RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS T. de la Rubia y J.

Martínez
OBJETIVOS El alumno aprenderá a: 1. Utilizar correctamente pipetas y micropipetas decimales seriadas de una suspensión de bacterias preparando diluciones

2. Determinar la concentración bacterias viables (entendidas como unidades vormadoras de colonias) en una muestra

Contenido: I INTRODUCCIÓN

II MÉTODOS III RESULTADOS IV AUTOEVALUACIÓN

Recuento directo de bacterias al microscopio Es una técnica para determinar o recontar el número total de organismos de una muestra: Se utilizan cámaras de recuento (Cámara de Petroff-Hauser) y visualización al microscopio. de la actividad del cultivo o métodos turbidimétricos) o por la determinación del número de células. Se puede determinar a su vez el tamaño de las células pero tampoco distingue entre viables.1.Recuento directo con contadores electrónicos . Encontrará información más completa sobre medidas del crecimiento de bacterias en los apuntes on line del Profesor D. de agua de bebida. E. de productos farmacéuticos o del medioambiente entre otros).I. Iañez 1. Se utiliza el contador Coulter recuenta el número de células suspendidas en un líquido. por filtración o por el recuento de viables en placa (Células capaces de dividirse sobre o dentro de un medio sólido. que generalmente es directamente proporcional al número de células. Es un método rápido del número total de células de una muestra pero no distingue entre viables o no viables. Principales métodos de El número de bacterias de una muestra puede recuento del determinarse directamente por recuento del número total número bacterias de células o indirectamente por la estimación del número en una muestra más probable. muertas o partículas.2. (métodos de determinación del peso. 1. a su paso por un orificio por donde fluye la corriente eléctrica. 1. también se refieren como unidades formadoras de colonias UFC). El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante métodos de medida de la masa total celular. se requiere conocer el número de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad. INTRODUCCIÓN En diversos estudios microbiológicos (como análisis de alimentos.

45 µm). En este método todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. la inoculación de la dilución en medio de cultivo sólido y la incubación durante 24-48 horas a la temperatura apropiada y en placa son métodos de estimación de bacterias viables en término de unidades formadoras de colonias (UFCs). El recuento del número de colonias formadas sobre el filtro determina el número total de bacterias en la muestra filtrada. caldo o solución salina.1. el filtro se coloca sobre un medio de cultivo sólido y se incuba. Es un método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.3. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. Es un método útil cuando el número de bacterias presentes en la muestra es muy bajo. Métodos de recuento de bacterias viables en placa En este método el recuento se realiza por filtración de un volumen de la muestra a través de un filtro de membrana de tamaño adecuado para retener a las bacterias (0. 2. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar.2. Una vez filtrada la muestra. Recuento en filtros de membrana 2. Consiste en añadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50ºC sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida.1. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Se utiliza con frecuencia para determinar el número de bacterias en agua. El número de unidades formadoras de colonias de una suspensión bacteriana puede determinarse mediante dos técnicas: 2. Generalmente se utiliza esta técnica para el recuento de bacterias aerobias. Estos métodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables presentes en una muestra. Implican la dilución seriada de la muestra en agua. Recuento en placa por siembra en profundidad.220.Recuento en placa por siembra en superficie .

10-6 .Material necesario • • • 2. 10-2. MÉTODOS RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS VIABLES MEDIANTE EL MÉTODO DE DILUCIÓN Y SIEMBRA EN PLACA • Cultivo de Escherichia coli de 24 horas en caldo de tripticasa soja (TSB) 6 placas de TSA 6 tubos de ensayo con 4.II. Marcar los 6 tubos de solución salina con las diluciones 10-1.1. 2.9% estériles.……. Técnica de recuento en placa por siembra en superficie. Obtención de diluciones seriadas del cultivo. Puntas de pipetas estériles de 1 ml • • acero • Placa con alcohol Pipeta automática de 1ml Espátula de Driglasky de 1.5 ml de solución salina 0.

Utilizando la pipeta de 1 ml con punta estéril. 10-6 (2 placas por dilución).5 ml.Siembra en placa Marcar las placas con las tres últimas diluciones 10-4. transferir 0.5 ml al siguiente tubo de dilución (dilución 10-2). transferir asépticamente 0. Comprobar que la superficie de las placas está bien seca.5 ml del cultivo de E. 10-5. Retirar la punta y echarla al contenedor. 2. Retirar la punta y echarla al contenedor. Mezclar la suspensión durante unos segundos con un vortex Con una nueva punta de pipeta estéril. . coli a un primer tubo de solución salina estéril de 4.2. Repetir el paso anterior hasta obtener la dilución 10-6. (dilución 10-1).

Usualmente una UFC se corresponde con una célula viable. Tomar una punta de pipeta estéril y transferir 0. RESULTADOS 2.1 ml de cada una de las tres últimas diluciones a placas de TSA Esterilizar la espátula de Driglasky impregnándola en alcohol. Cada colonia representa a una unidad formadora de colonia (UFC).3. III. . escurrir el exceso de alcohol y pasar por la llama del mechero. se observan las colonias bacterianas sobre la superficie del agar.1 ml.Recuento de las colonias Tras la incubación. Sembrar la dilución sobre la superficie de la placa rotando y esparciendo la muestra en todas las direcciones. Incubar las placas en posición invertida a 37ºC durante 24-48 horas.Cambiar el volumen de la pipeta a 0.

4.Seleccionar las placas de la dilución que haya producido un número de colonias comprendido entre 30-300 y contar el número de colonias presentes. Resultados 10-1 . 2. En el ejemplo: 125 colonias UFC/ml= 125 x10 x10 = 125 x 10 6 7 El resultado debe expresarse como UFC/ml para ello se multiplica el promedio del nº de colonias obtenido por el inverso de la dilución final de la muestra.

10-2 10-3 10-4 .

10-5 10-6 .

Si transferimos 0. Tras la incubación. 25 x 107 c. De un cultivo de Escherichia coli se hacen diluciones seriadas añadiendo 10 ml en 90 ml de solución salina estéril. 10-1 b. AUTOEVALUACIÓN: 1.IV.5 x 106 b. ¿Cuál es la dilución obtenida? a. ¿Cual es el número de bacterias por ml del siguiente cultivo? . los resultados del recuento de colonias fue el siguiente: Dilución 10-4 10-5 10-6 10-7 Promedio del Nº de colonias > 1000 660 250 3 ¿Cuál es el recuento de UFC/ml de la muestra? a.9 ml de solución salina estéril. 25 x 108 3. 10-2 c.1 ml de una muestra a 99.1 ml de cada dilución en placas de agar nutritivo que se incuban a 37ºC durante 24 horas. 2. 10-3 2. Se siembran 0.

480 x 10 5 b. 6.a.3 x 10 c. 63 x 10 8 6 Los números corresponden a volúmenes o a número de colonias crecidas en cada placa .

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