PRCTICA NO. 8 Crecimiento Bacteriano.

Edgar Alejandro Rodrguez Amaya 126002

Universidad Autnoma de Ciudad Jurez, Instituto de ciencias Biomdica, Depto. De Qumica
Licenciatura en Qumica. Laboratorio de Microbiologa.
Resumen
Resumen: El crecimiento se evala haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de la poblacin en estudio.
En cada momento se evala cual es la poblacin en ese instante. Existen diversas formas de evaluar una poblacin
bacteriana. Para ello encontramos a: Conteo microscpico directo: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un
equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa, ya que consiste en contar con un microscopio la
cantidad de clulas presentes en un volumen determinado. Conteo de clulas viables: El mtodo se basa en la
consideracin que el crecimiento implica en el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias. Este
mtodo puede hacerse con medios slidos o lquidos. El mtodo ms frecuentemente empleado es el conteo en placas
(medios slidos) formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES
en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Conteo microscpico directo por el mtodo de Breed:
Un volumen conocido de la muestra (generalmente 0.01 ml) se extiende sobre un portaobjetos normal en una superficie
conocida. Se examina en un microscopio calibrado, donde se conoce el dimetro del campo microscpico. Medicin de la
densidad bacteriana Curva de crecimiento: Es una tcnica en la que se mide la masa de microorganismos en una
suspensin. Para ello se utiliza un espectrofotmetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una suspensin de
microorganismos, en comparacin con un blanco que es el medio esterilizado y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero
de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio y se mide en fase de latencia o de
retardo, fase exponencial, fase estacionaria, fase de muerte. Mtodo: Curva de crecimiento: Con el asa bacteriolgica
previamente esterilizada y trabajando en el rea de esterilizacin, se tom una muestra de la bacteria Escherichia coli y
se inocul 12 veces en 12 tubos respectivamente, los cuales se llevaron a incubar al curto estufa, pero con el pasar de
las horas, se fueron retirando uno a uno los tubos de ensayo y trasladados al cuarto fro. Este experimento comenz a
las 8:00 a.m y concluy a las 7:00 p.m. Tcnica de vaciado en placa: Se llevaron a cabo diluciones de la siguiente
manera 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10,000; 1:100,000; 1:100,000,000, se tomaron 10 L de la bacteria Klebsiella pnemoniae,.
De la ltima muestra preparada, se tomaron 100L y se agreg dicho volumen en una caja de Petri, ha dicha caja se
agreg agar nutritivo, llenando hasta media capacidad. Llevando a incubar ambas cajas de Petri por 24 hrs. Conteo en
cmara de Neubaver: De la solucin preparada previamente 1:1, 000,000, se tomaron 10 L, y ha dicha cmara se
agreg un pequea gota a un lado del vidrio protector, donde la gota se recorri por toda la cmara donde fue cubierta
toda el rea deseada a examinar bajo el microscopio, una vez que se enfoc y fue observada la cuadrcula. Se tom
como referencia las cuadrculas prximas Conteo por el mtodo de Breed: Sobre un portaobjetos, se traz un cuadro de
1 cm x 1 cm con ayuda de un plumn con punta de diamante. Una vez listo el cuadro, se tomaron 10 L de la solucin
1:1,000,000; de dicho volumen, se agreg una gota sobre el cuadro trazado anteriormete y se esparci. Se dej secar la
muestra, se fij con calor y se ti con azul de metileno por 1 min, se lav el exceso de colorante bajo el agua, se dej
secar la muestra y se observ al microscopio. ResultadosCurva de crecimiento: La curva no tuvo la estructura de la
tendencia especfica de ciclo de vida bacteriano, Esto debio a la mala organizacin del grupo. Para la tcnica de vaciado
en placa, se encontr una aproximacin total de 131, 890,632.6 culas vivas. Para la cmara de conteo de Neubaver, se
obtuvo un total de 36, 000, 000 clulas, ya sean vivas o muertas. En el conteo por el mtodo de Breed, obtuve un total de
983, 890,632.6 de culas vivas y muertas. Al observar la bacteria por el microscopio, se encontr una gran diferencia
tanto en el conteo de placa como en los resultados en base al mtodo de Breed y la cmara de Nuebaver, ambas
tcnicas presentan un alto margen de error, y esto es debido a que comparando con el vaciado en placa no existe una
relacin de las colonias vivas con el conteo al microscopio ya que al microscopio se cuentan clulas viables y no viables,
siendo esto, un desfase de resultados. En comparacin con lo explicado anteriormente, la tcnica de vaciado en placa
promueve mejores resultados, ya que sirve para el conteo de clulas viables, a las 24 hrs, las colonias estn en su auge,
disminuyendo de esta manera a las clulas no viables en mayor porcentaje, pero hay un problema con dicho mtodo, s
alguna(s) clula(s) no alcanza(n) a dividirse, formarn una sola colonia y llevando a cabo el conteo como nica dado que
no hay diferencia macroscpica. Por otro lado, dado al conteo de colonias, no se toma en cuenta el crecimiento
colonia/colonia, donde sta manera otorga resultados falsos positivos.
Los mtodos de conteo de bacterias son muy tiles al momento de trabajar, pero debido a su diseo otorgan un gran
margen de error en los resultados, comparndolo con alguna otra tcnica hay una gran varianza entre los datos.
Haciendo incapi que gracias a una curva de crecimiento, es de igual manera factible pero no tanto, ya que el
espectrofotmetro lee tanto a clulas viables y no viables, hace de igual manera la presencia de resultados falsos
positivos en base absorbancias (turbidez del medio), teniendo una gran importancia el mover los tubos de un cuarto al
otro, ya que esto es lo que definir la curva de crecimiento de una bacteria es especfico.. Para esto, una tcnica
especializada como es la de vaciado en placa, dado a que presenta clulas viables, es ms factible a partir de dicho
mtodo comenzar a trabajar y hacer conteos, as reduciendo nuestro porcentaje de error y el valor de los falsos positivos
en base a clculos.

Palabras clave: Crecimiento, conteo, medios de cultivo, crecimiento.

Introduccin
Mtodos de medicin del crecimiento
El crecimiento se evala haciendo mediciones sucesivas
en tiempos determinados de la poblacin en estudio. En
cada momento se evala cual es la poblacin en ese
instante. Existen diversas formas de evaluar una
poblacin bacteriana.
a. Conteo microscpico directo:
Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un
equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de
microbiologa, ya que consiste en contar con un
microscopio la cantidad de clulas presentes en un
volumen determinado. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cmaras de recuentos (cmara de Petroff
Hauser, cmara de Neubaver). Una de las mayores
ventajas del recuento microscpico es brindar
informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de
los objetos contados.
b. Conteo de clulas viables:
El mtodo se basa en la consideracin que el
crecimiento implica en el aumento de los
microorganismos capaces de formar colonias. Este
mtodo puede hacerse con medios slidos o lquidos. El
mtodo ms frecuentemente empleado es el conteo en
placas (medios slidos) formando colonias. Por lo tanto
se determinan por este mtodo slo las clulas
microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo
(nutrientes, atmsfera, temperatura).
Para ello se
siembra una cantidad conocida de la suspensin
bacteriana cuyo nmero se desea conocer. En un medio
slido cada bacteria se multiplicar formando una
colonia visible a simple vista que puede ser contada.
Como las colonias pueden originarse tanto de una clula
como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino:
UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (U.F.C), y
esto puede constituir una desventaja ya que si dos
bacterias no se separan darn una sola colonia,
subestimando de esta forma el nmero de
microorganismos en la suspensin. Adems, a los
efectos de que todas las clulas que queden en una
placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes,
y que los errores del mtodo sean menores, se
establece que las condiciones ptimas de conteo se dan
cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias. Algunas
bacterias son difciles de contar en medios slidos
(Nitritadores) y se requiere de conteos en medios
lquidos. Para ello se recurre a la tcnica de
determinacin del nmero ms probable (NMP) de
microorganismos. Se basa en la determinacin de la
presencia o ausencia de un determinado tipo de

microorganismo (en funcin de que crezcan o de que

produzcan determinada reaccin en el medio o no), en
diferentes cantidades de muestra. Para poder
determinar el NMP de microorganismo se debe diluir
hasta tener una densidad que sea menor a 1 clula por
cada mililitro de diluyente, llevando a cabo diluciones de
una muestra inicial de bacterias (10L de muestra) en
solucin salina al 85%, donde a partir de un dilucin
1:10, se ir diluyendo 10 veces en las siguientes
proporciones 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000 y
1:1,000,000 ( si las clulas no se distribuyen 1 en cada
ml se pueden obtener otros resultados: 2 positivos y 3
negativos, o 1 positivo y 4 negativos), donde en la ltima
dilucin cuando se lleva a cabo el agregado de la
solucin1:100,000 a la de 1:1,000,000, son retirados 10
L, permitiendo que el volumen sea el mismo en cada
uno de los tubos . Los resultados posibles son al azar.
La interpretacin de los resultados, se hace en base a
una distribucin estadstica, y en general se emplean
tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra
que se siembra en cada serie de tubos.
c) Conteo microscpico directo por el mtodo de Breed:
Un volumen conocido de la muestra (generalmente 0.01
ml) se extiende sobre un portaobjetos normal en una
superficie conocida. Se examina en un microscopio
calibrado, donde se conoce el dimetro del campo
microscpico. Se cuentan las clulas en diversos
campos. Se obtiene el valor medio de clulas por campo
y se multiplica por el nmero de campos microscpicos
comprendidos en la preparacin. El resultado
corresponde al nmero de clulas en el volumen
extendido (0.01 ml). Multiplicando este valor por 100 se
obtiene el nmero total de organismos por ml o por
gramo de muestra.
c. Medicin de la densidad bacteriana Curva de
crecimiento
Es una tcnica en la que se mide la masa de
microorganismos en una suspensin. Para ello se utiliza
un espectrofotmetro y se mide la cantidad de luz que
atraviesa en una suspensin de microorganismos, en
comparacin con un blanco que es el medio esterilizado
y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en
suspensin, tanto menor es el porcentaje de luz que
atraviesa el medio. Para relacionar la transmitancia con
la densidad bacteriana se requiere de hacer curvas
patrn de densidades conocidas. Esta medicin en un
fotocolormetro se basa en el hecho de que un cultivo de
bacterias acta como una suspensin coloidal que
intercepta la luz que pasa a travs de ella. Dentro de
ciertos lmites, la cantidad de luz que es absorbida es

directamente proporcional a la concentracin de clulas

Mientras ms alto sea el porcentaje de transmitancia,
ms bajo es el nmero de clulas en suspensin. El
aparato debe ser calibrado antes de cada lectura, con
un tubo del medio estril sin cultivo, para establecer el
100 % de transmitancia.
Es posible distinguir cuatro fases:
1) fase de latencia o de retardo
2) fase exponencial
3) fase estacionaria
4) fase de muerte
En la fase de latencia existe un aparente reposo en el
que las clulas sintetizan las enzimas necesarias para la
actividad metablica que deben llevar adelante. Cuando
se hacen mediciones del nmero de clulas en distintos
tiempos dentro de esta fase, el valor no cambia
sustancialmente. En cambio, interiormente las clulas
trabajan activamente adaptando el equipo enzimtico al
medio de cultivo. La bacteria se prepara para hacer uso
de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto
es la fase de adaptacin al medio, con aumento de la
masa celular pero no del nmero de clulas. La edad
del inculo va a influir en el tiempo de latencia en el
medio fresco debido a la acumulacin de materiales
txicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la
clula durante el crecimiento anterior. En general,
inculos viejos alargan la fase de latencia.
Pasado este perodo, el cultivo entra en la denominada
fase de crecimiento exponencial, donde la velocidad de
crecimiento es mxima. La velocidad de crecimiento
que alcanza un cultivo, depende del tipo de
microorganismo que se trate y diversos factores
ambientales como son la temperatura, el pH,
oxigenacin, etc.
La velocidad de crecimiento comenzar a disminuir
hasta hacerse nula cuando alcance la fase estacionaria,
ya que cambios en la composicin y concentracin de
nutrientes entre el cultivo del inculo y el medio fresco
pueden desencadenar el control y la regulacin de la
actividad enzimtica.
Esta fase se presenta por agotamiento del suministro de
algn nutriente esencial o por acumulacin de productos
metablicos que sean txicos. Tambin puede ser por la
disminucin de la oxigenacin o cambios en las
condiciones de pH del medio de cultivo (acidificacin o
alcalinizacin):
En esta fase se equilibran el nmero de clulas nuevas
con el nmero de clulas que mueren. Por ltimo, el
cultivo entra en la fase de muerte, en la que el nmero
de clulas que mueren se va haciendo mayor.

Fig 1.- Curva de crecimiento bacteriano en base a cuatro

fases: Latencia, Logartmica, Estacionaria y de Muerte.

Objetivo: Desarrollar algunas tcnicas comunes para

medir el crecimiento bacteriano en poblaciones, tanto en
clulas vivas, como en muertas, comprendiendo su
fundamento y aplicacin.

Mtodo
Curva de crecimiento
Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada y
trabajando en el rea de esterilizacin, se tom una
muestra de la bacteria Escherichia coli y se inocul 12
veces en 12 tubos respectivamente, los cuales se
llevaron a incubar al curto estufa, pero con el pasar de
las horas, se fueron retirando uno a uno los tubos de
ensayo y trasladados al cuarto fro. Este experimento
comenz a las 9:00 a.m y concluy a las 7:00 p.m.
Tcnica de vaciado en placa
Se llevaron a cabo diluciones de la siguiente manera
1:10;

1:100;

1:1000;

1:10,000;

1:100,000;

1:100,000,000, donde para el primer tubo (solucin

1:10) se tomaron 10L de la bacteria Klebsiella
pnemoniae, y se agreg a dicho tubo, se mezcl muy
bien la solucin y de dicha previa solucin de tomaron
10L y se agreg al siguiente tubo y as sucesivamente
hasta concluir con la solucin 1:1,000,000. De la ltima
muestra preparada, se tomaron 100L y se agreg
dicho volumen en una caja de Petri, ha dicha caja se
agreg agar nutritivo, llenando hasta media capacidad.
Pasado el llenado, se agit constantemente la mezcla
bacteria-agar hasta que el medio se solidificara. Esto
con la finalidad de que la muestra tomada se mezclara
equitativamente. Este proceso tambin se llev a cabo
de la misma manera, pero ahora con la mezcla en la

proporcin 1:100,000. Llevando a incubar ambas cajas

incubacin
9:00

(600 nm.)
0.70

Conteo en cmara de Neubaver.

10:00

0.49

De la solucin preparada previamente 1:1, 000,000, se

11:00

0.18

tomaron 10L, y ha dicha cmara se agreg un

12:00

0.61

pequea gota a un lado del vidrio protector, donde la

1:00

0.50

gota se recorri por toda la cmara donde fue cubierta

2:00

1.06

toda el rea deseada a examinar bajo el microscopio,

3:00

1.27

una vez que se enfoc y fue observada la cuadrcula. Se

4:00

1.15

tom como referencia las cuadrculas prximas

5:00

1.20

6:00

10

1.06

7:00

11

1.28

de Petri por 24 hrs.

Tabla 2.- Curva de crecimiento de la bacteria Escherichia coli.

Fig 2.- Cuadrcula presente en la cmara de Neubaver

Conteo por el mtodo de Breed.
Sobre un portaobjetos, se traz un cuadro de 1 cm x 1
cm con ayuda de un plumn con punta de diamante.
Una vez listo el cuadro, se tomaron 10 L de la
solucin 1:1,000,000; de dicho volumen, se agreg una
gota sobre el cuadro trazado anteriormete y se esparci.
Se dej secar la muestra, se fij con calor y se ti con
azul de metileno por 1 min, se lav el exceso de
colorante bajo el agua, se dej secar la muestra y se
observ al microscopio.
Resultados
Curva de crecimiento.

Tabla 1.- Absorbancia que present cada uno de los tubos en

funcin del tiempo que fueron trasladados del cuarto estufa al
cuarto fro.

Hora de

Tiempo/horas

Absorbancia

Tcnica de vaciado en placa

# De campos en 10 mm= campos/ rea de campo = 10/

0.0096962
= 1031.3319
Promedio x # campos en 10 mm
= 954 x 1031.3319
= 983,890.6326
# Clulas totales en 10 l= 983,890.6326 x 10 = 9,
Fig 1.- Crecimiento de Klebsiella penumonie en agar nutritivo,
con el uso de 10 L de la dilucin 1:1,000,000

839,906.326 clulas totales

9, 838,906.326 x 100 (para mililitro) = 983, 890,632.6
clulas totales vivas y muertas
Discusin
Al observar la bacteria por el microscopio, se encontr
una gran diferencia tanto en el conteo de placa como en
los resultados en base al mtodo de Breed y la cmara
de Nuebaver, ambas tcnicas presentan un alto margen
de error, y esto es debido a que comparando con el

Fig 2.- Crecimiento bacteriano de Klebsiella pneumoniae en

agar nutritivo a partir 10 L de la disolucin 1:1000,000.

Clculos:

vaciado en placa no existe una relacin de las colonias

vivas con el conteo al microscopio ya que al microscopio
se cuentan clulas viables y no viables, siendo esto, un
desfase de resultados. Dichas tcnicas tienen una gran

Klebsiella pneumoniae 1:1, 000,000

desventaja, como por ejemplo: para el mtodo de

1 cuadrante x 4 x un milln

Neubaver,

213 x 4 = 852 x 1, 000,000 = 852, 000,000 muertas

conocimiento de las lneas del retculo. Para que las

983, 890,632.6-100%

clulas, que estn encima o cerca de las lneas de

852, 000,000 x %

limitacin, siguiendo distintos patrones de conteo,

86 % muertas

incluyendo que no se cuenten dos veces o se olviden en

14 % vivas

el recuento, en s, siendo muy cauteloso con cada una

983, 890,632.6 852, 000,000 = 131, 890,632.6 clulas

de las bacterias, para ello hay que cumplir determinadas

vivas.

reglas, descritas a continuacin: se cuentan todas las

Conteo cmara de Neubaver

clulas que se estn dentro de una definida zona de

Conteo: 36 x disolucin de 1, 000,000= 36,000,000 de

medicin. Tambin se cuentan las clulas que tocan o

clulas, ya sean vivas o muertas.

estn encima de 2, contndolas como 1 sola bacteria. Y

el

recuento

requiere

de

un

exacto

por el contrario, el mtodo de Breed, se basa en un

Conteo por el mtodo de Breed

volumen conocido de la muestra (generalmente 0.01 ml

1mm/9campos=0.11111=Dimetro.

= 10 L), de lo cual se extiende sobre un portaobjetos

D= 0.11111

normal en una superficie conocida. Se examina en un

R= 0.11111/2 = 0.0555556

microscopio calibrado, donde se conoce el dimetro del

rea de Campo= (r)2

campo microscpico. Se cuentan las clulas en diversos

rea de campo= 3.1416 (0.0555556)2

campos. Dado dichas tcnicas y en relacin de

= 3.1416 (0.0030864)

proporciones, los datos oscilan es una disvarianza casi

= 0.0096962

del 50%, interpretando esto como resultados no

llegaban a un equilibrio trmico (relacin medio-

factibles. (Gonzlez, 2013)

bacteria), de lo cual, dentro de la clasificaciones de las

En comparacin con lo explicado anteriormente, la

bacterias encontramos a las sicrfilas, mesfilas,

tcnica de vaciado en placa promueve mejores

termfilas e hipertemfilas, lo cual su crecimiento es

resultados, ya que sirve para el conteo de clulas

dado a la temperatura. Y en base a esto, pudo haber

viables, a las 24 hrs, las colonias estn en su auge,

sido el repentino crecimiento, donde al principio slo se

disminuyendo de esta manera a las clulas no viables

divida la bacteria en funcin del alimento (crecimiento

en mayor porcentaje, pero hay un problema con dicho

con tendencia a una correcta curva) y como pas horas

mtodo, s alguna(s) clula(s) no alcanza(n) a dividirse,

expuesto a 37C, esto pudo haber proliferado el

formarn una sola colonia y llevando a cabo el conteo

crecimiento.

como nica dado que no hay diferencia macroscpica.

Conclusin

Por otro lado, dado al conteo de colonias, no se toma en

Los mtodos de conteo de bacterias son muy tiles al

cuenta el crecimiento colonia/colonia, donde sta

momento de trabajar, pero debido a su diseo otorgan

manera otorga resultados falsos positivos.

un

Como se observa en la tabla 1, en la curva de

comparndolo con alguna otra tcnica hay una gran

crecimiento, se observa un aumento constante hasta la

varianza entre los datos. Haciendo incapi que gracias a

8va lectura, demostrando un crecimiento correcto con

una curva de crecimiento, es de igual manera factible

tendencia a fase de latencia, exponencial y estacionaria,

pero no tanto, ya que el espectrofotmetro lee tanto a

pero en ese momento, de lo cual, la curva tuvo que

clulas viables y no viables, hace de igual manera la

haber adoptado una tendencia de decaimiento a partir

presencia de resultados falsos positivos en base

de dicha lectura, siendo la fase de muerte, pero como se

absorbancias (turbidez del medio), teniendo una gran

observa, hubo presencia de aumento, de lo cual existen

importancia el mover los tubos de un cuarto al otro, ya

varias posibilidades, y varias respuestas a dicho

que esto es lo que definir la curva de crecimiento de

problema, donde a grandes rasgos pudo haber sido que

una bacteria es especfico..

al momento en que tuvieron que haber sido removidos

especializada como es la de vaciado en placa, dado a

los tubos del cuarto estufa al cuarto fro, no se hizo al

que presenta clulas viables, es ms factible a partir de

tiempo exacto (tubos 9, 10, 11 y 12). Otros factores

dicho mtodo comenzar a trabajar y hacer conteos, as

segn el QBP. Alejandro Vargas, pudieron haber sido los

reduciendo nuestro porcentaje de error y el valor de los

nutrientes;

falsos positivos en base a clculos.

donde

muchos

microorganismos

son

gran

margen

de

error

en

los

resultados,

Para esto, una tcnica

capaces de utilizar los nutrientes y la energa que

Bibliografa

requieren para su desarrollo de manera ms rpida y

Brock, T. & M. Madigan. 1993. MICROBIOLOGA. 6ta

eficaz que otros proliferando de sta manera una rpida

Edicin. Prentice Hall

muerte. Nuestra bacteria dentro de la curva, no llev a

Hispanoamrica

cabo dicho proceso y an le quedaba demasiado

http://www.microbiologia.com.ar/fisiologia/crecimiento.ht

alimento. Otro factor pudo haber sido el pH: En general,

las

pH

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