica.

✓ Refrigerante.
Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA
MÉTODOS
 MÉTODOS

• Método del Hisopo (superficies inertes):

➢ Consiste en pasar sobre la superficie a muestrear un hisopo

previamente humedecido con disolución diluyente (Agua
peptonada).

Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA

 MÉTODOS

• Método del enjuague (lavado de manos):

➢ Consiste en realizar un enjuague de las manos con una

solución diluyente (agua peptonada),

✓ Las cuales estarán introducidas en una bolsa de primer uso

Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA

 MÉTODOS

• Método de la esponja (Superficies inertes):

➢ Consiste en frotar con una esponja estéril, previamente

humedecida en una solución diluyente, el área determinada en
el muestreo.

Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA

PROCEDIMIENTO
 PROCEDIMIENTO

• Método del enjuague (lavado de manos):

➢ Se tiene un frasco de rosca y con capacidad de 250 ml con

agua peptonada estéril.

➢ Empleando una bolsa de poliuretano estéril, se hace un

enjuague de manos del operador recibiendo el agua de peptona
dentro de la bolsa estéril de poliuretano.
 PROCEDIMIENTO

• Método del enjuague (lavado de manos):

➢ El operario debe lavarse las manos, frotado de las manos

(uñas, dedos y las palmas de las manos).

➢ Este proceso debe durar un aproximado de 1 minuto, frotando

también la superficie interna de las bolsa de poliuretano.
 PROCEDIMIENTO

• Método del enjuague (lavado de manos):

➢ Cuidadosamente se regresa el agua peptonada del resultado

del enjuague de manos al frasco de tapa rosca estéril, siempre
manteniendo el área de esterilidad que ofrece el mechero.

➢ Empleando una pipeta estéril de 1ml se extrae 0,1 ml del agua

peptonada del enjuague de manos para verterlo sobre la placa
estéril con agar rojo violeta y bilis (VRBA).
Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA
 PROCEDIMIENTO

Figura 04: Homogenización de la muestra con ayuda del Asa de Drigalsky

Fuente: Propia
 PROCEDIMIENTO

• Método del Hisopo:

➢ Se coloca la plantilla (10 cm x 10 cm) sobre la superficie a

muestrear.

➢ Se humedece el hisopo en la solución diluyente y se presiona

ligeramente en la pared del tubo con un movimiento de rotación,
para quitar el exceso de solución.
 PROCEDIMIENTO

• Método del Hisopo:

➢ Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30°, se frota 4 veces la

superficie delimitada por la plantilla, cada una en dirección
opuesta a la anterior, de manera horizontal, vertical e inclinado.

➢ Se realizó el hisopado en toda la superficie.

 PROCEDIMIENTO

• Método del Hisopo:

➢ En el caso de utilizar la plantilla de 5 cm x 5 cm, repetir esta

operación 3 veces más, en lugares diferentes de la misma
superficie, para obtener 100 cm2.

➢ Colocar el hisopo en el tubo con la solución diluyente,

quebrando la parte del hisopo que estuvo en contacto con los
dedos del muestreador, la cual debe ser eliminada.
Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA
 PROCEDIMIENTO

Figura 05: Toma de Figura 06: Caldo Figura 07: Rotulado de las
muestras de la Lauril sulfato muestras a incubar
superficie a analizar Fuente: Propia Fuente: Propia
Fuente: Propia
 PROCEDIMIENTO

• Método de la esponja:

➢ Empleando una esponja estéril, con ayuda de unas pinzas

sacarlo de su envoltorio y humedecerlo con diluyente (agua
peptonada) proveniente del frasco.

➢ En áreas regulares frotar vigorosamente en área a muestrear

delimitado por el área de la plantilla (10 cm x 10 cm).
 PROCEDIMIENTO

• Método de la esponja:

➢ En áreas irregulares tratar de abarcar la mayor área posible de

los utensilios a muestrear.

➢ Una vez terminado, se coloca la esponja en el frasco con el

resto de diluyente (agua peptonada) siempre manteniendo el
área de esterilización que da el mechero.
Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA
 PROCEDIMIENTO

• Método de la esponja:

➢ Tomar 0,1 ml de la solución sobre las placas de agar Baird

Parker.

➢ Con la ayuda de la espátula de Drigalski homogenizar la

muestra e Incubar a 37°C por 24 horas o un máximo de 48
horas.
Fuente: Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA
CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS
 CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS

• Para las muestras obtenidas de superficies vivas e inertes:

➢ Se tiene que usar contenedores isotérmicos para mantener la

temperatura no mayor a los 10°C, poniendo un gel refrigerante
sobre la base de manera uniforme.

➢ Las muestras no deben exceder las 24 horas en los

contenedores o un máximo de 36 horas.
 CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS

• Para las muestras obtenidas de superficies vivas e inertes:

➢ En caso de encontrarse la muestra a temperatura mayor a 10°C

se invalidan las muestras.

(Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA).

 BIBLIOGRAFÍA

• BritaniaLab. (20 de Febrero de 2019). Acerca de Nosotros:

Laboratorios Britania. Obtenido de Laboratorios britania:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2
82c46acde4.pdf

• Mac Faddin, J. (2003). Pruebas Bioquimicas para la identificación

de bacterias de importancia clinica. Madrid: Panamericana.

• Menenses Taboada, V. H., & Silva James, M. I. (2015). Compendio

de normas sanitarias peruanas. Lima: Quellqay Publicaciones
EIRL.
 BIBLIOGRAFÍA

• S.A., L. B. (23 de Febrero de 2019). Acerca de nosotros:

BritaniaLab . Obtenido de BritaniaLab Web site:
http://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a28
19b9bf93d.pdf

• Resolución Ministerial N° 461-2007/MINSA. Lima - Perú

Gracias por su atención